基于非靶向代謝組學(xué)鑒別釀造白酒與勾兌酒

◎ 包塔娜，楊 洋，王柏輝

（鄂爾多斯市檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000）

我國傳統(tǒng)工藝釀造的白酒，歷史悠久、香型眾多、口味各異。清香型白酒因其口感清香純正、口味柔和、余味凈爽等風(fēng)味特征受到消費者青睞。伴隨著精密分析儀器的發(fā)展，色譜、光譜、質(zhì)譜等技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于白酒風(fēng)味物質(zhì)、香型、年份酒以及真假酒的鑒別中[1]。卓俊納等[2]利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)鑒別不同品牌醬香型白酒，研究表明，Na、Ca、Al、K 等元素是造成不同品牌醬香型白酒差異性的主要無機(jī)元素。莫新良等[3]基于頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對不同甜香風(fēng)味特征醬香型白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行剖析，共鑒定出68 種風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類27 種、醇類12 種、醛酮類10 種、酸類3 種、芳香族化合物10 種和萜烯類物質(zhì)6 種。卓俊納等[4]基于氣相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)建立3 種白酒（濃香型、醬香型和清香型）的3 種判別模型，研究表明偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）模型的區(qū)分效果最好，同時指出己酸乙酯、乳酸乙酯等9 種物質(zhì)是區(qū)分不同香型白酒風(fēng)味差異的主要物質(zhì)。CAJKA 等[5]基于高分辨質(zhì)譜和實時檢測技術(shù)分析啤酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，再利用偏最小二乘判別分析法建立判別模型，該模型的鑒別準(zhǔn)確度能達(dá)到100%，該判別模型對于啤酒產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別具有較高的參考價值。

非靶向代謝組學(xué)技術(shù)是以無偏向的方式分析尋找盡可能多的組分，再通過統(tǒng)計學(xué)方法尋找能夠反映組間差異的特征化合物，從而對不同個體之間的差異作出判別，已被廣泛應(yīng)用于食品成分分析、食品摻假鑒定、品質(zhì)鑒別以及食品產(chǎn)地溯源等方面。JIANG等[6]利用代謝組學(xué)技術(shù)分析了不同品種荔枝果肉中多酚類代謝物的差異，試驗結(jié)果表明，共鑒定出8 類126 種多酚代謝物，并推斷出荔枝果肉中主要多酚代謝產(chǎn)物為黃酮類、黃酮醇類、羥基肉桂酰類和兒茶素類。YE 等[7]基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析不同地區(qū)綠茶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)合主成分分析對綠茶產(chǎn)地進(jìn)行鑒別。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地來源的綠茶中揮發(fā)性物質(zhì)的含量差異顯著，可建立用于綠茶產(chǎn)地溯源的方法。DE-FLAVIIS 等[8]采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對6 個地區(qū)小麥風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行檢測研究，共得到158 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，通過化學(xué)計量學(xué)方法對不同產(chǎn)地的小麥進(jìn)行分類，篩選出各產(chǎn)地最具特征性的揮發(fā)性風(fēng)味成分，為探索產(chǎn)地區(qū)域?qū)π←滐L(fēng)味品質(zhì)的影響提供了理論依據(jù)。

本文利用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)探究釀造白酒和勾兌酒的特征標(biāo)記物質(zhì)，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)建立OPLS-DA 判別模型，可為白酒鑒別和品質(zhì)評定提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市場采購3 種釀造白酒（編號為BL1、BL2和BL3）和3 種勾兌酒（編號LFL1、LFL2和LFL3）。

甲酸（質(zhì)譜純）、甲醇、甲酸銨（色譜純），美國Fisher 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Exion 20AD 型超高效液相色譜儀和Xevo G2-XS型高分辨四極桿飛行時間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters 公司）；Sorvall Legend Micro 17R 型離心機(jī)（美國賽默飛有限公司）；艾科普超純水機(jī)A3S-05-05-CE（美國Millipore 公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

6 個白酒樣品分別取5 mL，在3 000 g、25 ℃條件離心10 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，收集過濾后樣品于進(jìn)樣瓶中，4 ℃保存待測。

