巨噬細胞遷移抑制因子介導缺氧誘導的保護性自噬對肝癌細胞化療敏感性的影響及機制研究①

許羚雁 黃子京 劉玉波 覃 西 韓 誠 （海南省腫瘤醫院檢驗科，海口570000）

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內最常見的腫瘤之一，在我國發病率及病死率均居惡性腫瘤前列［1］。盡管近年HCC臨床診療取得了較大進展，但復發率高，且極易對常規化療藥物耐藥，患者預后仍不理想。而低氧作為實體腫瘤微環境的共同特征，大量研究證實其能夠誘發HCC 細胞對周圍不利環境的適應性應答，為HCC 生存提供巨大的選擇壓力，進而導致腫瘤細胞對化療藥物產生更強的耐藥性［2-3］。但缺氧誘導HCC 耐藥的具體機制尚不清楚。研究表明，自噬是低氧條件下參與HCC 化療的一種保護性方式，且化療誘導的低氧細胞死亡率明顯低于常氧細胞［4-5］。提示自噬參與了低氧誘導化療耐藥性的過程。

巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）最初被認為是一種T 細胞來源的淋巴因子，但近年研究表明MIF具有多種功能，不僅能夠抑制巨噬細胞的遷移抑制作用，還具有強大的免疫刺激和促炎活性［6］。同時，MIF 在多種腫瘤中表達顯著增加，而炎癥對腫瘤形成發揮重要促進作用，如包括HCC 在內的多種癌癥均起源于感染、慢性刺激或炎癥［7-8］。MIF 具有廣泛的促腫瘤活性，不僅能夠增強腫瘤細胞增殖、誘導新生血管形成，還能抑制腫瘤細胞死亡［7］。進一步分子機制研究發現，MIF能夠激活腫瘤細胞缺氧誘導因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）表達，從而調控細胞增殖、存活和轉移［9］。此外，MIF 還能在低氧或饑餓條件下誘導細胞自噬，從而抑制不利環境介導的細胞凋亡［10］。提示MIF能夠在低氧環境中促進腫瘤細胞生存及進展，推測MIF 可能同樣促進低氧條件下HCC 細胞化療耐藥性產生。本研究通過體內實驗進一步闡明HCC 化療耐藥性產生的分子機制，以期為臨床更好地改善HCC 患者預后提供治療靶點和新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料 人HCC 細胞系Huh7、HepG2 購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所；DMEM、胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）；5-氟尿嘧啶（5-flu?orouracil，5-FU）、CCK-8 試劑、青霉素（100 U/ml）與鏈霉素（100 μg/ml，美國Sigma 公司）；靶向敲低MIF表達的siRNA（si-MIF）及隨機對照siRNA（si-NC）和表達上述si-MIF與si-NC序列的慢病毒載體（蘇州吉瑪基因有限公司）；Ki67 免疫組織化學染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；TUNEL 凋亡試劑盒（瑞士Roche公司）；大鼠抗HIF-1α、MIF、LC3-Ⅰ/-Ⅱ單克隆抗體（美國Pierce Biotechnology 公司）；大鼠抗Atg5、GAPDH 單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗大鼠IgG（美國Abcam 公司）；LipofectaminTM2000 轉染試劑（美國Invitrogen 公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Themo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、處理及轉染 Huh7 和HepG2 細胞培養于含10%FBS 與1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基，37 ℃、5%CO2培養。低氧處理的Huh7 和HepG2 細胞采用上述相同培養基于37 ℃、5%CO2、1%O2、94%N2的恒溫低氧培養箱培養。取正常培養條件下生長狀態良好的Huh7 和HepG2 細胞，常規消化，調整細胞密度為1×105個/孔，接種至12 孔板，培養24 h 后，按LipofectaminTM2000 轉染試劑說明書將si-MIF 與si-NC 轉染至Huh7 和HepG2 細胞，正常孵育6 h 后更換為含10%FBS、1%雙抗的DMEM 培養基繼續培養，取轉染24 h 的細胞進行后續實驗。將Huh7 和HepG2 細胞分為4 組：正常對照組（Con?trol，正常培養）、低氧處理組（HYP，低氧條件培養）、HYP+si-NC 組（低氧條件下轉染si-NC）、HYP+si-MIF組（低氧條件下轉染si-MIF）。

