lncRNA-PCAT6通過調控miR-185/SIX1軸對肺癌A549細胞上皮間質轉化及化療敏感性的影響

王華麗 農開旭 程守斌 秦 篙 許振勝

（中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院呼吸內科，海口570208）

肺癌是發病率及病死率均居世界首位的惡性腫瘤［1］。肺癌早期診斷困難，術后復發、轉移、化療藥物耐受性升高及放化療敏感性降低，是導致患者治療失敗及死亡的主要原因［2］。上皮間質轉化（epi?thelial mesenchymal transition，EMT）在癌細胞侵襲遷移發生過程中發揮重要作用，且被認為是腫瘤發生侵襲、遷移、耐藥抵抗性的重要原因［3-5］。目前研究發現，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc-RNA）可競爭性結合及綁定目標基因序列而參與調控人類癌癥復發轉移及耐藥性發生發展過程，且lncRNA-PCAT6 已被發現在人類肺癌、胰腺癌等多種癌癥組織中異常表達，并與癌癥患者生存及預后關系密切［6-7］。但lncRNA-PCAT6在肺癌轉移及耐藥性發生發展過程中的靶向調控機制還不甚明確。微小非編碼RNA-185（microRNA-185，miR-185）是一種與癌癥相關的miRNA，已有研究證實miR-185可靶向抑制SIX1 表達，抑制癌細胞的生長及耐藥性［8-9］。lncRNA-PCAT6 能否靶向調控miR-185/SIX1軸表達進而影響肺癌細胞EMT 及耐藥性的發生發展，目前還未見報道。本研究通過體內外試驗對此進行探究驗證，以期為肺癌的靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及動物來源 人肺癌細胞系（A549）購自中國上海細胞庫（貨號：BNCC290808）；人肺癌耐順鉑細胞株（A549/DDP）購自上海奧陸生物科技有限公司（貨號：SA-2819）；雄性BALB/c 裸鼠42 只，6 周齡，體質量180～200 g，購自北京富豪實驗動物養殖中心，生產許可證號：SCXK（京）2019-0015；所有動物按《實驗動物的護理和使用指南》進行，并經中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑與儀器 RPMI1640 培養基（南京北魚生物科技有限公司，貨號：BYCI-RELM-3992-0）；順鉑（DDP，四川省維克奇生物科技有限公司，貨號：wkq-08833）；CCK-8試劑盒（上海經科化學科技有限公司，貨號：CK04-2）；RNA 提取試劑盒（北京天漠科技開發有限公司，貨號：TR205-50）；逆轉錄試劑盒（北京拜爾迪生物技術有限公司，貨號：DEM201-20T）；E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、SIX1、P-gp（美國Abcam公司，貨號：ab239883、ab92547、ab76011、ab243247、ab262880）；G2000 型PCR 儀購自北京托摩根（Thmorgan）生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染分組 取人A549細胞系及A549/DDP 細胞株常規復蘇后，用RPMI1640 培養基在恒溫培養箱中常規培養傳代細胞。分別取對數期A549、A549/DDP 細胞，以5×104個/孔的密度接種于6 孔板，并進行如下處理：①取A549 細胞，分為空白組、PCAT6-Si組（轉染lncRNA-PCAT6低表達腺病毒PCAT6-Si）、eGFP-Si-1 組（轉 染 不 含lncRNAPCAT6-Si 的空病毒載體eGFP-Si-1）、miR-185-Si 組（轉染miR-185 低表達腺病毒miR-185-Si）、eGFP-Si-2 組（轉染不含miR-185-Si 的空病毒載體eGFP-Si-2）、PCAT6-Si+miR-185-Si 組（PCAT6-Si 與miR-185-Si 共轉染）；②取A549/DDP 細胞，并分別轉染PCAT6-Si 及miR-185-Si，分為：A549 組、A549/DDP組、PCAT6-Si 組、miR-185-Si 組、PCAT6-Si+miR-185-Si、eGFP-Si-1 組、eGFP-Si-2 組。各組均設置6 個復孔?？瞻捉M、A549組、A549/DDP 組不做任何處理正常培養，其余各組分別待A549、A549/DDP 細胞融合度達50%～60%時，轉染相應的低表達腺病毒及其空載體eGFP-Si。各轉染組于轉染后24 h，取細胞進行后續試驗。

