lnc AL928768.3 通過miR-92a-3p/ADAM10 軸對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖和凋亡的影響①

鐘 環 陳海聰 劉田豐 楊樹凱 魏 波 歐陽漢斌

（廣東醫科大學附屬醫院骨科中心關節外科，湛江524000）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性疾病，以慢性炎癥、滑膜細胞增生異常、關節腫脹壓痛為特征，發病機制尚不清楚［1］。早期診斷、新藥物及治療方案能夠有效改善RA 患者預后［2］。但部分患者對治療無反應，隨著病程發展，可能導致患者殘疾［3］。因此，尋找治療RA的新靶點勢在必行?；こ衫w維細胞（synovial fi?broblasts，SFs）是滑膜內膜重要組成。RA 期間，SFs過度激活導致薄滑膜增生并形成血管翳樣結構。RA 早期階段包括滑膜中存在活化的SFs，伴有侵襲性表型，如過度增殖、抑制凋亡等［4］。但SFs 在RA發生發展中的作用機制尚未闡明。目前治療策略并不針對活化的SFs。因此，了解異常激活SFs的潛在機制有助于識別新的診斷標志物和治療靶點。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度超過200個核苷酸的轉錄物，通過調節SFs增殖和凋亡等參與RA 發生［5］。微小RNA（microRNA，miRNA）是另一類非編碼RNA，在自身免疫病中表達失調［6］。lncRNA-miRNA-mRNA 調控網絡在多種疾病中發揮關鍵作用，其中lncRNA 已被證明具有miRNA海綿功能［7］。最近研究表明，lnc AL928768.3在RA 滑膜組織標本中的表達明顯高于對照，且lnc AL928768.3 是RA 危險性和活動性的新生物標志物［8］。但lnc AL928768.3 在RA 患者SFs 中的作用尚不清楚。本研究通過生物信息學軟件LncBase Predicted v.2和TargetScan預測發現，lnc AL928768.3與miR-92a-3p及miR-92a-3p與ADAM10 存在特異性結合位點，因此，本研究擬探討lnc AL928768.3通過miR-92a-3p/ADAM10 軸調控RA-SFs 增殖和凋亡的機制，為RA治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 28 例RA 患者滑膜組織取自廣東醫科大學附屬醫院行膝關節置換術或膝關節滑膜切除術的患者，入選患者無其他關節異?；蛉硇约膊　Ａ砣?8 例無慢性或急性關節相關疾病膝關節創傷患者的滑膜組織作為健康對照。標本采集后立即使用生理鹽水沖洗干凈，液氮中保存。本研究受試者知情同意，并經廣東醫科大學附屬醫院倫理會批準。

1.1.2 試劑 RA-SFs 細胞系MH7A 購自美國ATCC；RPMI1640 培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；lnc AL928768.3 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、ADAM10 siRNA 和siRNA control、lnc AL928768.3 過表達載體質粒和pcDNA3.1 空載體質粒、miR-92a-3p mimics 和mimics control、miR-92a-3p inhibitors 和inhibitors control 購自上海吉瑪制藥；Lipofectamine3000 脂質體購自美國Invitrogen 公司；MTT 試劑購自美國Amresco 公司；Trizol 試劑購自北京索萊寶；逆轉錄試劑盒、qPCR 檢測試劑盒購自賽默飛世爾；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購 自 日 本TaKaRa；ADAM10、PCNA、Cleaved Cas?pase-3單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國CST 公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、雙熒光素酶報告系統檢測試劑盒購自上海碧云天。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染和分組 采用含10%胎牛血清及100 U/ml青-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養基培養MH7A 細胞，培養條件為：5%CO2、37 ℃、95%濕度。對數期MH7A細胞以1×105個/孔接種至6孔板，培養過夜，細胞60%匯合時轉染，根據Lipofectamine3000說明書將lnc AL928768.3 siRNA、ADAM10 siRNA、lnc AL928768.3過表達載體質粒、miR-92a-3p mimics、miR-92a-3p inhibitors 及相應陰性對照轉染至MH7A 細胞，6 h 后更換新的RPMI1640 培養液繼續培養48 h，分別記為si-AL928768.3 組、si-NC 組、si-AL928768.3+anti-miR-92a-3p 組、si-AL928768.3+anti-miR-NC 組、si-ADAM10 組、si-ADAM10+antimiR-92a-3p 組、si-ADAM10+AL928768.3 組，未轉染的MH7A細胞記為Mock組。

