棉鈴蟲CCE001a蛋白結構與功能的生物信息學分析

張莉 王海亮 馬雪兒 ?？←?陳程 張文舉

摘要 [目的]深入預測CCE001a蛋白結構與生物學功能。[方法]使用生物信息學方法預測CCE001a基因所編碼的蛋白質，預測其功能與結構。[結果]該蛋白的總氨基酸殘基數為556個，分子式為C2865H4321N737O811S23，蛋白的等電點pI為5.32，帶正電的氨基酸殘基（Arg+Lys）為58 個，帶負電的氨基酸殘基（Asp+Glu）為75個，蛋白不穩定系數為35.22，脂肪系數為75.91，總平均親水性系數為-0.262;CCE001a蛋白有一個脫氫酶超家族（cl21494）結構域;經分析顯示，α-螺旋、無規律的卷曲是這種蛋白質的主要二次結構，分別占31.35%和46.49%，還包括3.96%的β-轉角和18.20%的擴展延伸鏈。經過三級結構學預測表明，該蛋白包括α-螺旋、β-轉角;該蛋白亞細胞被確認為定位在內質網內，存在著信號肽的序列，初步可以認為是具有分泌力的親水蛋白，且沒有出現跨膜蛋白，共有37個磷酸化位點，1個N-糖基化位點。[結論]該研究可為研究CCE001a的解毒機制提供理論基礎。

關鍵詞 CCE001a;羧酸酯酶;解毒;蛋白質修飾位點;生物信息

中圖分類號 S 435.622+.3? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）01-0102-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.026

Bioinformatics Analysis of the Protein Structure and Function of Helicoverpa armigera CCE001a

ZHANG Li， WANG Hai-liang， MA Xue-er et al

（College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832000）

Abstract [Objective]In order to further predict the protein structure and biological function of CCE001a.[Method]This study used a bioinformatics method to predict the protein encoded by this gene， and predict its function and structure. [Result] The prediction results show that the total number of amino acid residues of the protein is 556， its molecular formula is C2865 H 4321N737O811S23， the isoelectric point pI of the protein is 5.32， and the positively charged amino acid residues （Arg+Lys） are 58， which are negatively charged. There are 75 amino acid residues （Asp+Glu）， protein instability coefficient is 35.22， fat coefficient is 75.91， total average hydrophilicity coefficient is -0.262; CCE001a protein has a dehydrogenase superfamily （cl21494） domain; analysis shows that α-helix and irregular coils are the main secondary structures of this protein. They account for 31.35% and 46.49%， respectively， including 3.96% of β-turns and 18.20% of extended stretched chains. After tertiary structural prediction， it is shown that the protein includes α-helix and β-turn; the protein subcellular is confirmed to be located in the endoplasmic reticulum， and there is a signal peptide sequence， which can be initially considered as secretory Hydrophilic protein， and no transmembrane protein， a total of 37 phosphorylation sites， one N-glycosylation site. [Conclusion]This study can provide a theoretical basis for studying the detoxification mechanism of CCE001a.

Key words CCE001a;Carboxylesterase;Detoxification;Protein modification sites;Biological information

基金項目 國家自然科學基金“棉鈴蟲棉酚降解酶的高活性篩選及其酶學特性與降解機理”（31860660）;石河子大學高層次人才科研啟動資金專項“基于棉酚降解相關基因的熱帶假絲酵母遺傳轉化及應用項目”（RCZK2019）。

