低共熔溶劑提取綠茶總黃酮及其抗氧化活性

倪雪華 王恒鵬

(1. 江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇 淮安 223001；2. 揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127)

綠茶中含有豐富的茶多酚、單寧、氨基酸、生物堿、黃酮、微量元素等活性成分，其中，黃酮類化合物作為植物的次生代謝產物，具有抗過敏、降血壓、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、保肝和降血脂等活性[1-2]。目前綠茶中黃酮類物質主要通過乙醇溶液進行萃取，后續需對溶劑進行蒸發，提取率低，耗能且還會破壞黃酮的生物結構[3-5]。因此，有必要選用一種高效的綠色提取溶劑來提取綠茶中黃酮類物質。

低共熔溶劑(Deep Eutectic Solvents，DESs)為近年來開發的一種綠色高效提取溶劑，具有提取率高、保護活性物質、可回收與降解、安全性高、節約能耗等特點[6-7]，已被廣泛應用于提取黃酮[8]、多酚[9]、皂苷[10]等植物活性成分。然而，低共熔溶劑中氫鍵供體和氫鍵受體的分子間氫鍵作用較強，導致低共熔溶劑黏度較高，需通過稀釋或適當提高溫度來降低其黏度[11]。目前，有關低共熔溶劑提取綠茶中總黃酮的研究尚未見報道。研究擬以綠茶為原料，采用低共熔溶劑對其總黃酮進行提取，分析提取溶液的抗氧化活性，旨在為綠茶相關產品的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

綠茶：市售；

蘆丁：HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：純度96%，上海麥克林生化科技有限公司；

乙酰膽堿：食品級，廣州華智生物科技有限公司；

乳酸：食品級，山東謙順化工有限公司；

維生素C：食品級，維生藥業(石家莊)有限公司；

甘油、無水乙醇、亞硝酸鈉、尿素、草酸、氫氧化鈉、硝酸鋁、乙二醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

電子天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

高速萬能粉碎機：2500Y型，永康市鉑歐五金制品有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠茶總黃酮提取 將綠茶粉碎，過40目篩，加入一定體積的低共熔溶劑，加熱攪拌，過濾，收集提取溶液。

1.2.2 綠茶總黃酮含量測定 參照文獻[12]，按式(1)計算綠茶總黃酮提取率。

C=M1/M2×100%，

(1)

式中：

C——總黃酮提取率，%；

M1——提取的總黃酮質量，g；

M2——樣品的質量，g。

1.2.3 單因素試驗

(1) 提取溶劑種類：固定液料比(V溶劑∶m綠茶)30∶1 (mL/g)，提取溫度80 ℃，提取時間60 min，考察低共熔溶劑種類[n乙酰膽堿∶n乳酸=1∶1，n乙酰膽堿∶n乙二醇=1∶1，n乙酰膽堿∶n甘油=1∶1，n乙酰膽堿∶n草酸=1∶1]對綠茶總黃酮提取率的影響。

(2) 液料比：固定80%乙酰膽堿—乳酸 (n乙酰膽堿∶n乳酸=1∶1) 水溶液，提取溫度80 ℃，提取時間60 min，考察液料比[V溶劑∶m綠茶分別為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g)]對綠茶總黃酮提取率的影響。

(3) 提取溫度：固定80%乙酰膽堿—乳酸(n乙酰膽堿∶n乳酸=1∶1)水溶液，液料比(V溶劑∶m綠茶)30∶1 (mL/g)，提取時間60 min，考察提取溫度(60，70，80，90，100 ℃)對綠茶總黃酮提取率的影響。

(4) 提取時間：固定80%乙酰膽堿—乳酸(n乙酰膽堿∶n乳酸=1∶1)水溶液，液料比(V溶劑∶m綠茶)30∶1 (mL/g)，提取溫度80 ℃，考察提取時間(30，45，60，75，90 min)對綠茶總黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交優化試驗 在單因素試驗基礎上，以80%乙酰膽堿—乳酸(n乙酰膽堿∶n乳酸=1∶1)水溶液為提取溶劑，以液料比、提取溫度和提取時間為自變量，以總黃酮提取率為響應值，進行正交試驗設計，優化綠茶總黃酮低共熔溶劑提取工藝。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定 參照文獻[13]，以維生素C為對照組，重復3次，按式(2)計算DPPH自由基清除率。

X=(A0-A)/A0×100%，

(2)

式中：

X——自由基清除率，%；

A0——不加入綠茶總黃酮提取液的吸光度；

A——加入綠茶總黃酮提取液的吸光度。

1.2.6 OH自由基清除能力測定 參照文獻[14]，按式(2) 計算OH自由基清除率。

1.2.7 數據處理 采用正交設計助手II3.1和Excel 2016軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溶劑種類對綠茶總黃酮提取率的影響 由圖1可知，4種低共熔溶劑均可有效提取綠茶總黃酮，其中80%乙酰膽堿—乳酸(n乙酰膽堿∶n乳酸=1∶1)水溶液對綠茶總黃酮提取效果最佳。低共熔溶劑也被稱為類離子液體，具有與離子液體類似的物理化學性質，能夠快速進入綠茶細胞中將黃酮類物質溶出[15]；此外，不同濃度的低共熔溶劑水溶液可以調整低共熔溶劑的極性，使其與綠茶黃酮類物質的極性接近，利用相似相溶原理，最大程度將綠茶黃酮類物質溶出。因此，選擇80%乙酰膽堿—乳酸(n乙酰膽堿∶n乳酸=1∶1)水溶液作為綠茶總黃酮的提取溶劑。