1.2.2 RT-qPCR 檢測各組細胞中lncRNA-PCAT6、miR-185 相對表達水平 以cDNA 為模板，按照RTqPCR 試劑盒說明書進行PCR 反應（反應體系：正反向引物各0.5 μl，2×SYBR mix 10 μl，10×cDNA 模板1 μl，H2O 8 μl。反應條件：95 ℃預變性15 min、95 ℃變性30 s、65 ℃退火60 s、45 個循環，72 ℃延伸30 min。lncRNA-PCAT6以GAPDH 為內參，miR-185以U6 為內參。用2-ΔΔCt算法，計算lncRNA-PCAT6 及miR-185 表達水平。大連寶生物公司合成提供引物序列，見表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequences

1.2.3 Transwell檢測A549細胞遷移侵襲能力 取1.2.1 項下①方法處理轉染的各組細胞，用不含胎牛血清的培養基重懸為1×108個/ml的細胞懸液。取Transwell 小室，小室上室加入100 μl 不含胎牛血清的培養液及細胞懸液，小室下室加入含10%胎牛血清的培養液，室溫孵育24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定和結晶紫染色后，于光學顯微鏡下觀察，隨機取5 個視野計數，細胞數目越多代表細胞遷移能力越強。小室上室鋪Matrigel膠工作液（Matrigel膠：培養基=1：8）50 μl，室溫孵育過夜，Matrigel膠凝固后，其余步驟同遷移試驗，檢測細胞侵襲能力。實驗重復3次。

1.2.4 免疫熒光檢測A549 細胞EMT 標志物N-cadherin 陽性表達 取1.2.1 項下①方法處理轉染的各組細胞，棄去培養液，4%多聚甲醛固定后，用特丁基對苯二酚（TBHQ）處理、0.25%曲拉通透化后，加入N-cadherin 特異性一抗（1：200）4 ℃孵育過夜，加入Aexa Fluor488 熒光標記的二抗室溫孵育0.5 h，DAPI 核染后，防猝滅液封片，于熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.5 CCK-8法檢測A549細胞對DDP的耐藥性取1.2.1 項下②方法處理轉染的各組細胞，參照文獻［10］于培養液中分別加入終濃度為0、2、4、8、16、32、64 μmol/L 的DDP 培養24 h 后，加入CCK-8 溶液10 μl 繼續培養2 h 后，酶標儀于450 nm 波長處檢測各組細胞OD 值，根據OD 值繪制生長曲線，采用GraphPad Prism 軟件計算半數抑制濃度（IC50），并按照以下公式計算耐藥指數（resistance index，RI）：RI=實驗組IC50/A549組IC50。

1.2.6 Western blot 檢測細胞蛋白相對表達水平取1.2.1 項下①處理方法細胞檢測SIX1、EMT 標志蛋白E-cadherin、Vimentin 及N-cadherin 的表達；取1.2.1 項下②處理方法細胞檢測SIX1、P-gp、Cas?pase-1、MMP-9 蛋白表達。具體方法為收集各組細胞，抽提蛋白及BCA 法測蛋白濃度后，取50 μg蛋白樣品上樣，行電泳及轉膜反應，加入一抗［SIX1、E

cadherin、Vimentin、N-cadherin、P-gp、Caspase-1、MMP-9 抗體（1：800），內參GAPDH（1：3 000）］，4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶二抗（1：3 000）室溫孵育4 h，電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）試劑顯影曝光，化學發光成像分析系統拍照并分析灰度值。每組試驗重復3次。

1.2.7 裸鼠荷瘤試驗驗證PCAT6 對DDP 耐藥的A549 細胞化療敏感性的作用 將1.2.1 項下②處理方法轉染的A549/DDP 細胞（6×106個/L）于皮下注射到裸鼠中。當腫瘤體積達到約60 mm3時，每3 d給裸鼠腹膜內注射3 mg/kg 的DDP。接種后第35 天處死小鼠，用游標卡尺測量腫瘤體積，按照下式計算腫瘤體積：腫瘤體積=（長×寬2）/2。稱取腫瘤樣品的重量并進行分析。

1.2.8 熒光素酶報告試驗驗證PCAT6 與miR-185之間的靶向關系 將包含miR185-5p 結合位點或每個位點突變體的野生型PCAT6 序列克隆到psi?CHECK-2質粒中，命名為PCAT6-WT或PCAT6-MUT報告基因。待A549/DDP 細胞生長至80%融合度時，將miR185 高表達腺病毒Ad-miR-185 及空載體Ad-NC 分別與PCAT6-WT 及PCAT6-MUT 共轉染，得到PCAT6-WT+Ad-miR-185 組、PCAT6-WT+Ad-NC組、PCAT6-MUT+Ad-miR-185 組、PCAT6-MUT+Ad-NC 組，各組均于轉染后約48 h，使用雙重熒光素酶報告基因檢測系統（Promega）測量熒光素酶活性。

