雙酶法制備玉米芯還原糖工藝條件優化

王婧璇 陸步詩,2 李新社,2 伍 強,2

(1. 邵陽學院食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000；2. 生態釀酒技術與應用湖南省重點實驗室，湖南 邵陽 422000)

玉米芯是玉米脫穗去粒后剩下的中心棒軸，具有吸水能力強、結構一致、柔韌度良好、硬度高、耐磨等優點[1]，經處理后能得到葡萄糖、纖維素、木糖、糖糠以及活性炭等物質[2]。作為一種可再生類資源[3]，玉米芯富含膳食纖維、粗脂肪、粗蛋白、粗纖維等營養成分，其中纖維素在玉米芯中占比約35%，半纖維素為35%～40%[4]，具有較高的應用價值。

研究者[5-8]常采用物理、化學和生物等處理技術降解玉米芯，獲得目的產物，實現玉米芯資源再利用。孟悅等[9]采用高溫熱解法降解玉米芯，提取戊聚糖并進行工藝優化。戴莉等[10]使用高溫液態水預處理玉米芯，并利用表面活性劑吐溫80輔助纖維素酶進行酶解，以提高生物質催化轉化效率。應文俊等[11]利用磷酸聯合過氧化氫(H3PO4-H2O2，PHP)預處理玉米芯，再通過纖維素酶水解，以酶解效率為指標得到最優預處理條件。這些研究多是利用物理、化學方法，或與酶制劑結合的技術降解玉米芯。物理技術對設備要求高、成本大；化學方法易產生有毒副產物，對環境有害；生物處理方法具有綠色環保、條件簡易等特點。而目前生物處理方法研究多集中于利用水解酶制劑降解玉米芯，郝茜珣[12]采用內切木聚糖酶和纖維素酶降解玉米芯獲取低聚木糖和單糖。劉麗娜等[13]通過優化堿性蛋白酶、α-淀粉酶和糖化酶預處理玉米芯，提取不溶性膳食纖維(IDF)和可溶性膳食纖維(SDF)。玉米芯主要由半纖維素、纖維素和木質素等物質組成[4,14]，利用酶制劑作用于連接纖維素和半纖維素間的糖苷鍵，能破壞玉米芯細胞壁，同時破壞圍繞在纖維素和半纖維素外部的木質素屏障，暴露出內部深層的纖維素和半纖維素，進一步使其降解為單糖類物質[15-16]。與陸步詩等[17]僅用纖維素酶降解玉米芯相比，采用纖維素酶和半纖維素酶具有更高的降解效果。研究擬選用纖維素酶、半纖維素酶協同降解玉米芯高效定向制備還原糖，以期實現玉米芯的再利用與資源優化。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

玉米芯：含秋玉米，市售；

纖維素酶：酶活5萬U/g，南寧龐博生物工程有限公司；

半纖維素酶：酶活3萬U/g，南寧龐博生物工程有限公司；

氫氧化鈉：食品級，晟發生物科技有限公司；

3,5-二硝基水楊酸：分析純，天津市光復精細化工研究所；

丙三醇：分析純，西隴化工股份有限公司；

葡萄糖：分析純，成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

傾斜式高速萬能粉碎機：ZN-1000A型，北京中興偉業儀器有限公司；

電熱鼓風干燥箱：101-1AB型，北京中興偉業世紀儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-4型，北京中興偉業世紀儀器有限公司；

電子天平：LE204E/02型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

pH計：PE28型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

可見分光光度計：722型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

臺式冷凍離心機：VElOCITY 14R型，Dynamica Scientific Ltd。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

玉米芯→粉粹、過篩(40目[17])→干燥(75 ℃，24 h)→混料[m玉米芯∶V蒸餾水=1∶20 (g/mL)[18]]→調節pH(5.0±0.2[18])→酶解(根據所需雙酶添加量，按體積分數添加至上述玉米芯液后用棉塞封口，放置水浴鍋中，設置需要的溫度和時間進行酶解反應，且每60 min攪拌2 min)→離心(10 000 r/min，15 min)→檢測還原糖含量

