參苓白術散對脾虛濕困型UC大鼠結腸組織MKK/JNK通路的影響①

柴瑞婷 賈育新 張明雨 王 斑 范珉玨 曹思齊 （甘肅中醫藥大學，蘭州730000）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見多發的慢性非特異性炎癥性腸病，臨床多表現為反復發作的腹瀉、腹痛、黏液膿血便，病變部位多在結腸黏膜及黏膜下層，逐漸向全結腸蔓延［1］。UC 的發病機制尚未完全明確，有研究表明，免疫、環境、遺傳和外部感染等均可導致UC 發病，目前多數研究者認為黏膜免疫異常是引發腸道炎癥的關鍵，而治療UC 的主要原則是控制癥狀、減輕炎癥反應、促進黏膜愈合、防止復發、防治并發癥等［2］。西醫學主要通過氨基水楊酸鹽、免疫調節劑及糖皮質激素等治療，然而長期用藥存在明顯的不良反應［3-4］。中醫認為UC 多為素體脾氣虛弱、飲食不調、感受外邪所致，病位在大腸，與脾、肝、腎密切相關，脾虛濕困證為其重要證型之一，治以參苓白術散［5］。本文擬研究參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠血清和結腸組織中IL-2 和IL-17 含量、結腸組織中MKK4/7、JNK、AP-1 蛋白及mRNA 表達的影響，探討參苓白術散對模型大鼠MKK/JNK 信號通路的干預作用，進一步挖掘參苓白術散治療脾虛濕困型UC的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 72 只2 月齡SPF 級健康Wistar大鼠（雌雄各半），體質量（220±10）g，由甘肅中醫藥大學醫學實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（甘）2015-0002，于甘肅中醫藥大學SPF 級實驗室常規飼養［動物設施使用許可證號：SYXK（甘）2015-0005-0001405］，相對濕度45%～55%，室溫22～25 ℃，自由進食飲水。實驗動物處理遵守實驗動物倫理原則（倫理審查編號：2019-166）。

1.1.2 藥物 參苓白術散配方顆粒原料藥材根據《中國藥典》依法炮制，按原處方比例配伍（由人參：炒白術：白茯苓：甘草：薏仁：蓮子：砂仁：白扁豆：桔梗：山藥=4：4：4：4：2：2：2：3：2：4），由甘肅中醫藥大學附屬醫院制劑室加工提供；美沙拉秦腸溶片（黑龍江天宏藥業股份有限公司，批號：20190202）。

1.1.3 主要試劑與儀器 2，4，6-三硝基苯磺酸（美倫生物，批號：D1010A）；RIPA 裂解液PMSF（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：20200701）；脫脂奶粉（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：224Q056）；電泳凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20171206）；大鼠IL-2、IL-17 ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：07/2020、07/2020）；逆轉錄試劑盒（批號：H2901291）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒（批號：H8901070）；一抗MKK4、MKK7、JNK、AP-1（美國Abcam 公司，批號：GR297166-6、GR294192-3、GR326430-1、GR156116-12）；p-MKK4（Ser257）、p-JNK（Thr183/Tyr185）、p-AP-1（Ser73）（Cell Signaling Technology 公司，批號：4514T、4668T、3270T）；p-MKK7（Thr275，Affinit公司，批號：#27x6428）；GAPDH一抗（Immunoway 公司，批號：YM3215）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（博士德生物工程有限公司，批號：56j9956）。

SCIENTZ-48型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；CT14RD 型高速低溫離心機（上海天美生化儀器設備工程公司）；Chemi DOC XRS+型凝膠成像分析系統、10705 型Benchmark Plus 酶 標 儀、CFX96 型Real-time PCR 儀、S1000TM型逆轉錄儀、SD 型Western blot 電泳及轉印系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制備 72 只Wistar 大鼠適應性喂養1 周后，隨機分為空白組（12 只）和造模組（60 只），造模組采用病證結合綜合法復建脾虛濕困型UC 大鼠［6-7］。按隨機數字表法將造模組分為模型組、美沙拉秦腸溶片對照組和參苓白術散高、中、低劑量組，每組12只。