1.3 統計學分析 采用SPSS24.0軟件統計分析數據。計量資料用±s表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 敲 低lncRNA-PCAT6 及miR-185 對A549 細 胞相關基因及SIX1蛋白表達的影響 與空白組相比，PCAT6-Si 組A549 細 胞lncRNA-PCAT6 及SIX1 表 達降低（P＜0.05），miR-185 表達升高（P＜0.05）；miR-185-Si 組細胞SIX1 表達升高（P＜0.05），miR-185 表達降低（P＜0.05），lncRNA-PCAT6 表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與PCAT6-Si 組相比，PCAT6-Si+miR-185-Si 組細胞SIX1 表達升高（P＜0.05），miR-185表達降低（P＜0.05），lncRNA-PCAT6表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

表2 各組細胞lncRNA-PCAT6、miR-185 及SIX1 蛋白表達比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of protein expressions of lncRNAPCAT6，miR-185 and SIX1 in each group（s，n=6）

表2 各組細胞lncRNA-PCAT6、miR-185 及SIX1 蛋白表達比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of protein expressions of lncRNAPCAT6，miR-185 and SIX1 in each group（s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs PCAT6-Si group.

Groups Blank PCAT6-Si miR-185-Si PCAT6-Si+miR-185-Si eGFP-Si-1 eGFP-Si-2 lncRNAPCAT6 1.08±0.08 0.56±0.061）1.10±0.09 0.55±0.051）1.05±0.082）1.06±0.072）miR-185 1.04±0.07 1.62±0.151）0.59±0.061）0.12±0.012）1.02±0.102）1.01±0.092）SIX1/GAPDH 1.15±0.10 0.76±0.071）1.89±0.161）1.19±0.092）1.12±0.092）1.11±0.082）

圖1 A549細胞SIX1蛋白表達免疫印跡圖Fig.1 Western blot of expression of SIX1 protein in A549 cells

2.2 敲 低lncRNA-PCAT6 及miR-185 對A549 細 胞侵襲、遷移的影響 與空白組相比，PCAT6-Si 組A549 細胞侵襲、遷移數目減少，侵襲、遷移能力降低（P＜0.05）；miR-185-Si 組侵襲、遷移能力升高（P＜0.05）。與PCAT6-Si 組相比，PCAT6-Si+miR-185-Si 組A549 細胞侵襲、遷移能力升高（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 A549細胞侵襲、遷移數目比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of number of invasion and migration of A549 cells（s，n=6）

表3 A549細胞侵襲、遷移數目比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of number of invasion and migration of A549 cells（s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs PCAT6-Si group.

Groups Blank PCAT6-Si miR-185-Si PCAT6-Si+miR-185-Si eGFP-Si-1 eGFP-Si-2 Number of invasions/（cell·field-1）256.65±10.06 141.55±10.631）362.53±10.991）2）264.07±8.082）261.06±7.582）266.65±10.062）Migration number/（piece·field-1）184.66±6.51 123.65±6.611）262.44±9.481）2）187.32±4.242）185.36±4.312）189.66±6.512）

圖2 A549細胞侵襲、遷移圖（×200）Fig.2 Invasion and migration of A549 cells（×200）

2.3 lncRNA-PCAT6 及miR-185 對A549 細 胞EMT的調控 在肺癌A549 細胞胞漿中N-cadherin 陽性表達升高。與空白組相比，PCAT6-Si 組A549 細胞N-cadherin 陽性染色變淺，N-cadherin 及Vimen?tin 蛋白表達降低，E-cadherin 蛋白表達升高，EMT變化減輕（P＜0.05）；miR-185-Si 組EMT 變化加重（P＜0.05）。與PCAT6-Si 組相比，PCAT6-Si+miR-185-Si 組A549 細胞N-cadherin 陽性染色加重，Ncadherin 及Vimentin 蛋白表達升高，E-cadherin 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖3、圖4、表4。

表4 A549細胞N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達比較（，n=6）Tab.4 Comparison of protein expressions of N-cadherin，Vimentin and E-cadherin in A549 cells（s，n=6）

表4 A549細胞N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達比較（，n=6）Tab.4 Comparison of protein expressions of N-cadherin，Vimentin and E-cadherin in A549 cells（s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs PCAT6-Si group.