1.3.2 單因素試驗

(1) 雙酶配比：試驗設置酶添加量體積分數為3.0%，酶解溫度50 ℃，酶解時間5 h，進行單因素試驗，做3次平行試驗，檢測酶解液的還原糖含量，探究雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶為10∶5，11∶4，12∶3，13∶2，14∶1)對玉米芯酶解的最佳條件。

(2) 酶添加量：試驗設置雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)為13∶2，酶解溫度50 ℃，酶解時間5 h，進行單因素試驗，做3次平行試驗，檢測酶解液的還原糖含量，探究酶添加量(體積分數為1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%)對玉米芯酶解的最佳條件。

(3) 酶解溫度：試驗設置雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)為13∶2，酶添加量體積分數為3.0%，酶解時間5 h，進行單因素試驗，做3次平行試驗，檢測酶解液的還原糖含量，探究酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)對玉米芯酶解的最佳條件。

(4) 酶解時間：試驗設置雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)為13∶2，酶添加量體積分數為3.0%，酶解溫度50 ℃，進行單因素試驗，做3次平行試驗，檢測酶解液的還原糖含量，探究酶解時間(2，3，4，5，6 h)對玉米芯酶解的最佳條件。

1.3.3 響應面試驗 通過單因素試驗得到的結論，設計響應面優化試驗，確定玉米芯產還原糖的最佳酶解條件。

1.3.4 酶解液還原糖含量測定 根據趙凱等[19]方法稍作修改，吸取0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL的1 mg/mL葡萄糖標準溶液和0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.0 mL的去離子水至1～6號試管中，再分別加入1.5 mL DNS試劑，放入沸水浴中加熱煮沸5 min。待冷卻后各加入去離子水4 mL，混合均勻靜置待用。1號管內試劑視為空白對照組，測定各管試劑在540 nm處吸光度，以還原糖濃度為X軸，吸光度為Y軸，繪制標準曲線。玉米芯酶解上清液用去離子水稀釋5倍，吸取0.1 mL稀釋后的上清液與1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，補加去離子水至5 mL，靜置反應20 min，測定樣液在540 nm處吸光度，并根據標準曲線回歸方程，得出還原糖含量，試驗重復3次，取平均值。