模型制備：造模組大鼠單日禁食不禁水，給予4 ℃冷水（2 ml/只）灌胃1 次，雙日供應充足飼料，并給予豬油（4 ml/只）灌胃1次，如此交替，每日強迫大鼠站于2 cm 深水中8 h，連續20 d；第21 天禁食不禁水24 h 后，以10%水合氯醛腹腔麻醉（3 ml/kg），將16 號灌胃針頭部涂抹凡士林后，插入大鼠肛門8 cm處，空白組以0.25 ml生理鹽水灌腸，造模組以0.25 ml 100 mg/kg TNBS+50%乙醇混合試劑灌腸，倒提大鼠尾部靜置1 min，使造模劑充分滲入大鼠腸腔，隨后將大鼠頭部傾斜向下躺至自然蘇醒，自由飲食。觀察大鼠體征是否出現膿血便、腹瀉等，并隨機抽取病檢，確保造模成功。

1.2.2 給藥方法與標本采集 參苓白術散高、中、低劑量組分別按顆粒劑［27.9、13.95、6.975 g/（kg·d）］灌胃，對照組以0.2 g/（kg·d）灌胃21 d（大鼠的等效劑量相當于70 kg成人劑量的6.3倍）。末次給藥禁食不禁水24 h，麻醉采血，血樣靜置15 min，3 000 r/min離心15 min，取血清于-80 ℃保存；脫頸處死，取胸腺、脾臟稱重，截取肛門上約8 cm 處結腸組織，部分置于4%多聚甲醛固定液待病檢，部分于-80 ℃保存待測基因蛋白。

1.2.3 指標檢測

1.2.3.1 觀察指標 觀察各組大鼠精神狀態、毛色、活動情況及大便性狀的改變；肉眼觀察大鼠結腸組織黏膜損傷程度。

1.2.3.2 免疫器官指數 剝離胸腺和脾臟，生理鹽水沖洗，濾紙濾干殘血后稱重。胸腺指數（mg/g）=胸腺重量（mg）/大鼠體質量（g）；脾臟指數（mg/g）=脾臟重量（mg）/大鼠體質量（g）。

1.2.3.3 結腸組織病理檢測 將病變明顯的結腸組織固定于4%多聚甲醛，避光保存，石蠟常規包埋、切片，進行HE 染色，高倍顯微鏡下（×200）觀察各組潰瘍大小、炎癥浸潤。

1.2.3.4 ELISA 檢測結腸組織和血清中IL-2、IL-17含量 取制備的組織上清及血清并平衡至室溫，嚴格按照ELISA 試劑盒操作說明進行，酶標儀波長450 nm處讀取OD值，計算樣品含量。

1.2.3.5 RT-PCR 檢 測 結 腸 組 織MKK4、MKK7、JNK、AP-1 mRNA 表達水平 稱取結腸組織樣本0.1 g，Trizol 法提取總RNA，微量分光光度計檢測RNA 濃度及純度。按逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄合成cDNA 并擴增。相對基因表達量采用2-ΔΔCt法計算。以GAPDH 為內參，引物由上海生工生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.3.6 Western blot 檢測結腸組織MKK4、MKK7、JNK、AP-1 及其磷酸化蛋白相對表達量 稱取結腸組織0.1 g置于離心管中，加入裂解液500 μl（10 μl PMSF+490 μl RIPA），剪碎、勻漿，充分裂解后，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，收集上清液300 μl，加入4 倍上樣緩沖液100 μl，100 ℃水浴10 min。根據MKK4、MKK7、JNK、AP-1 及其磷酸化蛋白相對分子量進行SDS-PAGE 電泳，濕轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h，加入稀釋的GAPDH（1：1 000）、MKK4（1：500）、p-MKK4（1：200）、MKK7（1：500）、p-MKK7（1：500）、JNK（1：1 000）、p-JNK（1：500）、AP-1（1：1 000）、p-AP-1（1：500）一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次×10 min。加入稀釋的二抗（1：10 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次×10 min，ECL顯色液1：1 顯影后采用Image J 圖像分析軟件進行目的條帶的灰度光密度分析。磷酸化蛋白以總蛋白表達水平為參照，通過計算磷酸化蛋白和總蛋白比值顯示蛋白活化情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS25.0統計軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布以±s表示，組間差異的比較采用方差分析，若方差齊采用LSD 法，方差不齊采用Tamhane'sT2法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況及免疫器官指數變化比較