圖3 肺癌A549細胞N-cadherin免疫熒光染色圖（×400）Fig.3 Immunofluorescence staining of N-cadherin in lung cancer A549 cells（×400）

圖4 A549細胞N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達免疫印跡圖Fig.4 Western blot of N-cadherin，Vimentin and E-cadherin protein expressions in A549 cells

2.4 敲 低lncRNA-PCAT6 及miR-185 對A549/DDP細胞IC50及RI 的影響 與A549 組相比，A549/DDP組細胞IC50及RI、lncRNA-PCAT6、SIX1 及P-gp 表達升高（P＜0.05），miR-185 表達降低（P＜0.05）。與A549/DDP 組 相 比，PCAT6-Si 組 細 胞IC50及RI、lncRNA-PCAT6、SIX1 及P-gp 表達降低（P＜0.05），miR-185 表達升高（P＜0.05）；miR-185-Si 組細胞IC50及RI、SIX1 及P-gp 表達升高（P＜0.05），miR-185 表達降低（P＜0.05），lncRNA-PCAT6 表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與PCAT6-Si 組相比，PCAT6-Si+miR-185-Si 組細胞IC50及RI、SIX1 及P-gp 表達升高（P＜0.05），miR-185表達降低（P＜0.05），見圖5、圖6、表5。

表5 各組細胞IC50及RI表達比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of IC50 and RI expression in each group（±s，n=6）

表5 各組細胞IC50及RI表達比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of IC50 and RI expression in each group（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs A549 group；2）P＜0.05 vs A549/DDP group；3）P＜0.05 vs PCAT6-Si group.

圖5 各組細胞在不同濃度DDP條件下生長曲線圖Fig.5 Growth curve of cells in each group under different concentrations of DDP

圖6 各組細胞SIX1、P-gp蛋白表達免疫印跡圖Fig.6 Western blot of SIX1 and P-gp protein expressions in cells of each group

2.5 敲低lncRNA-PCAT6 及miR-185 對體內A549/DDP 細胞耐藥性的影響 為了進一步探討lncRNAPCAT6 對A549 體內化學敏感性的影響，將PCAT6-Si 或miR-185-Si 轉 染 的A549/DDP 細 胞 接 種 至BALB/c 裸鼠，給予1 mg/ml 的DDP 治療后發現，與A549組相比，A549/DDP組腫瘤體積增大（P＜0.05）。與A549/DDP 組相比，PCAT6-Si 組腫瘤體積減?。≒＜0.05）；miR-185-Si 組腫瘤體積進一步增大（P＜0.05）。與PCAT6-Si 組相比，PCAT6-Si+miR-185-Si組腫瘤體積增大（P＜0.05），見圖7、圖8。

圖7 各組小鼠腫瘤圖Fig.7 Tumors of each group of mice

圖8 各組細胞接種后腫瘤體積比較Fig.8 Comparison of tumor volume after cell inoculation in each group

2.6 lncRNA-PCAT6對miR-185的靶向作用結果生物信息學軟件（starbase，http：//starbase.sysu.edu.cn/index. php）檢測發現，lncRNA-PCAT6 與miR-185之間有相似的結合位點。雙熒光素酶報告實驗發現，共轉染lncRNA-PCAT6-WT 與Ad-miR-185 后，雙熒光素酶活性降低（P＜0.05）。lncRNA-PCAT6-MUT與Ad-miR-185共轉染組活性差異無統計學意義（P＜0.05），見圖9、圖10。

圖9 miRtarbase預測圖Fig.9 miRtarbase prediction chart

圖10 熒光素酶活性比較Fig.10 Comparison of luciferase activity

3 討論

肺癌一直是社會關注的話題，其研究涉及基因、轉錄、蛋白質水平及信號通路調控等各個領域［11］。肺癌早期診斷困難，術后復發及轉移、化療敏感性降低，一直是阻礙肺癌治療及預后轉歸的關鍵問題［12］。EMT 改變與侵襲轉移、耐藥及放療抵抗關系密切。越來越多的研究證實發生EMT 的肺癌細胞更易侵入基質，穿透血管壁，侵襲轉移至遠處器官組織，并獲得干細胞樣特性來抵御程序性細胞凋亡，導致患者死亡［13］。RAOOF 等［14］發現EMT 改變可引起非小細胞肺癌多種耐藥基因發生突變，并認為阻斷EMT 可降低EMT 介導的耐藥細胞的存活率。故研究肺癌EMT 機制，對促進肺癌治療及預后轉歸有一定的臨床意義。