1.2.2 qPCR檢測lnc AL928768.3和miR-92a-3p表達 采用Trizol 試劑提取滑膜組織和轉染48 h 的各組MH7A 細胞總RNA，測定RNA 濃度和純度，逆轉錄合成cDNA，qPCR 試劑盒進行反應，擴增結束后分 析 樣 品Ct 值，2-ΔΔCt計 算lnc AL928768.3 和miR-92a-3p 表達，內參基因分別為GAPDH 和U6，引物序列為lnc AL928768.3 F：5'-CGTGACCTCTGTGGCT?GCTA-3'，lnc AL928768.3 R：5'-TTGTGATGTTG?GCGGTTAGTGG-3'；GAPDH F：5'-GAGTCCACTG?GCGTCTTCAC-3'；GAPDH R：5'-ATCTTGAGGCT?GTTGTCATACTTCT-3'；miR-92a-3p F：5'-CTCAACT?GGTGTCGTGGAGT-3'；miR-92a-3p R：5'-GCAATTCAGTTGATACAGGCCG-3'；U6 F：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；U6 R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因實驗 根據生物信息學在線數據庫LncBase Predicted v.2 和TargetScan預測結果，將與miR-92a-3p 結合位點的靶序列分別插入熒光素酶報告載體，構建lnc AL928768.3 野生型（lnc AL928768.3-Wt）和突變型（lnc AL928768.3-Mut）及ADAM10 野生型（ADAM10-Wt）和突變型（ADAM10-Mut）重組熒光素酶報告載體質粒，采用Lipofectamine3000分別將重組載體質粒分別與miR-92a-3p mimics 或mimics control 共轉染至MH7A 細胞，繼續培養48 h，收集各組MH7A 細胞，根據雙熒光素酶報告基因試劑盒分別測定螢火蟲和海腎熒光值，分別計算各組MH7A細胞相對熒光素酶活性。

1.2.4 MTT 檢測細胞增殖 對數期MH7A 細胞接種至96孔板，接種密度為5×103個/孔，按1.2.3 轉染，48 h后除去舊培養液，添加新的培養液，20 μl/孔添加MTT溶液繼續孵育4 h，添加150 μl二甲基亞砜溶解沉淀，酶標儀測定490 nm 處光密度（OD）值，實驗重復3次，以OD值評估各組MH7A細胞增殖能力。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 各組MH7A細胞轉染48 h，胰蛋白酶消化細胞，收集約6×105個細胞，PBS 洗滌數次，添加適量結合緩沖液重懸細胞，添加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI充分混勻，室溫避光孵育15 min，加入適量細胞懸液，流式細胞儀檢測，Cell Quest 軟件分析MH7A 細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測ADAM10、PCNA和Cleaved Caspase-3 蛋白表達 各組MH7A 細胞轉染48 h 后以RIPA 裂解液于冰上裂解，離心提取總蛋白，采用BCA 蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白含量，采用SDSPAGE 電泳分離蛋白，電轉至硝酸纖維素膜，封閉2 h，將膜與ADAM10、PCNA、Cleaved Caspase-3 和內參GAPDH 一抗共同孵育，4 ℃搖床過夜，次日取出膜與二抗孵育2 h，化學發光試劑顯影，凝膠成像系統采集圖像，Image J 軟件分析各條帶灰度值，實驗重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RA患者滑膜組織lnc AL928768.3和miR-92a-3p表達 qPCR 檢測發現，RA 患者滑膜組織中lnc AL928768.3 表達明顯高于健康對照（P＜0.05），而miR-92a-3p表達明顯低于健康對照（P＜0.05，表1）。

表1 兩組滑膜組織中lnc AL928768.3 和miR-92a-3p 表達（±s，n=28）Tab.1 Expressions of lnc AL928768.3 and miR-92a-3p in synovial tissues of two groups（±s，n=28）

表1 兩組滑膜組織中lnc AL928768.3 和miR-92a-3p 表達（±s，n=28）Tab.1 Expressions of lnc AL928768.3 and miR-92a-3p in synovial tissues of two groups（±s，n=28）

Note：Compared with healthy control group，1）P＜0.05.

