抗相思子毒素抗體的嵌合改造與功能評價

彭靜怡 俞旖湉 杜尚男 柴立輝 喬春霞

（河南大學基礎醫學院抗體藥物開發技術國家地方聯合工程實驗室，開封475004）

相思子毒素（Abrin）是一種從豆科、相思子屬植物相思子豆種子中提取的毒素蛋白，與蓖麻毒素（Ricin）同屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白（ribosome-acti?vating proteins，RIPs）家族［1］。Abrin 包括a、b、c、d 4 類，分子量為63～67 kD，是一種異二聚體蛋白，由具有N-糖苷酶活性的A 鏈和半乳糖特異性凝集素B鏈組成［2-3］。其B 鏈可與細胞表面β-D-半乳糖苷部分結合，介導毒素內化/內吞進入宿主細胞。入胞后，毒素的A、B 鏈分離，A 鏈進入核糖體水解28S 核糖體RNA的N-糖苷鍵，導致核糖體失活并抑制蛋白合成，從而引起細胞凋亡［4］。不同細胞中，Abrin 引起細胞死亡的原因不同。Jurkat 細胞中，Abrin 通過發揮蛋白合成抑制（protein synthesis inhibition，PSI）作用引起細胞線粒體應激或內質網應激，從而激活胱天蛋白酶途徑誘導細胞程序性凋亡［5-6］；而在U266B1 細胞中，Abrin 作用于細胞后引起PSI，導致溶酶體膜通透性改變并釋放組織蛋白酶，引起細胞壞死［7］。已知Abrin A 鏈的活性中心由Y74、V75、Y113、E164和R167等殘基構成，中和性抗體可通過封閉其活性位點或形成位阻效應發揮中和作用［8］。

Abrin 可通過多種方式進入體內，如注射、吸入或吞食等，中毒后臨床表現為胃腸道癥狀和血管滲漏，引發全身毒性、多器官衰竭甚至死亡［9］。Abrin來源廣泛，缺乏有效解毒劑且毒性較Ricin 更強，因此被美國疾控中心定義為B 類生物戰劑［10］。目前，針對Abrin 中毒患者的主要治療方式為對癥治療，必要時可給予血液凈化，也有報道提出可通過被動免疫預防Abrin 中毒［11］。基于雜交瘤技術篩選出的D6F10和A7C4是兩株已報道的鼠源特異性抗Abrin中毒的中和性單克隆抗體，在體內/外均有中和保護效果［12-13］。突變分析發現，D6F10 識別的中和表位為Thr112、Gly114和Arg118殘基，位于Abrin A 鏈活性中心附近，因此可阻斷Abrin 活性，逆轉Abrin 對蛋白合成的抑制作用［14］。而A7C4識別的位點離Abrin A鏈活性中心較遠，且共聚焦分析發現抗體會隨著毒素一同入胞，因此推測A7C4 是通過其他胞內中和方式抑制毒性［13］。此外，MECHALY 等［15］通過免疫家兔構建了免疫單鏈抗體噬菌體展示文庫，從中篩選并嵌合改造得到一組結合活性高的單克隆抗體，也可發揮保護作用，可見中和抗體可成為良好的相思子中毒特異性解毒劑。但目前針對這一毒素得到的中和抗體多為通過免疫等手段得到的異源單抗，由于存在較大副作用（如人抗鼠抗體反應等）并不能直接用于人體，需要對其進行人源化改造，降低其免疫原性［16］。抗相思子鼠源單抗（中國發明專利申請號：202110764514.4）屬于IgG1 型κ 鏈抗體，主要作用于Abrin A 鏈，具有良好的體內/外中和活性。本研究取鼠源單克隆抗體可變區基因序列，在此基礎上通過抗體嵌合表達載體進行抗體Fc 段改造，制備了4 株抗Abrin 人源化嵌合單抗，證實僅H1L1 為配對正確且具有良好中和活性的抗體，為Abrin 中毒的臨床防治、應對突發中毒事件提供了選擇。

1 材料與方法

1.1 材料 Abrin 毒素購自博雷德公司；鼠源抗Abrin單克隆抗體、pET28a載體質粒、大腸桿菌BL21（DE3）、抗體嵌合表達載體pFRT-KIgG1（基于pcD?NA-FRTTM載體（Invitrogen 公司，貨號：V601020）由本課題組儲存改造；Jurkat 細胞、SP2/0 細胞購自ATCC；CCK-8 試劑盒（貨號：SC675）購自Dojindo 公司；DMEM、1640 培養基、ExpiCHO-S 細胞和Expi?CHOTM表達系統試劑盒（貨號：A29133）購自Gibco公司；基因合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠IgG 和山羊抗人IgG、ELISA 顯色液均購自北京天根生物公司；TNT?Coupled Reticulocyte Lysate Systems（貨號：L4610）、Luciferase Assay System Kits均購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；Tru-StainFcXTM（抗小鼠CD16/32 和抗人IgG 受體）購自Biolegend 公司；Alexa-FlourTM488 標記的Abrin 由嘉暄生物（北京）合成；雌性BALB/c 小鼠（6～8 周齡）購自北京維通利華公司。