2.1.1 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠一般狀態的影響 空白組大鼠毛色光亮，精神狀態良好，喜活動，大便呈完整顆粒狀；模型組大鼠皮無澤易脫，精神倦怠，拱背扎堆，食水量較空白組明顯減少，大便黏膩，出現膿血便，肛周污穢；藥物干預后，與模型組相比，藥物治療各組大鼠上述癥狀均有明顯好轉，其中以參苓白術散高劑量組最為顯著。

2.1.2 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠免疫器官指數的影響 與空白組相比，模型組大鼠胸腺指數明顯降低（P＜0.01），脾臟指數明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，參苓白術散各組和美沙拉秦對照組大鼠胸腺指數均有所上升，脾臟指數均有所下降，其中參苓白術散高劑量組最為顯著（P＜0.01）；與美沙拉秦腸溶片對照組相比，參苓白術散各劑量組免疫器官指數差異均無統計學意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠胸腺指數和脾臟指數的影響Fig.1 Effects of Shenlingbaizhu Powder on thymus index and spleen index of UC rats with spleen deficiency and dampness

2.2 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織病理形態的影響

2.2.1 結腸組織宏觀觀察 肉眼觀空白組大鼠結腸組織腸壁完整光滑，紋理清晰，未見潰瘍點、糜爛、充血、水腫等。模型組大鼠結腸黏膜明顯水腫充血，腸壁增厚且凹凸不平，潰瘍明顯，可見黑褐色壞死組織。參苓白術散高劑量組結腸組織無明顯水腫、充血等，表面相對完整，腸壁較空白組略厚，顏色略深。其他治療組大鼠結腸組織不同程度地恢復（圖2）。

圖2 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織的影響（宏觀）Fig.2 Effect of Shenlingbaizhu Powder on colonic tissue of UC rats with spleen deficiency and dampness（on macro）

2.2.2 結腸組織病理切片觀察 鏡下觀察空白組大鼠結腸組織黏膜結構完整清晰，腸腺規則，隱窩無壞死，可見大量杯狀細胞，無炎癥細胞浸潤。模型組大鼠結腸組織黏膜結構破壞，腸腺缺失，黏膜表面不平，形成隱窩膿腫，杯狀細胞減少，細胞內黏液減少，固有膜間質內可見大量炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞、漿細胞和單核細胞為主。參苓白術散高劑量組大鼠結腸黏膜結構基本恢復，腸腺破壞較輕，可見再生的黏膜上皮及腸腺，炎癥細胞浸潤明顯減少。其他治療組大鼠結腸組織黏膜少量恢復，仍有少量炎癥細胞浸潤（圖3）。

圖3 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織病理形態的影響（HE，×200）Fig.3 Effect of Shenlingbaizhu Powder on pathological morphology of colon in UC rats with spleen deficiency and dampness（HE，×200）

2.3 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠血清及結腸組織中IL-2、IL-17 含量的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清中IL-2和IL-17含量升高（P＜0.01），結 腸 組 織 中IL-2、IL-17 含 量 升 高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，參苓白術散各劑量組和美沙拉秦腸溶片對照組血清及結腸組織中IL-2、IL-17 含量均降低，其中以參苓白術散高劑量組差異最為顯著（P＜0.01）；與美沙拉秦腸溶片對照組相比，參苓白術散低劑量組結腸中IL-17 含量差異有統計學意義（P＜0.05），其余各組差異無統計學意義（P＞0.05，圖4）。