Healthy control RA synovial tissue t P 1.00±0.10 3.52±0.341）37.626 0.000 1.00±0.09 0.37±0.041）33.848 0.000images/BZ_26_1285_1872_2248_1931.png

2.2 lnc AL928768.3 靶向調控miR-92a-3p 表達生物信息學LncBase Predicted v. 2 在線數據庫預測結果顯示，lnc AL928768.3 與miR-92a-3p 存在特異性結合位點（圖1）。雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，與miR-NC組相比，miR-92a-3p組AL928768.3-Wt細胞相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而AL928768.3-Mut 細胞相對熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05，表2）。

表2 各組細胞相對熒光素酶活性比較（±s）Tab.2 Comparison of relative luciferase activity of cells in each group（s）

表2 各組細胞相對熒光素酶活性比較（±s）Tab.2 Comparison of relative luciferase activity of cells in each group（s）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

images/BZ_26_1281_2897_2240_2964.png

圖1 lnc AL928768.3和miR-92a-3p的互補堿基序列Fig.1 Complementary base sequence between lnc AL928-768.3 and miR-92a-3p

2.3 抑制lnc AL928768.3 對MH7A 細胞增殖和凋亡的影響 qPCR、MTT、流式細胞術和Western blot檢測結果顯示，與Mock 組和si-NC 組相比，si-AL928768.3 組MH7A 細 胞lnc AL928768.3 表 達 明顯下調（P＜0.05），OD 值及PCNA 表達均明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率、miR-92a-3p 和Cleaved Cas?pase-3 表達均明顯升高（P＜0.05）；Mock 組和si-NC組以上指標差異無統計學意義（P＞0.05，圖2、表3）。

表3 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、lnc AL92±s）Tab.3 Comparison of OD value，apoptosis aspase-3 expressions of MH7A cells in each group（

表3 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、lnc AL92±s）Tab.3 Comparison of OD value，apoptosis aspase-3 expressions of MH7A cells in each group（

Note：Compared with Mock group，1）P＜0.05；compared with si-NC group，2）P＜0.05.

Mock si-NC si-AL928768.3 FP 1.00±0.10 0.99±0.09 0.28±0.031）2）80.732 0.000 1.00±0.09 0.97±0.09 2.86±0.281）2）111.511 0.000 0.73±0.07 0.72±0.07 0.41±0.041）2）26.132 0.001 0.31±0.03 0.32±0.03 0.14±0.011）2）48.474 0.000 4.25±0.61 4.73±0.66 18.16±2.071）2）110.184 0.000 0.11±0.01 0.10±0.01 0.36±0.041）2）108.500 0.000images/BZ_27_235_2210_2240_2268.png

圖2 抑制lnc AL928768.3對MH7A細胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effect of inhibiting lnc AL928768.3 on proliferation and apoptosis of MH7A cells

2.4 干擾miR-92a-3p 逆轉了抑制lnc AL928768.3對MH7A 細胞增殖和凋亡的影響 qPCR、MTT、流式細胞術和Western blot 檢測結果顯示，與si-AL928768.3 組 和si-AL928768.3+anti-miR-NC 組 相比，si-AL928768.3+anti-miR-92a-3p 組MH7A 細 胞miR-92a-3p 表達明顯下調（P＜0.05），OD 值及lnc AL928768.3 和PCNA 表達均明顯升高（P＜0.05），細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 表達均明顯降低（P＜0.05）；si-AL928768.3組和si-AL928768.3+anti-miRNC組以上指標差異無統計學意義（P＞0.05，圖3、表4）。