1.2 方法

1.2.1 人源化嵌合抗體質粒構建與表達 經常規RNA提取、反轉錄、PCR及測序等步驟分別得到2條鼠源抗Abrin 單克隆抗體的輕鏈和兩條重鏈序列，交叉配對，分別克隆入人源化IgG1 表達載體pFRTKIgG1，得到表達4 種不同抗體段全抗表達的質粒，利用ExpiCHOTM培養表達培養基轉染ExpiCHO-S 細胞，37 ℃、125 r/min搖瓶培養8～9 d，收集細胞上清。

1.2.2 人源化嵌合抗體純化與定量 將Protein A Sepharose 親和層析柱連接至蛋白純化儀（AKTA prime plus，GE Health），收集細胞上清，1.5 ml/min上樣純化，洗脫收集的目的蛋白即為人源化嵌合抗體H1L1 等。用30 kD 截留孔徑的50 ml 超濾管對洗脫液進行緩沖液置換和超濾濃縮，獲得純化蛋白。采用PierceTMBCA Protein Assay Kit 進行純化抗體的濃度定量；按照說明書在96孔板中將待測樣品和標準品BSA 進行稀釋，試劑盒A 液和B 液按50：1 配制工作液，在反應孔中加入200 μl工作液和25 μl稀釋好的標準品或樣品，37 ℃恒溫培養30 min，取出后測量562 nm 處吸光度，繪制標準曲線，計算待測蛋白濃度。

1.2.3 間接ELISA測定人源化嵌合抗體與Abrin的結合能力 0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH=9.6）稀釋Abrin 至2 μg/ml（100 μl/孔），包被于ELISA 板，4 ℃孵育過夜，含0.2%吐溫-20 的PBS 清洗3 次，37 ℃、200 μl 5%PBS 脫脂牛奶封閉2 h，洗滌，100 μl/孔加入稀釋抗體37 ℃孵育1 h，洗滌，加入100 μl HRP標記的山羊抗人IgG（1：4 000）或HRP 標記的山羊抗鼠IgG（1：6 000），室溫避光孵育45 min，加入TMB 底物緩沖液發生酶促反應，添加100 μl終止液（H2SO4）終止反應，微量滴定板讀取器測定450 nm 處吸光度。所有實驗孔均設置平行對照，實驗重復3次。

1.2.4 ForteBio 測定人源化嵌合抗體與Abrin 的親和力 生物層干涉法（BLI）定量分析嵌合抗體與Abrin 的親和力。采用Anti-Human IgG Fc Capture（AHC）生物傳感器捕獲人源化嵌合抗體及鼠源抗體，含0.2%吐溫-20 的PBS（PBST）稀釋Abrin（從200 nmol/L 到3.13 nmol/L），初始基線和固定步驟時間設置為60 s，結合時間為180 s，解離時間為300 s；生物傳感探針用10 mmol/L 甘氨酸鹽酸溶液（pH=1.7）脈沖5 s，重復3 次，將得到的數據導入分析軟件進行動力學分析，生成動力學數據KD（平衡解離常數）。

1.2.5 CCK-8 測定細胞水平抗體中和毒素效果CCK-8 試劑盒測定嵌合抗體保護Abrin 染毒Jurkat、SP2/0 細胞的中和保護作用。1640 或DMEM 培養基重懸Jurkat 細胞或SP2/0 細胞，2×105個/孔接種于96 孔板（50 μl/孔）；將梯度稀釋的純化抗體與Abrin共同加入反應孔（各25 μl）37 ℃孵育48 h，加入CCK-8 試劑孵育2～6 h，微量滴定板讀取器中測定450 nm 處吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（陽性對照組OD值-空白對照組OD值）×100%，處理數據并制作曲線圖，所有實驗孔均設置平行對照，實驗重復3次。