作者簡介 張莉（1997—），女，甘肅天水人，碩士研究生，研究方向：飼料資源的開發與利用。

通信作者：陳程，講師，從事飼料資源的開發與利用研究;張文舉，教授，從事飼料資源的開發與利用研究。

收稿日期 2021-05-24;修回日期 2021-06-11

羧酸酯酶（CarEs）是一類主要的解毒酶，與各種昆蟲的抗藥性有關[1]。羧酸酯酶普遍存在于動物、植物和微生物中，在包括羧酸酯在內的異生化合物水解成相應的醇和羧酸的過程中發揮著關鍵作用[2]。昆蟲中參與多種類型殺蟲劑解毒作用的物質可能是1個或多個酶系，這些殺蟲劑包括擬除蟲菊酯、有機磷和氨基甲酸酯。在人類大量使用有機磷、擬除蟲菊酯殺蟲劑的形勢下，對棉花危害較大的害蟲棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）產生了較嚴重的抗藥性[3]。CarEs是一類主要負責異生素化學物質的解毒酶，因此在棉鈴蟲抗藥性中起關鍵作用[4]。次生代謝物是植食性昆蟲及其寄主植物共同進化中的一組重要介質。由于其幼蟲在棉花上覓食和生長，棉鈴蟲可通過解毒和螯合機制耐受棉花植物產生的主要防御代謝物棉酚[5]。當受到昆蟲攻擊時，宿主植物會產生次生代謝物作為防御的一部分，而昆蟲在進食時會產生解毒酶來抵消次生代謝物。通常情況下，代謝排毒途徑一般可以分為3個階段。第1階段的酶，細胞色素P450單加氧酶或羧酸酯酶直接作用于毒素分子，增加其官能團的親水性和反應性。第2階段，疏水性和毒性化合物通過谷胱甘肽 S-轉移酶（GSTs）的作用轉化為親水性產物，促進其排泄。最后，依靠ATP結合盒（ABC）和主要的膜轉運蛋白主動將結合的異源物質泵出細胞[6-7]。數據表明，在棉鈴蟲中至少發現了40種羧酸酯酶[7]。目前，殺蟲劑代謝產生活性CarEs的另一種方法是利用異源表達系統。迄今為止，已經用桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞（Sf9）中表達了來自棉鈴蟲GR菌株的若干CarEs[8]，然而，由于昆蟲細胞內細胞生長緩慢和表達水平低，只能產生有限數量的酶。一些昆蟲基因已經在大腸桿菌系統中進行了功能性表達。例如，利用這種異源表達系統，來自庫蚊的突變B1酯酶顯示出對4種有機磷酸酯殺蟲劑的水解酶活性[9]。蘋果蠹蛾的CpCE-1能夠代謝乙酰甲胺磷[10]。靳明輝[11]采用qPCR技術篩選6個候選基因，采用qPCR技術對棉鈴蟲取食棉酚后6個候選基因的表達變化進行了研究，CCE001a基因表達量顯著上調（P<0.05），由此可知，基因CCE001a與棉鈴蟲代謝棉酚有關。因此，了解棉鈴蟲羧酸酯酶CCE001a蛋白質生化特性和生物活性功能，可能會大大促進對棉鈴蟲羧酸酯酶解毒棉酚機制的理解。

1 材料與方法

棉鈴蟲CCE001a蛋白的生物信息學分析內容和使用的軟件及網站見表1[12]。

2 結果與分析

2.1 CCE001a蛋白理化性質

CCE001a 蛋白酶的理化特性是通過 ExPASy在線工具 Protparam 來分析，通過分析表明，棉鈴蟲 CCE001a 的相應分子質量為62 802.66。由表2可知，棉鈴蟲CCE001a 共含20種氨基酸。該基因所編碼的蛋白質氨基酸總計556個，分子式為C2865 H 4321N737O811S23，蛋白等電點PI為5.32，不穩定系數計算為35.22，故將其歸類為穩定性蛋白;帶正電荷的氨基酸殘基總數（Arg + Lys）為58個，帶負電荷的氨基酸殘基總數（Asp + Glu）為75個，脂肪系數為75.91;親水性的平均值（GRAVY）為-0.262，為親水性蛋白。

2.2 CCE001a蛋白保守區域預測

該蛋白的保守序列如圖1所示，發現22～530有1個共酯酶家族（PF00135）結構域，在118～206有1個脫氫酶家族（PF07859）結構域。

2.3 CCE001a蛋白二級結構及三級結構的預測

CCE001a蛋白二級組成體系運用SOPMA 網絡軟件工具進行分析和預測，該蛋白二級結構中，α-螺旋（alpha helix）占31.35%，β-轉角（beta turn）占3.96%，無規則卷曲（random coil）占46.49%，擴展鏈（extended strand）占18.20%（圖2）。該蛋白的三級結構（圖3）由Phyre2在線預測，該預測模型的蛋白覆蓋率為 100%，可信度為 92%。

2.4 CCE001a蛋白亞細胞定位預測

使用PSOR在線工具分析該蛋白的亞細胞定位，結果顯示，CCE001a基因編碼蛋白主要定位在內質網中，內質網中含有很多參與不同類型解毒作用的酶系，從結合棉鈴蟲對殺蟲劑及植物次生代謝產物來看，CCE001a可能會參與解毒作用，通過氧化還原、水解或結合等反應來代謝有毒的外源物質，或將其轉化成為無毒物質排出體外。