圖4 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠血清和結腸組織中IL-2、IL-17含量的影響Fig.4 Effect of Shenlingbaizhu Powder on contents of IL-2 and IL-17 in serum and colon tissues of UC rats with spleen deficiency and dampness

2.4 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織MKK4、MKK7、JNK、AP-1 mRNA 水平的影響 與空白組相比，模型組大鼠結腸組織MKK4、MKK7、JNK、AP-1 mRNA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，各干預組大鼠結腸組織MKK4、MKK7、JNK、AP-1 mRNA表達水平均有不同程度降低，其中參苓白術散高劑量組效果最顯著（P＜0.01）；與美沙拉秦腸溶片對照組相比，除參苓白術散高劑量組外，參苓白術散中、低劑量組差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01，圖5）。

圖5 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織中MKK4、MKK7、JNK、AP-1 mRNA水平的影響Fig.5 Effect of Shenlingbaizhu Powder on MKK4，MKK7，JNK，AP-1 mRNA levels in colon tissues of UC rats with spleen deficiency and dampness

2.5 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織MKK4、MKK7、JNK、AP-1 表達及磷酸化水平的影響 與空白組相比，模型組大鼠結腸組織p-MKK4/MKK4、p-MKK7/MKK7 和p-AP-1/AP-1 顯著升高（P＜0.01），p-JNK/JNK 亦升高（P＜0.05）。與模型組相比，參苓白術散高劑量組p-MKK4/MKK4、p-MKK7/MKK7、p-JNK/JNK、p-AP-1/AP-1 均 有 所 降 低（P＜0.05），參苓白術散中劑量組和美沙拉秦腸溶片對照組p-AP-1/AP-1 亦有所降低（P＜0.05）。與美沙拉秦腸溶片對照組相比，參苓白術散各劑量組p-MKK4/MKK4、p-MKK7/MKK7、p-JNK/JNK、p-AP-1/AP-1差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖6、圖7。

圖6 參苓白術散對脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織中MKK4、MKK7、JNK、AP-1蛋白表達及磷酸化的影響Fig.6 Effect of Shenlingbaizhu Powder on MKK4，MKK7，JNK，AP-1 protein expressions and its phosphorylation in colon tissues of UC rats with spleen deficiency and dampness

圖7 各組大鼠結腸組織MKK4、MKK7、JNK、AP-1 及其磷酸化蛋白表達電泳圖Fig.7 Electrophoresis diagram of expressions of MKK4，MKK7，JNK，AP-1 and their phosphorylated proteins in colon tissue

3 討論

UC作為一種非特異性慢性炎癥性腸病，發病機制尚未完全明確。UC 起病緩慢、病癥輕重不一、病情反復，臨床以反復腹瀉、黏液膿血便、里急后重、腹痛等為主要表現［8］。濕熱蘊腸為UC 活動期主要病因病機，而脾虛濕困則是導致UC 遷延反復的主要因素，為緩解期關鍵病因病機，其中脾虛為本、濕困為標，誠如張景岳云：“凡里急后重者……其病不在廣腸而在脾腎也”“脾弱者，因虛所以易瀉，因瀉所以愈虛，蓋關門不固，則氣隨瀉去，氣去則陽衰，陽衰則寒從中生，固不必外受風寒，始謂之寒也”，《雜病源流犀燭·泄瀉源流》亦載：“濕盛則飧泄，乃獨由于濕耳。不知風寒熱虛，雖皆能為病，茍脾強無濕，四者均不得而干之，何自成泄”，皆強調了UC雖病位在腸，但脾胃虛弱乃根本原因。脾胃運化失職，津液不得轉輸，水谷亦不可運化，因而致體虛濕盛，治療應標本兼顧。《醫方考》言：“脾胃喜甘而惡穢，喜燥而惡濕，喜利而惡滯”，治以參苓白術散（《太平惠民和劑局方》），健脾益氣、和胃滲濕。脾悅甘，用人參、甘草補益脾氣，苡仁健脾滲濕，扁豆健脾和中，味之甘者也；土喜燥，用白術燥濕利水、茯苓滲濕利水，甘而微燥也；脾喜香，砂仁辛香而燥，用以開胃醒脾；心生脾，故用蓮肉益心；土惡水，故以山藥治腎，亦可補脾養胃；桔梗入肺經，宣肺利氣，甘而微苦，甘則性緩，故為諸藥之舟楫，苦則喜降，能通天氣于地道，無否塞之憂也［9］。