1.2.2 CCK-8 檢 測HCC 細 胞 對5-FU 的 敏 感 性取轉染后的Huh7 和HepG2 細胞，調整細胞密度為5 000 個/孔，接種至96 孔板，按1.2.1 分組處理，常氧或低氧條件培養48 h，在培養基中加入一定濃度5-FU（0、10、25、50、100、200、400 μg/ml）繼續培養24 h，培養終止后每孔加入10 μl CCK-8試劑繼續孵育2 h，酶標儀檢測450 nm 處吸光度。各藥物濃度設5 個復孔，計算5-FU 對各組Huh7 與HepG2 細胞的半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 裸鼠體內成瘤實驗 32只4周齡（體質量約15 g）BALB/c 雄性裸鼠購自海南醫學院實驗動物中心，隨機分為4 組（n=8）：Control 組、5-FU 組、5-FU+si-NC 組和5-FU+si-MIF 組。取約5×106個感染si-MIF 或si-NC 慢病毒的Huh7 細胞重懸于200 μl PBS溶液，注射于5-FU+si-NC 組和5-FU+si-MIF 組裸鼠右上肢腋下。Control 組與5-FU 組注射等數量Huh7細胞。5-FU 組、5-FU+si-NC 組和5-FU+si-MIF 組裸鼠腹腔注射5-FU（50 mg/kg），1 次/d，持續7 d。每3 d測量腫瘤體積（腫瘤體積=0.5×長×寬2），觀察30 d后處死小鼠，摘取腫瘤組織，測量后固定，切片，按Ki67 免疫組化及TUNEL 染色試劑盒說明進行組織學檢測。本研究動物實驗經海南省腫瘤醫院動物倫理委員會批準，所有操作嚴格按照國際動物研究指導原則進行。

1.2.4 Western blot 檢測HCC 細胞中HIF-1α、MIF及凋亡相關蛋白LC3-Ⅰ/-Ⅱ、Atg5 表達 取待測細胞或經液氮研磨的腫瘤組織，加入RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑提取總蛋白，上述操作均在冰上完成。4 ℃、1 200 r/min 離心10 min，取底層沉淀，BCA法測定蛋白濃度。取約35 μg 總蛋白進行SDSPAGE 凝膠電泳并轉膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入HIF-1α（1：800）、MIF（1：800）、LC3-Ⅰ/-Ⅱ（1：1 000）、Atg5（1：1 000）、GAPDH（1：2 000）一抗，4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1：5 000）。ECL凝膠成像，觀察蛋白條帶。以GAPDH為內參，Image J軟件進行量化分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0和GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計分析，數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用LSD-t分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低氧誘導HCC細胞HIF-1α與MIF蛋白表達Western blot 結果顯示，隨著低氧處理時間增加，Huh7 與HepG2 細胞HIF-1α 與MIF 蛋白表達逐漸升高。與Control 組相比，低氧處理6 h、12 h、24 h 的HCC 細胞中HIF-1α 與MIF 蛋白顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），HYP 24 h組升高最為顯著（P＜0.01，圖1）。

圖1 低氧促進HCC細胞HIF-1α與MIF蛋白表達Fig.1 Hypoxia promotes protein expressions of HIF-1α and MIF in HCC cells

2.2 轉染siRNA后HCC細胞MIF蛋白表達 Western blot結果顯示，與Control組相比，轉染si-MIF的Huh7與HepG2 細胞MIF 蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），而轉染si-NC 的細胞MIF 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05，圖2）。

圖2 Western blot 檢測轉染siRNA 后HCC 細 胞MIF 蛋白表達Fig.2 Western blot to detect protein expression of MIF in HCC cells transfected with siRNA