1.2.6 無細胞體系檢測抗體拯救熒光素酶合成實驗 Abrin A 鏈序列由UniProt查詢得到（UniProtKB：P11140.2），轉至pET28a載體質粒，測序鑒定正確后轉入大腸桿菌BL21（DE3），擴增培養、超聲裂解等步驟后，利用鎳親和層析柱純化蛋白，所得純度達95%。不同劑量Abrin A 鏈（從1 μg/ml到0.1 ng/ml）加至Rabbit Reticulocyte Lysates 反應體系（總反應體系為50 μl，包括T7 聚合酶、T7 DNA 模板等），30 ℃孵育90 min，取2.5 μl與50 μl熒光素酶測定試劑混合，立即在熒光讀數器測熒光值。設置不加T7 DNA模板的陰性對照和不加Abrin 的陽性對照。固定Abrin濃度為20 ng/ml，將Abrin A鏈與不同濃度抗體（從10 μg/ml 到1 ng/ml）共同加至Rabbit Reticulo?cyte Lysates 反應體系（50 μl），30 ℃孵育90 min，取2.5 μl與50 μl熒光素酶測定試劑混合測定熒光值。設置不加抗體的陰性對照和不加Abrin的陽性對照。

1.2.7 抗體體內保護效果 6～8 周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.25 mg/kg Abrin，同時注射不同濃度純化抗體，觀察150 h 并記錄小鼠存活情況，繪制生存曲線。

1.2.8 流式細胞術分析抗體是否阻斷Abrin 結合細胞 收集1×106個Jurkat 細胞于1.5 ml EP 管，FACS洗液（含2%血清的PBS）清洗2次，細胞表面受體封閉劑TruStainFcXTM室溫孵育10 min，將標記Alexa-488 的Abrin 與不同濃度抗體加至細胞（總反應體系為100 μl），4 ℃孵育1 h，預冷PBS 清洗2 次，300 g 離心5 min，收集細胞，含1%多聚甲醛的PBS固定細胞20 min，FACScan（Becton Dickinson）進行流式分析，設置裸細胞對照、未標記Abrin 與Alexa-488標記Abrin競爭結合細胞對照。

1.3 統計學分析 采用Graphpad8.2.1 軟件進行統計學分析，實驗數據以xˉ±s 表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way），實驗重復3 次，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗體基因釣取及嵌合抗體構建與表達 從雜交瘤細胞株10D8中測序得到2條輕鏈可變區和2條重鏈可變區序列，這一現象是可能的，但較為罕見。經細胞株亞克隆和再次測序排除了亞克隆不徹底的因素，測序結果證明10D8 中確實存在以上4 條抗體可變區序列，推測這4 條基因可能均整合了細胞染色體，形成了“四倍體”細胞株；同時猜測自由組合得到的4 種抗體中，可能2 種抗體是天然配對正確的抗體分子，僅有1 種具有中和活性。基于以上推測，分別合成了4條序列，經交叉配對分別克隆入人源抗體表達載體pFRT-KIgG1載體，成功構建了4種抗體的真核表達載體并轉染CHO-S 細胞，實現搖瓶表達，搖瓶培養8～9 d 后收集上清，Protein A Sepha?rose 親和層析柱純化，成功得到H1L1、H1L2、H2L1、H2L2 人源嵌合抗體，且表達穩定，產量較高。BCA定量試劑盒定量純化抗體的濃度為1.5～3.5 mg/ml。

2.2 人源化嵌合抗體的體外結合功能 梯度稀釋純化的4種嵌合抗體與包被的Abrin反應，OD450結果顯示，隨著抗體濃度升高，其中3 株抗體與Abrin 結合相應加強，顯示抗體活性良好，具有明顯劑量依賴性。這3 株抗體結合的EC50分別為（0.121 2±0.004 0）μg/ml（H1L1）、（0.441 7±0.000 4）μg/ml（H1L2）、（0.127 7±0.002 0）μg/ml（H2L2），其 中H1L1、H2L2抗體與母本10D8抗體［EC50=（0.158 25±0.002 35）μg/ml］的結合能力接近（圖1）。

圖1 嵌合抗體與Abrin結合的能力Fig.1 Ability of chimeric antibody to bind Abrin

2.3 人源化嵌合抗體的親和常數 被生物傳感器芯片捕獲的純化抗體與梯度稀釋的Abrin 結合或解離過程中，記錄分子結合面信號變化，動力學軟件繪制曲線（圖2），所得親和常數分別為3.97×10-10M（H1L1）、3.94×10-8M（H1L2）、3.55×10-8M（H2L1）、5.25×10-8M（H2L2）。可見，4種嵌合抗體中，僅H1L1的結合和解離曲線具有明顯抗原-抗體作用特征，親和常數與10D8（5.59×10-10M）最為接近；其他3 種抗體結合的動力學曲線不穩定，推測這些抗體輕、重鏈可變區可能不匹配，從而影響了Fv 構象穩定性，或抗體與抗原結合不強，不易形成穩定復合物。