表4 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、lnc AL928768.3、miR-92a-3p、PCNA和Cleaved Caspase-3表達比較（s）Tab.4 Comparison of OD value，apoptosis rate，lnc AL928768.3，miR-92a-3p，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

表4 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、lnc AL928768.3、miR-92a-3p、PCNA和Cleaved Caspase-3表達比較（s）Tab.4 Comparison of OD value，apoptosis rate，lnc AL928768.3，miR-92a-3p，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

Note：Compared with si-AL928768.3 group，1）P＜0.05；compared with si-AL928768.3+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

si-AL928768.3 si-AL928768.3+anti-miR-NC si-AL928768.3+anti-miR-92a-3p FP 1.00±0.11 0.96±0.09 2.42±0.221）2）90.735 0.000 1.00±0.10 1.00±0.09 0.31±0.031）2）75.174 0.000 0.42±0.04 0.41±0.04 0.70±0.071）2）34.482 0.000 0.15±0.02 0.15±0.01 0.32±0.031）2）119.786 0.000 18.32±2.21 18.19±2.07 7.01±1.131）2）36.319 0.000 0.35±0.03 0.34±0.03 0.16±0.021）2）46.773 0.000images/BZ_27_235_2868_2240_2927.png

圖3 干擾miR-92a-3p逆轉了抑制lnc AL928768.3對MH7A細胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Interference with miR-92a-3p reversed effect of inhibiting lnc AL928768.3 on proliferation and apoptosis of MH7A cells

2.5 miR-92a-3p 靶向結合ADAM10 生物信息學TargetScan在線數據庫分析結果顯示，miR-92a-3p與ADAM10 3'UTR 存在靶向結合序列（圖4）。雙熒光素酶報告基因實驗結果證實，與miR-NC 組相比，miR-92a-3p 組ADAM10-Wt 細胞相對熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而ADAM10-Mut 細胞相對熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05，表5）。

表5 各組MH7A細胞相對熒光素酶活性比較（±s）Tab.5 Comparison of relative luciferase activity of MH7A cells in each group（s）

表5 各組MH7A細胞相對熒光素酶活性比較（±s）Tab.5 Comparison of relative luciferase activity of MH7A cells in each group（s）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-92a-3p tP ADAM10-Wt 1.00±0.10 0.29±0.031）11.779 0.000 ADAM10-Mut 1.00±0.09 0.94±0.09 0.817 0.460

圖4 miR-92a-3p與ADAM10 3'UTR存在互補配對序列Fig.4 Complementary pairing sequence between miR-92a-3p and ADAM10 3'UTR

2.6 lnc AL928768.3 通 過miR-92a-3p/ADAM10 軸對MH7A 細胞增殖和凋亡的影響 Western blot、MTT 和流式細胞術檢測結果顯示，與si-NC 組相比，si-ADAM10 組MH7A 細 胞ADAM10 表 達 明 顯 下 調（P＜0.05），OD 值和PCNA 表達明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3表達均明顯升高（P＜0.05）；與si-ADAM10 組相比，si-ADAM10+anti-miR-92a-3p 組 和si-ADAM10+AL928768.3 組ADAM10、PCNA表達及OD值均明顯升高（P＜0.05），細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 表達均明顯降低（P＜0.05，圖5、表6）。

圖5 lnc AL928768.3通過miR-92a-3p/ADAM10軸對MH7A細胞增殖和凋亡的影響Fig.5 Effect of lnc AL928768.3 on proliferation and apoptosis of MH7A cells through miR-92a-3p/ADAM10 axis

表6 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、ADAM10、PCNA和Cleaved Caspase-3表達比較（±s）Tab.6 Comparison of OD value，apoptosis rate，ADAM10，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

表6 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、ADAM10、PCNA和Cleaved Caspase-3表達比較（±s）Tab.6 Comparison of OD value，apoptosis rate，ADAM10，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05；compared with si-ADAM10 group，2）P＜0.05.