2.3 敲低MIF促進低氧條件下HCC細胞對5-FU的敏感性 CCK-8 結果顯示，隨5-FU 濃度增加，Huh7與HepG2 細胞增殖活性均呈降低趨勢。與Control組相比，HYP 組與HYP+si-NC 組5-FU IC50明顯升高（P＜0.05），而HYP+si-MIF 組顯著降低（P＜0.05）；與HYP 組相比，HYP+si-MIF 組5-FU IC50顯著降低（P＜0.05），HYP+si-NC組無明顯差異（P＞0.05，圖3）。

圖3 敲低MIF促進低氧條件下HCC細胞對5-FU的敏感性Fig.3 Knockdown of MIF promotes 5-FU sensitivity of HCC cells under hypoxic condition

2.4 敲低MIF 抑制低氧介導的肝癌細胞自噬Western blot 結果顯示，與Control 組相比，HYP 組與HYP+si-NC 組HIF-1α 和Atg5 蛋 白 表 達 及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯升高（P＜0.05），HYP+si-MIF組顯著降低（P＜0.05）；與HYP組相比，HYP+si-MIF組HIF-1α和Atg5 蛋 白 表 達 及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明 顯 降 低（P＜0.05），HYP+si-NC 組上述蛋白無明顯變化（P＞0.05，圖4）。

圖4 敲低MIF抑制低氧介導的HCC細胞自噬Fig.4 Knockdown of MIF inhibits hypoxia mediated autophagy in HCC cells

2.5 敲低MIF 表達促進5-FU 對裸鼠體內腫瘤生長的抑制作用 肝癌細胞Huh7 裸鼠體內成瘤實驗結果顯示，與Control組相比，5-FU 組、5-FU+si-NC 組和5-FU+si-MIF 組腫瘤體積顯著減小（P＜0.05），而與5-FU 組相比，5-FU+si-MIF 組腫瘤體積明顯減小（P＜0.05），5-FU+si-NC 組無明顯變化（P＞0.05）。各組裸鼠腫瘤組織Ki67 免疫組化及TUNEL 染色結果顯示，與Control組相比，5-FU組、5-FU+si-NC組和5-FU+si-MIF 組Ki67 表達陽性率顯著降低（P＜0.05），而TUNEL 陽性率明顯提高（P＜0.05），5-FU+si-MIF 組Ki67 陽性表達和TUNEL 降低趨勢更為明顯（P＜0.05），5-FU+si-NC組無明顯變化（P＞0.05，圖5）。

圖5 敲低MIF 表達促進5-FU 對裸鼠體內腫瘤生長的抑制作用Fig.5 Knockdown of MIF promotes inhibitory effect of 5-FU on tumor growth in nude mice

2.6 敲低MIF表達抑制裸鼠體內腫瘤自噬 Western blot 檢測各組裸鼠腫瘤組織MIF、HIF-1α、LC3 和Atg5 蛋白表達，結果顯示，與Control 組相比，5-FU組、5-FU+si-NC 組和5-FU+si-MIF 組腫瘤組織MIF、HIF-1α 和Atg5 蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯降低（P＜0.05），5-FU+si-MIF 組中上述蛋白降低趨勢更為顯著（P＜0.05），5-FU+si-NC 組無明顯變化（P＞0.05，圖6）。

圖6 敲低MIF表達抑制裸鼠體內腫瘤自噬Fig.6 Knockdown of MIF inhibits autophagy in nude mice

3 討論

越來越多的證據表明，MIF 作為一種多功能細胞因子能夠參與腫瘤發生的多個方面，包括保護低氧或血清饑餓誘導凋亡促進腫瘤生長、血管生成和遷移等［7，10］。既往研究證實，MIF 在HCC 組織及細胞株中表達異常升高，且能促進腫瘤細胞增殖及血管生成因子表達［11-12］。但能否調控HCC化療敏感性尚不清楚。本研究檢測了低氧條件下MIF 表達，并進一步敲低MIF 觀察其是否影響HCC 細胞對5-FU的化療敏感性，結果表明，低氧能夠促進肝癌細胞中MIF 表達，而敲低MIF 表達能夠在體內外通過抑制低氧介導的自噬改善HCC 細胞對5-FU 的化療抵抗。