1.3.5 數據處理 采用Design-Expert.V8.0.6.1處理分析響應面設計試驗數據，Excel 2010 軟件繪制標曲。

2 結果與分析

2.1 還原糖濃度標準曲線的繪制

還原糖含量的標準曲線如圖1所示，線性回歸方程為Y=0.83X+0.001，R2=0.999 4。

圖1 還原糖質量濃度標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)對玉米芯降解產還原糖的影響 由圖2可知，m纖維素酶∶m半纖維素酶為13∶2時，還原糖含量達到最大值，當繼續增大纖維素酶添加比例時，還原糖含量開始降低。當增加纖維素酶占比時，纖維素酶起主導作用，能充分降解玉米芯中所含的纖維素[20]，產生還原糖，但降低半纖維素酶含量后，破壞玉米芯中包裹纖維素和半纖維素外部木質素屏障的能力降低[14]，纖維素酶和半纖維素酶不能達到最佳降解效果，因而還原糖含量降低。當m纖維素酶∶m半纖維素酶為13∶2時，玉米芯酶解液的酶解效果最好。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 酶添加量對玉米芯降解產還原糖的影響 由圖3可知，酶添加量為3.0%時還原糖含量出現最高值，繼續增大酶添加量，還原糖含量開始降低。這可能是因為隨著纖維素酶和半纖維素酶的添加，玉米芯中細胞壁破壞程度變大[16]，纖維素得到有效降解，還原糖含量增加顯著，但酶用量過高時，可能由于酶間競爭抑制作用[21]，酶促反應受到抑制[22]，酶解效率降低，還原糖含量降低。當酶添加量為3.0%時，酶解效果最好。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 酶解溫度對玉米芯降解產還原糖的影響 由圖4可知，酶解溫度為40～50 ℃時，還原糖含量呈上升趨勢，超過50 ℃之后，還原糖含量開始下降。這可能是由于溫度升高，酶的反應活力增加，使酶的反應速度提高，酶解更完全，但溫度過高時，纖維素酶和半纖維素酶的酶解活力被抑制，酶解速度降低[23]，還原糖含量減少。當酶解溫度達到50 ℃時，酶解效果最好。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.4 酶解時間對玉米芯降解產還原糖的影響 由圖5可知，酶解時間為2～5 h時，還原糖含量隨酶解時間的增加而升高，但酶解時間超過5 h之后，還原糖含量開始下降。這可能是因為隨著時間的增加，酶制劑充分發揮了酶促作用，玉米芯能夠被充分降解，當酶解時間超過5 h后，纖維素酶和半纖維素酶失去活性，還原糖不再增加[23]；而產生的還原糖又可能與玉米芯蛋白發生美拉德反應而被消耗，從而導致玉米芯酶解液中還原糖含量降低。當酶解時間為5 h時，玉米芯酶解液達到最佳效果。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計與分析 根據單因素試驗結果，以雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)、酶添加量、酶解溫度、酶解時間為影響因素，以還原糖含量為響應值，進行四因素三水平的響應面試驗設計(表1)。不同試驗條件下的還原糖含量如表2所示。

表1 響應面試驗設計因素與水平

表2 響應面試驗設計方案與結果

對響應面結果進行回歸擬合，得到還原糖含量(Y)與各因素的二次多項回歸方程：

Y=12.24+0.27A+0.19B+0.20C+0.37D+0.065AB-0.20AC+0.07AD+0.13BC-0.042BD-0.22CD-0.41A2-0.64B2-1.02C2-0.39D2。

(1)

表3 響應面試驗的方差分析結果?

2.3.2 影響因素的交互作用分析 由圖6(a)可知，雙酶配比與酶添加量之間交互作用顯著，且雙酶配比的高線變化更為緊密，表明雙酶配比對還原糖含量的影響更顯著，與方差分析所得結論一致。圖6(b)顯示，隨著酶解溫度和時間的增加，還原糖含量呈先上升后降低的趨勢。圖6(c)中，酶添加量與酶解溫度交互作用的等高線更接近圓形，表明2個因素交互對還原糖含量的作用不明顯。

圖6 各因素交互作用等高線及響應曲面圖

2.3.3 最優條件的選取與驗證 根據響應面模型的預測結果，得到由纖維素酶和半纖維素酶復配的混合酶水解玉米芯的最佳酶解條件為：雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)13.38∶2、酶添加量3.08%、酶解溫度50.10 ℃、酶解時間5.15 h，在該條件下響應面軟件預測的還原糖含量為12.40 mg/mL。為方便實際操作，將工藝參數修正為雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)13∶2、雙酶添加量3.25%、酶解溫度50 ℃、酶解時間5 h的條件下進行3次平行驗證實驗，其平均還原糖含量為12.45 mg/mL，與模型預測的結果基本一致，表明該模型可以有效反映各因素對還原糖含量的影響，模型可行。

3 結論

選用纖維素酶、半纖維素酶為水解酶制劑，利用雙酶協同降解玉米芯定向制備還原糖，通過單因素試驗探究雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)、酶添加量、酶解溫度、酶解時間等因素對玉米芯還原糖含量的影響，并通過響應面試驗對其酶解工藝進行優化，確定玉米芯最佳酶解工藝為雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)13∶2，酶添加量3.25%，酶解溫度50 ℃，酶解時間5 h，此條件下得到的玉米芯酶解液還原糖含量為12.45 mg/mL。與陸步詩等[17]僅用纖維素酶降解玉米芯相比，采用復合酶法得到的還原糖產量更多，達到高效生產還原糖的目的。后續可利用霉菌等微生物將玉米芯酶解液進一步發酵轉化為酒精，以進一步提高其附加值。