3 討論

RA 是一種常見的慢性自身免疫性疾病，特征為關節發炎、軟骨破壞和骨侵蝕［9］。最近研究顯示，lncRNA 參與調節RA 患者SFs 增殖、凋亡和促炎細胞因子分泌［5，10］。本研究中，lnc AL928768.3 作為miR-92a-3p的ceRNA，導致ADAM10上調并促進RA進展。越來越多的研究表明，lncRNA 是人類病理學的重要調節因子，且lncRNA 在免疫系統中起重要作用，與自身免疫?。ò≧A）發生和發展密切相關［11-12］。本研究發現，RA 滑膜組織lnc AL928768.3表達升高，與既往研究結論一致［8］。功能實驗顯示抑制lnc AL928768.3可能抑制MH7A細胞增殖并誘導細胞凋亡。RA 中SFs 激活是受累滑膜向健康滑膜轉化的關鍵因素，導致關節炎擴張和遠處關節破壞。RA-SFs增殖增強和凋亡不足可能使其擴散，導致骨破壞。RA-SFs增殖也會導致免疫應答，最終導致 關 節 損 傷［4，13］。 本 研 究 首 先 證 明 了lnc AL928768.3 在RA 滑膜組織中表達上調，表明其參與了RA 發病機制，與既往研究關于RA 患者滑膜組織中lnc AL928768.3 表達上調一致。 但lnc AL928768.3 在RA 患者SFs 中的作用尚未闡明。本研究表明，抑制lnc AL928768.3 表達能夠在體外抑制MH7A細胞增殖，并促進其凋亡。

lncRNA 通過介導功能修飾、組蛋白修飾和染色質重塑發揮作用［16］。此外，lncRNA 通過海綿狀特異性miRNA 調節mRNA 轉錄［14-16］。研究已證實miR-92a-3p在RA患者中呈低表達；miR-92a-3p通過抑制細胞增殖、減少促炎細胞因子產生和誘導RA-SFs凋亡發揮保護作用［17］。本研究通過生物信息學工具和熒光素酶報告分析證實lnc AL928768.3直接結合miR-92a-3p。此外，抑制lnc AL928768.3 表達能夠上調MH7A 細胞miR-92a-3p 表達。因此，本研究假設lnc AL928768.3 通過直接調節miR-92a-3p 在RASFs 中發揮作用，結果顯示，干擾miR-92a-3p 能夠逆轉抑制lnc AL928768.3對MH7A細胞增殖抑制和凋亡的誘導作用，證實lnc AL928768.3是RA-SFs的癌基因，靶向調控miR-92a-3p。作為miR-92a-3p 的直接靶點，ADAM10 在RA 中高表達已被XIE 等［18］證實。本研究證實，抑制ADAM10 表達能夠有效抑制MH7A細胞增殖，并促進細胞凋亡，且抑制miR-92a-3p或過表達lnc AL928768.3 能夠恢復抑制ADAM10對MH7A 細胞增殖抑制和凋亡的誘導作用。由于lnc AL928768.3 可與miR-92a-3p 結合，本實驗通過Western blot 檢測ADAM10 表達，并證明lnc AL928768.3 能夠通過海綿吸附miR-92a-3p 進而上調ADAM10 表達。證實lnc AL928768.3 通過miR-92a-3p/ADAM10 軸促進RA MH7A 細胞增殖，抑制細胞凋亡，從而促進RA發生和進展。

綜上，本研究結果顯示，lnc AL928768.3通過與miR-92a-3p 結合負調控miR-92a-3p 表達，從而上調ADAM10 表達。lnc AL928768.3 能夠促進RA-SFs增殖，抑制細胞凋亡。因此，lnc AL928768.3可能是RA 患者有效的診斷和治療靶點。但本研究存在一定局限性，僅涉及體外細胞實驗，未在動物體內進行驗證尚顯不足，因此，后續將在動物體內探究lnc AL928768.3的作用和機制。