圖2 嵌合抗體結合動力學曲線Fig.2 Kinetic curve of chimeric antibody

2.4 嵌合抗體在體外細胞保護試驗中的作用 梯度稀釋的純化抗體與Abrin混合，與Jurkat細胞孵育48 h后CCK-8檢測細胞活力，結果如圖3所示，僅嵌合抗體H1L1可有效保護Abrin殺傷的Jurkat細胞，且這一保護具有劑量依賴性［EC50=（3.745 5±0.057 5）ng/ml］，約為母本抗體10D8［EC50=（1.582 5±0.533 5）ng/ml］的42%，其他3株抗體均無中和活性。

圖3 嵌合抗體在Jurkat細胞內中和毒素的效果Fig.3 Effect of chimeric antibody on neutralization of toxin in Jurkat cells

2.5 嵌合抗體在無細胞體系中阻礙Abrin A 鏈PSI A 鏈為Abrin 的毒素鏈，20 ng/ml Abrin A 鏈可抑制至少60%熒光素酶蛋白合成（圖4），而加入具有中和作用的嵌合抗體H1L1和10D8后均能促進熒光素酶合成，逆轉Abrin 的PSI，且隨抗體濃度升高，熒光素酶合成量增多（圖5）；其中H1L1 的EC50=（0.672 9±0.075 5）μg/ml，母 本 抗 體10D8 EC50=（1.036 5±0.004 5）μg/ml。

圖4 Abrin A鏈的PSI作用Fig.4 PSI effect synthesis of Abrin A chain

圖5 嵌合抗體劑量依賴性恢復蛋白合成Fig.5 Chimeric antibody recovers protein synthesis in a dose-dependent manner

2.6 嵌合抗體的體內保護效果 小鼠腹腔注射Abrin，同時在腹腔另一側注射不同劑量純化抗體，連續觀察150 h 并記錄小鼠生存情況（圖6），單純毒素中毒組（對照組）小鼠給藥40 h 后死亡，而用低劑量嵌合抗體H1L1和10D8治療的小鼠死亡時間相對延長，且提高抗體劑量后小鼠存活率也明顯提高，50 μg/kg H1L1 或10D8 給藥均能完全保護小鼠，存活率為100%，顯示H1L1 具有良好的體內中和活性。

圖6 嵌合抗體體內保護作用Fig.6 Protective effect of chimeric antibody in vivo

2.7 嵌合抗體不抑制Abrin 黏附或進入細胞Abrin通過其B 鏈與細胞表面糖苷鍵結合，黏附并進入細胞，當標記Alexa-488 的Abrin 與嵌合抗體或未標記的Abrin（對照）共同孵育后，流式細胞術分析發現，高濃度嵌合抗體H1L1 或10D8 并不能有效抑制或促進Abrin 與細胞黏附或進入細胞的功能（圖7），而未標記的Abrin 則可抑制標記毒素與細胞結合，推測H1L1 和10D8 并不阻礙毒素入胞，而是可能在胞內通過阻礙Abrin 毒性位點或干擾下游信號分子發揮中和作用。

圖7 嵌合抗體的體內保護作用Fig.7 Protective effect of chimeric antibody in vivo

3 討論

Abrin 與Ricin 均為植物源性蛋白毒素，能夠通過水解N-糖苷鍵抑制蛋白合成，有極強的細胞毒性。Abrin 來源廣泛且易制備，與Ricin 共同被認為可能被用作恐怖襲擊的生物戰劑。為維護我國國防安全、應對公眾突發中毒事件，需要針對Abrin 開展防治研究。目前，針對Abrin 中毒的救治多為支持性護理，而已報道的幾株中和性抗體多為動物源性，臨床使用會引起較強免疫排斥反應，副作用較大，而能夠直接用于人體的人源化抗體或嵌合抗體則可減弱排異反應等帶來的不良癥狀。

隨著抗體技術革新，人源化抗體構建、表達與應用已十分成熟。本研究從一株具有良好活性的雜交瘤中釣取了2 條重鏈和2 條輕鏈可變區。為確定有效序列，排除“共生”的無效序列段干擾，對這4 條序列進行交叉配對，利用表達人源化全長IgG1的pFRT-KIgG1 載體完成了4 種備選抗體的嵌合改造，逐一考察了每種抗體的體內、外生物學活性。最終確定H1L1 抗體結合活性與鼠源母本抗體相似，且擁有較好的細胞和動物體內中和保護效應；而其余3株抗體活性較弱，原因可能為輕、重鏈可變區本身結構不穩定，或配對的輕、重鏈可變區間不匹配，導致全分子抗體三維構象極不穩定，從而影響了與抗原Abrin的結合和解離。

綜上，本研究得到的4 株嵌合抗體中，僅H1L1為配對正確且活性良好的候選抗體，具有良好體內中和保護作用，因此可進一步優化和開發，希望得到可用于Abrin 中毒急救或應急防控的候選抗體藥物。