2.5 CCE001a蛋白氨基酸序列信號肽預測

使用SignalP4.0 Server在線分析，發現該蛋白存在一個信號肽，存在位置為第17個氨基酸處（圖4），初步認為該蛋白為分泌型蛋白。

2.6 CCE001a的蛋白質親疏水性

經在線分析，預測結果見圖5。CCE001a蛋白的親水性均值（GRAVY）為-0.262，疏水指數最大值為3.011，位于第11位氨基酸上，最小為-2.922，位于第35位氨基酸上。CCE001a蛋白的親水性氨基酸范圍大于疏水性氨基酸范圍，故將該預測蛋白歸屬為親水性蛋白。

2.7 CCE001a的蛋白質跨膜區的預測

通過TMHMM在線軟件對該蛋白質的跨膜螺旋區進行分析，結果如圖6所示，CCE001a蛋白的跨膜螺旋區間數為0，且其跨膜螺旋內氨基酸的數目很小，故該蛋白質未形成一定的跨膜結構區，但由于CCE001a蛋白的特殊結構，該預測結果結合親水性分析結果，表明棉鈴蟲CCE001a基因編碼蛋白為親水性蛋白，不含有跨膜區。

2.8 CCE001a蛋白磷酸化位點

這一編碼蛋白包括15處絲氨酸（serine，s）、16處蘇氨酸（threonine，t）、6處酪氨酸（tyrosine，y）磷酸化定位（圖7）。蛋白N-糖基化位點經 NetNGlyc 1.0在線分析軟件預測，結果顯示評分高于 0.50的位點僅有1個，位于114位的N-Gly（圖8）。

3 討論

棉鈴蟲羧酸酯酶是重要的昆蟲解毒蛋白。目前，學者已證實了羧酸酯酶基因CCE001a與棉鈴蟲代謝棉酚有關。羧基酯酶多基因家族是α/β-水解酶折疊超家族。這個超家族的成員在一級序列中有一個高度保守的非鄰接殘基催化三聯體。三聯體通常是Ser、Glu和His，也可以是Ser、Asp和His或Cys、Asp和His。CarE屬于絲氨酸水解酶，其活性中心具有絲氨酸殘基，多數生物體中有多種CarE同工酶。這些同工酶參與藥物代謝、解毒作用和脂類物質代謝。該研究利用生物信息技術發現CCE001a是一個含有信號肽的親水性蛋白，無跨膜區。分析表明CCE001a在蛋白中存在多個磷酸化位點，蛋白質磷酸化是一種重要和廣泛應用的翻譯后調節方法。蛋白磷酸化在真核生物中普遍對蛋白進行翻譯修飾（磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰乙?；龋┯兄匾饔?，對生物細胞內的信號傳遞起著主導作用[13]。磷酸化前后蛋白的三維結構發生變化會影響蛋白活性的改變，進而影響信號通路中下游蛋白的活性，從而對生理生化過程進行調控[14-15]。近年來，棉鈴蟲具有較強的抗藥性，這在國內外研究中得到了越來越多的認識，而其體內的解毒酶含量和活力程度對于耐藥以及解毒效果都起著重要作用。而棉花色素腺體和棉酚能誘導棉鈴蟲體內的解毒酶活性增加。據文獻報道，棉酚對棉鈴蟲解毒酶的活力誘導作用中，多功能氧化酶具有主導作用，且羧酸酯酶也能幫助多功能氧化酶在新陳代謝過程中進行水解[14]。劉杰[14]研究發現，適量的棉酚會在一定范圍內刺激引起棉鈴蟲體內的不同種類羧酸酯酶，且這些物質還可以增強棉鈴蟲體內羧酸酯酶的存在，但是這種新型的誘導酶類作用于外源物質的解毒及其效果，仍有待于進一步研究才能確定。CCE001a蛋白的三

級結構結合二級

結構分析顯示，該蛋白主要由31.35%的α-螺旋、3.96%的

β-轉角、46.49%的無規則卷曲和18.20%的延伸鏈組成，而其中無規則卷曲結構有助于CCE001a識別底物，因為α螺旋和β折疊空間結構不易發生改變而無規則卷曲空間結構易于發生改變[12]。CCE001a存在1個高可信度的潛在N-糖基化位點，真核細胞中，大部分蛋白內質網（ER）通過N-糖基化修飾，蛋白質的折疊和分選也與糖基化息息相關[16]，但單個糖基化位點的破壞不會影響 CCE001a 的正確加工和運輸功能。

該研究從 CCE001a蛋白序列出發，運用不同在線分析軟件進行分析，深入了解該蛋白的性質及功能，可為棉鈴蟲抗藥和植物次生代謝產物提供參考。此外，仍需從多個角度來驗證預測分析結果，以彌補生物信息學分析的局限性。

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