圖1 低共熔溶劑種類對綠茶總黃酮提取率的影響

2.1.2 液料比對綠茶總黃酮提取率的影響 由圖2可知，隨著液料比的增加，綠茶總黃酮提取率先顯著增加后趨于平衡。當液料比(V溶劑∶m綠茶)>30∶1 (mL/g)時，綠茶總黃酮提取基本完成，提取率不再升高。因此，選擇液料比為30∶1 (mL/g)進行后續試驗。

圖2 液料比對綠茶總黃酮提取率的影響

2.1.3 提取溫度對綠茶總黃酮提取率的影響 由圖3可知，隨著提取溫度的升高，綠茶總黃酮提取率先升高后下降，當提取溫度為80～90 ℃時，總黃酮提取率最大。這是因為提高提取溫度有利于提取溶劑的傳質，有利于綠茶黃酮類物質的溶出，此外，過高的提取溫度也會導致綠茶黃酮類物質的氧化，使總黃酮提取率下降。因此，選擇提取溫度為80 ℃進行后續試驗。

圖3 提取溫度對綠茶總黃酮提取率的影響

2.1.4 提取時間對綠茶總黃酮提取率的影響 由圖4可知，隨著提取時間的延長，綠茶總黃酮提取率先顯著增加后趨于平衡。當提取時間>60 min時，綠茶總黃酮提取過程基本完成，提取率不再升高。因此，選擇提取時間為60 min進行后續試驗。

圖4 提取時間對綠茶總黃酮提取率的影響

2.2 正交優化試驗

在單因素試驗基礎上，以80%乙酰膽堿—乳酸(n乙酰膽堿∶n乳酸=1∶1) 水溶液為低共熔溶劑，以液料比、提取溫度和提取時間為自變量，以綠茶總黃酮提取率為響應值，采用L9(34)進行三因素三水平正交試驗設計。試驗因素及水平表見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 正交試驗因素及水平表

由表2可知，各因素對綠茶總黃酮提取率的影響程度依次為液料比>提取溫度=提取時間，最優工藝條件為A3B3C3，即以80%乙酰膽堿—乳酸(n乙酰膽堿∶n乳酸=1∶1)水溶液為低共熔溶劑，液料比(V溶劑∶m綠茶)40∶1 (mL/g)，提取溫度90 ℃，提取時間75 min。

表2 正交試驗設計及結果

考慮到提取能耗和液料比影響提取體系總黃酮濃度問題，固定提取溫度90 ℃，提取時間75 min，比較液料比(V溶劑∶m綠茶)分別為40∶1，30∶1 (mL/g)時的黃酮提取率。結果表明，當液料比(V溶劑∶m綠茶)為40∶1，30∶1 (mL/g)時，綠茶總黃酮提取率分別為(1.89±0.005)%，(1.84±0.005)%，此時提取液中總黃酮質量濃度分別為(49.6±0.26)，(65.8±0.33) mg/mL。在綠茶總黃酮提取率相差較小的情況下，考慮到提取溶液中總黃酮質量濃度影響單位體積抗氧化活性強弱，確定低共熔溶劑提取綠茶總黃酮的最優工藝條件為以60%乙酰膽堿—乳酸(n乙酰膽堿∶n乳酸=1∶1)水溶液為低共熔溶劑，液料比(V溶劑∶m綠茶)30∶1 (mL/g)，提取溫度90 ℃，提取時間75 min，此條件下綠茶總黃酮提取率為1.84%，總黃酮質量濃度為65.8 mg/mL。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖5可知，綠茶總黃酮提取液和維生素C對DPPH自由基的清除率均表現為隨其體積的增大而逐漸提高后趨于平衡。當加入液體體積為0.04～0.12 mL時，綠茶總黃酮提取液清除DPPH自由基能力強于維生素C；當加入溶液體積>0.12 mL時，兩者清除DPPH自由基能力相當，說明綠茶總黃酮提取液具有很強的清除DPPH自由基能力。

圖5 加入溶液體積對DPPH自由基清除率的影響

2.3.2 OH自由基清除能力 由圖6可知，稀釋10后的綠茶總黃酮提取液和維生素C對OH自由基的清除率均表現為隨其體積的增大而逐漸提高后趨于平衡。當加入液體體積為0.01～0.04 mL時，綠茶總黃酮提取液清除OH自由基能力強于維生素C；當加入溶液體積>0.04 mL時，兩者清除OH自由基能力相當，說明綠茶總黃酮提取液具有很強的清除OH自由基能力。

圖6 加入溶液體積對OH自由基清除率的影響

綜上，綠茶總黃酮提取液具有很強的抗氧化活性，可能是因為低共熔溶劑中乙酰膽堿和乳酸均為食品級，不需蒸發溶劑可直接作為油脂抗氧化添加劑[16]、功能飲料食品原料[17]來源。

3 結論

試驗表明，低共熔溶劑提取綠茶總黃酮的最優工藝條件為以80%乙酰膽堿—乳酸(n乙酰膽堿∶n乳酸=1∶1)水溶液為低共熔溶劑，液料比(V溶劑∶m綠茶)30∶1 (mL/g)，提取溫度90 ℃，提取時間75 min，此條件下綠茶總黃酮提取率為1.84%，總黃酮質量濃度為65.8 mg/mL。抗氧化活性試驗表明，一定質量濃度范圍內，綠茶總黃酮提取液對DPPH自由基和OH自由基的清除能力強于維生素C，說明此綠茶總黃酮提取液具有較強的抗氧化作用，無需蒸發回收溶劑，可直接作為潛在的功能性食品原料或添加劑來源。后續應開展多種功能活性評價研究，以及綠茶總黃酮的組分分析和特性研究。此外，低共熔溶劑的活性、毒性及代謝途徑有待進一步研究。