本課題組前期研究表明，參苓白術散可有效改善模型大鼠的癥狀、體征、結腸病理改變、炎癥因子和分子蛋白表達水平［10］。有研究表明，MKK/JNK 信號通路在炎癥性腸病中發揮重要作用［11］。本研究采用環境與飲食因素干預復建脾虛濕困證型，結合TNBS 與乙醇復合物建立脾虛濕困型UC 大鼠模型。選取美沙拉秦作為陽性對照藥物，臨床上美沙拉秦是治療UC 的主要藥物，通過調節腸黏膜局部花生四烯酸代謝的多個環節，抑制前列腺素、白三烯合成，清除氧自由基，抑制免疫反應［12］。

UC發病的重要因素之一是免疫異常，腸黏膜損壞與炎癥細胞因子的大量釋放關系密切。研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路參與炎癥和應激反應，所有MAPK家族成員均被TXY基序中的蘇氨酸和酪氨酸殘基由單一的雙特異性激酶MAPK 激酶（MKK）催化 激 活［13-14］。作 為MAPK 重 要 的 激 酶，MKK4 和MKK7 能夠特異性激活JNK 表達，JNK 作為MAPK超家族的重要成員，通過Thr183、Tyr185 特定的磷酸化位點激活，從而參與多種細胞增殖、分化過程［15］。在TNBS誘導的大鼠UC模型中，MKK/JNK 通路中作為關鍵激活因子的MKK4調控下游關鍵因子表達，MKK4 作為JNK 和p38 的直接激活因子，參與細胞凋亡、炎癥和腫瘤發生的調控［16］。有研究表明，通過抑制MKK、JNK 等相關因子表達可進一步抑制炎癥發展［17］。本研究結果顯示，經藥物干預后，參苓白術散可修復結腸組織受損黏膜，減少炎癥細胞浸潤，改善免疫器官指數表達，調控MKK4、MKK7、JNK、激活子蛋白1（AP-1）基因及蛋白表達水平。作為細胞內信號傳導的第三信使，AP-1 是MAPK 激酶級聯反應的靶點，其通過調節基因表達來應對多種刺激，包括細胞因子、生長因子、壓力、細菌和病毒感染，因此AP-1 控制了許多細胞進程，包括分化，增殖和凋亡等［18］；而作為重要免疫因子的IL-17 和IL-2 能通過中性粒細胞的聚集誘導炎癥反應級聯水平，并可通過多種途徑調節免疫刺激和免疫抑制間的平衡，與炎癥性腸病密切相關［19-23］。本研究結果表明，27.9 g/kg 參苓白術散能夠降低模型大鼠結腸組織及血清中炎癥因子IL-2 和IL-17 含量，抑制炎癥因子異常表達。

綜上所述，參苓白術散可能通過調控MKK/JNK通路關鍵分子表達，修復結腸組織受損黏膜，減少炎癥細胞浸潤，其在UC 等相關性疾病的治療中具有一定的應用前景，但炎癥因子的表達調控途徑較多，中藥復方作用機制復雜，其作用靶點仍需進一步探究。