腫瘤中的低氧環境是包括HCC 在內多種實體瘤不良預后和化療不理想的重要原因。低氧能夠通過改變基因表達誘導和/或選擇腫瘤細胞某些特性，如復制潛能、干細胞屬性、保護性自噬和化療及放療耐藥性［13］。HIF-1 是一種重要的轉錄因子，通過調控缺氧相關基因表達，促進細胞對缺氧環境的適應性改變。HIF-1主要由缺氧敏感亞基HIF-1α和固定表達亞基HIF-1β組成。常氧條件下，胞質中泛素-蛋白連接酶能夠識別并羥基化HIF-1α 的脯氨酸殘基，使HIF-1α 失活。但缺氧情況下，HIF-1α 脯氨酸殘基羥基化被抑制，導致HIF-1α穩定表達［14］。既往研究證實，細胞內過表達MIF 或細胞外給予人工合成的MIF 均能增加HIF-1α 及相關基因表達，可能與MIF 通過抑制p53 轉錄進而促進泛素-蛋白連接酶對HIF-1α 的作用降低有關，故低氧條件下MIF 通過p53依賴途徑促進HIF-1α穩定表達［9］。但另有研究表明MIF 主要與細胞內信號中間體Jab1/CSN5 相互作用，而Jab1/CSN5 能夠促進HIF-1α 穩定［15-16］。提示低氧環境下MIF 能夠促進細胞HIF-1α 穩定表達。本研究同樣發現缺氧條件下HCC 細胞HIF-1α與MIF 表達同時被激活，且敲低MIF 表達能夠導致HIF-1α 表達降低，與既往文獻結果一致，提示MIF可能通過調控HIF-1α影響HCC細胞相關特性。

機體多種腫瘤組織中均發現了HIF-1α 過表達現象，而高表達的HIF-1α能夠誘導腫瘤細胞上述缺氧特性相關基因激活。大量數據證實，低氧能夠誘導肝癌細胞對化療藥物的敏感性降低［3-5］。本研究同樣發現缺氧條件下的HCC 細胞對5-FU 的敏感性顯著降低。雖然這種現象發生的潛在機制提出了多種觀點，結果仍存在爭議，其中低氧誘導的保護性自噬是目前學者廣泛關注的熱點。自噬是一種高度保守的溶酶體介導的細胞自我降解過程，在細胞存活中發揮雙重作用。但在腫瘤中，主流觀點認為自噬激活是腫瘤細胞在外界不利環境選擇的壓力下向自身提供營養與必需物質以維持生存和發展的重要途徑。因此，抑制自噬能夠降低腫瘤細胞在應激條件下的存活率。最新研究表明，MIF 在多種疾病中能通過上調自噬水平促進疾病發展。如在老年性心臟病研究中，敲除MIF 的小鼠因自噬水平降低加重了衰老誘導的心臟結構與功能不良改變。而阿霉素誘導的心肌細胞早衰卻能被外源性MIF 逆轉［17］。而在幽門螺桿菌相關胃癌中，MIF 能通過促進腸化生組織自噬標志蛋白LC3 與Atg5 表達加速細胞惡化［18］。本研究發現，敲低HCC 中MIF表達能在體內外抑制細胞或腫瘤組織自噬，還可能通過這一作用促進5-FU對HCC的殺傷抑制能力。

綜上，HCC 的低氧環境能夠促進MIF 表達上調，而敲低MIF 表達可能通過抑制腫瘤細胞及組織HIF-1α 介導的保護性自噬促進HCC 化療敏感性。提示MIF 可能在HCC 的化療耐藥性形成中發揮潛在促進作用，而MIF/HIF-1α/自噬軸有望成為改善HCC預后的治療靶點。