lncRNA-PCAT6 是一種大于200 個核苷酸的真核生物轉錄物，可通過染色質修飾、轉錄而參與相關基因轉錄表達調節［15］。DONG 等［16］發現lncRNAPCAT6 可直接結合綁定泛素酶USP14 誘導血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）去泛素化轉錄表達，來參與三陰性乳腺癌細胞的增殖、侵襲遷移及EMT 過程，預示lncRNA-PCAT6 異常表達可能參與調控癌細 胞EMT 生 物 學 過 程。WAN 等［17］發 現lncRNAPCAT6 在肺癌組織中表達高于癌旁組織，且下調lncRNA-PCAT6 表達可抑制肺癌細胞增殖及侵襲，并推測lncRNA-PCAT6 高表達可能是肺癌患者預后不良的危險因子。本研究發現，下調lncRNAPCAT6 表達后，A549 細胞EMT 降低，表現為上皮表型標志蛋白E-cadherin 表達升高、間質表型標志蛋白N-cadherin 及細胞骨架改變標志蛋白Vimentin 表達均降低，細胞侵襲遷移能力也隨之降低，提示下調lncRNA-PCAT6 表達可抑制肺癌細胞EMT 進程，降低其侵襲遷移能力，這可能為解決肺癌術后復發及轉移提供新的治療策略。另外，本研究還發現，下調lncRNA-PCAT6 后，A549/DDP 的IC50及RI也顯著降低，提示lncRNA-PCAT6 低表達也可提高A549細胞的耐藥敏感性，這也可能為肺癌放化療治療后癌細胞耐藥抵抗性問題提供新的解決思路。

本研究用生物學軟件預測到lncRNA-PCAT6 與miR-185 之間有結合位點，雙熒光素酶驗證進一步發現lncRNA-PCAT6 與miR-185 之間存在靶向負調控作用。另外裸鼠荷瘤試驗發現，敲低lncRNAPCAT6 后，可降低裸鼠體內A549 對DDP 抵抗力，并抑制腫瘤生長體積，而miR-185 低表達可逆轉敲低lncRNA-PCAT6 的上述作用。曹燕飛等［8］發現miR-185 高表達可靶向下調SIX1 表達，抑制肺癌EMT 進程，從而抑制肺癌侵襲、遷移作用。GE 等［9］研究發現miR-185 表達下調，SIX1 表達上調與非小細胞肺癌侵襲遷移及耐藥相關蛋白表達升高有關，并推測miR-185/SIX1 與肺癌化療敏感性產生有關，有望成為肺癌DDP 耐藥的治療靶點，預示SIX1 與miR-185之間存在靶向調控關系，且參與肺癌EMT 及耐藥產生等生理活動過程。SIX1位于14號染色體上，其在調節宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌及肺癌等癌癥進展中發揮重要作用［18］。CICERI等［19］及ZHANG 等［20］發現SIX1 會觸發血管生成、抑制細胞周期停滯、募集腫瘤相關巨噬細胞等刺激腫瘤淋巴管生成、促進癌細胞增殖、激發癌細胞的遠處轉移。本研究下調A549細胞及其A549/DDP 耐藥細胞中miR-185表達后，檢測到SIX1表達上調的同時，細胞EMT及耐藥性均升高，證實了miR-185/SIX1 軸參與肺癌EMT 及化療敏感性發生發展過程。另外GE 等［9］還發現miR-185的下調可能與lncRNA 的抑制及調控關系密切。本研究也在lncRNA-PCAT6 低表達組檢測到miR-185表達上調、SIX1 表達下調，且下調miR-185 表達后，lncRNA-PCAT6 低表達對肺癌細胞EMT 的抑制作用及對DDP耐藥性的促進作用均得以逆轉。

綜上所述，lncRNA-PCAT6 低表達可靶向上調miR-185，下調SIX1，抑制肺癌A549 細胞EMT 進程，增強A549 細胞對DDP 化療的敏感性。這為肺癌復發及預后治療提供一定的思路，但肺癌侵襲、遷移及耐藥性發生的機制復雜，涉及多個miRNAs 及多種途徑的調控，肺癌治療的其他調控機制有待進一步探究。