1.3.2 色譜條件

Waters T3 液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A- 水（含0.1% 甲酸）、B- 乙 腈（含0.1% 甲 酸）；流 速：0.35 mL·min-1；進(jìn)樣體積：2 μL。梯度洗脫：0 ～2.5 min，95% A；2.5 ～4.0 min，70% A；4.0 ～9.0 min，50% A；9.0 ～11.0 min，20% A；11.0 ～14.0 min，0% A；14.0 ～15.0 min，0% A；15.0 ～15.1 min，95% A；15.1 ～16.0 min，95% A。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；電離模式：正離子模式；氣體溫度：320 ℃；保護(hù)氣溫度：350 ℃；干燥器流速：7.5 L·min-1；保護(hù)氣流速：12 L·min-1；噴霧氣壓：35 psi（145 psi=1×106Pa）；離子源毛細(xì)管電壓：4 000 V；噴嘴壓力：1 000 V；MS-TOF 毛細(xì)管電壓：175 V；一級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍（m/z）：100 ～3 000。

1.4 數(shù)據(jù)處理

下機(jī)數(shù)據(jù)通過Abf Converter 軟件轉(zhuǎn)換為.ABF 數(shù)據(jù)格式，再利用MS-DIAL 軟件進(jìn)行峰檢測和識別、反卷積、定性分析等一系列處理，然后基于HMDA 和MASS BANK 數(shù)據(jù)庫對所檢測到物質(zhì)進(jìn)行定性分析，并進(jìn)行歸一化處理得到數(shù)據(jù)。通過SIMCA 軟件分析數(shù)據(jù)，以O(shè)PLS-DA 模型第一主成分的VIP值＞1，T檢驗返回的P值＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選釀造白酒和勾兌酒的差異代謝物，并計算出兩組間差異代謝物的變化倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C），即勾兌酒與釀造白酒中差異代謝物的比值。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 OPLS-DA 分析

非靶向代謝組學(xué)分析得到大量的多維數(shù)據(jù)，為探究數(shù)據(jù)中存在的潛在規(guī)律，需要借助一系列的多元統(tǒng)計分析方法進(jìn)行降維處理和分析。本實驗采用SIMCA軟件對所有白酒樣本進(jìn)行有監(jiān)督OPLS-DA 分析。由圖1 可知，釀造白酒和勾兌酒能較好的區(qū)分開，各組聚類趨勢較為明顯。

圖1 白酒樣本的OPLS-DA 分析圖

2.2 發(fā)酵酒與勾兌酒代謝物差異分析

由表1 可知，兩種類型的白酒中化合物含量表達(dá)差異明顯，可作為區(qū)別其他類型白酒的重要標(biāo)志物。本文白酒樣品中共鑒定到46 種風(fēng)味化合物，最終鑒定到釀造白酒與勾兌酒間的差異代謝物共15 種。其中，6 種化合物（FC值＞1）是勾兌酒的標(biāo)記物，9 種化合物（FC值＜1）是釀造白酒的標(biāo)記物。次黃嘌呤（Hypoxanthine）在勾兌酒中表達(dá)差異明顯，4-甲基戊酸（4-Methylvaleric acid）和羥基丁二酸（Hydroxysuberic acid）在釀造白酒中表達(dá)差異明顯，可分別作為兩種白酒的鑒定標(biāo)志物。

表1 釀造白酒與勾兌酒的代謝物差異分析表

3 結(jié)論

本論文基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對釀造白酒和勾兌酒的風(fēng)味化合物進(jìn)行篩查分析，利用組學(xué)思維對兩種類型的白酒進(jìn)行鑒別分析。白酒樣品中總共鑒定出46 種風(fēng)味化合物，兩種類型白酒中差異化合物15種。其中，釀造白酒中4-甲基戊酸和羥基丁二酸為主要標(biāo)識物；而勾兌酒中次黃嘌呤為主要標(biāo)識物。通過OPLS-DA 分析能夠很好地區(qū)分釀造白酒和勾兌酒。因此，依據(jù)不同酒型的風(fēng)味特征，綜合應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，建立標(biāo)準(zhǔn)化白酒產(chǎn)品真實性鑒別平臺是檢測機(jī)構(gòu)的研究發(fā)展方向。