廣靈驢FTO基因克隆、序列分析及組織差異表達

邱麗霞，關家偉，李 麗，李武峰，杜 敏

(1.山西農業大學生命科學學院，太谷 030801；2.美國華盛頓州立大學動物科學系，普爾曼 99164-6310)

多年來，市場上一直以雞肉、豬肉、牛肉等作為主要的肉類產品滿足消費者的需求，但隨著生活水平的提高，人們的消費選擇性越來越強。驢肉具有低脂率、高蛋白營養的特點[1]，且肉質鮮美，符合大眾群體的口感要求，是一種很好的滋補類肉產品，因此，對驢肉的肉品質研究和肉質性狀的改良優化有助于將驢肉產品推向更大的市場。肉的食用口感和優良性狀很大程度上得利于肌內脂肪(intramuscular fat,IMF)發揮作用，肌內脂肪沉積是一個受多基因調控和代謝機制影響的過程，其沉積量影響著嫩度、風味、大理石花紋等其他肉質性狀的好壞[2]。與此同時，過度喂養牲畜導致的脂肪沉積過多會影響其健康狀況與食用口感，進而影響其經濟價值，因此，從分子生物學角度開展脂肪沉積的研究很有必要。

脂肪和肥胖相關基因(fat mass and obesity-associated gene,FTO)是1999年Peters等[3]通過克隆患有腳趾融合的野生型小鼠發現的，是能夠顯著影響脂肪代謝和沉積的關聯基因，現階段的研究主要集中在人和小鼠上。研究發現，攜帶有FTO基因的小鼠會表現出體長更長、體重更高和骨密度更高的特點，說明FTO基因的表達與脂肪沉積之間具有密切聯系，同時在生長發育方面發揮著關鍵作用[4]。FTO基因屬于非二價鐵離子血紅素加雙氧酶超家族(ALKB)成員之一，也被稱為ALKBH9，擁有鐵結合基因與α-酮戊二酸相互作用的結構域[5]，在DNA/RNA的去甲基化中起重要作用[6]。FTO基因在絕大多數生物中廣泛表達，Hu等[7]研究發現，在克隆豬FTO基因序列后的6號染色體片段中存在相應的SNPs位點，該區域擁有許多調控脂肪性狀的數量性狀位點，推測這些SNPs位點可能與豬的肌內脂肪沉積相關。研究表明，FTO基因在不同動物組織中均有表達，且表達量存在顯著差異，Frayling等[8]分別在胎兒和成人的各組織中檢測FTO基因的表達情況，結果發現無論是在胎兒還是成人的大腦中其表達量都是最高的，這與大鼠、小鼠的組織表達結果一致[9]。Gerken等[5]利用原位雜交技術發現，FTO基因在下丘腦控制能量平衡的核團中廣泛表達，說明FTO基因與肥胖的相關性可以通過能量攝取來實現。Mizuno等[10]通過對小鼠禁食來觀察FTO基因與肝臟代謝水平之間的聯系，發現通過饑餓行為處理之后，FTO基因及過氧化物酶體相關輔助因子可影響肝臟的代謝水平變化，FTO基因與血糖、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphate,G-6-PC)等mRNA水平呈顯著正相關，說明FTO基因mRNA的表達受能量攝入的影響，并與代謝物的代謝水平波動有關。目前，關于FTO基因組織特異性表達的研究主要集中在鼠和豬等少數哺乳動物中[11]，對驢FTO基因的遺傳研究鮮見報道。鑒于此，本試驗以廣靈驢為試驗動物，擴增并克隆FTO基因，分析其核苷酸和蛋白質序列與功能，并檢測FTO基因在廣靈驢7種不同組織中的表達情況，以期為進一步探究FTO基因的表達調控與基因功能、脂肪沉積和物質代謝提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 試驗動物由山西省忻州市繁峙縣田園毛驢養殖公司提供，在保證規范管理、自由采食和充足飲水的前提下選取10頭3歲體重相同、體態健康的雌性母驢，進行放血處理確保動物已經死亡后屠宰。在無菌條件下采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌及皮下脂肪組織，剔除樣品中的結締組織后盛裝到2 mL凍存管留樣保存，然后使用液氮進行冷凍處理，帶回實驗室后-80 ℃保存備用。

1.1.2 主要試劑 普通DNA凝膠回收試劑盒、pGM-T Fast克隆試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞均購自天根生化科技(北京)有限公司；Trans2K DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司；2×TaqPCR MasterMix購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；反轉錄及熒光定量試劑盒均購自北京聚和美有限公司；Trizol試劑盒、SYBR Green Ⅰ核酸染料(10 000×)及氨芐青霉素均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 參照GenBank中馬(登錄號：XM_023636997.1)、羊駝(登錄號：XM_006207838.3)、山羊(登錄號：NM_001319276.1)等物種的FTO基因序列，運用Primer Premier 3.0及GenScript Primer Design在線軟件分別設計3對用于廣靈驢FTO基因CDS序列的克隆引物和1對實時熒光定量PCR引物，內參基因選用β-actin，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 利用Trizol試劑盒提取驢7種不同組織總RNA，利用核酸測定儀及凝膠電泳鑒定RNA的濃度和完整性，符合質量要求后參照M5 Super qPCR RT Kit with gDNA Remove反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.2.3 克隆及測序分析 以cDNA為模板，運用PCR技術擴增FTO基因CDS區完整序列。PCR擴增體系10 μL：模板cDNA 1 μL，2×TaqPCR MasterMix 5 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 3.2 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34個循環；72 ℃延伸5 min；12 ℃保存。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其特異性，鑒定正確后進行回收和純化，將其與pGM-T載體過夜連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在抗氨芐青霉素的培養基中接種培養擴大體系，挑選陽性克隆菌送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 相似性比對及系統進化樹構建 利用DNAMAN 9.0軟件對測序結果進行拼接，利用BLAST將所獲序列與輸入NCBI中進行比對得到完整CDS區。通過ORF Finder工具預測FTO基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)，并由此得到完整氨基酸序列。使用ClustalX和DNAStar 11.0中的MegAlign軟件將廣靈驢與馬(登錄號：XM_023636997.1)、牛(登錄號：NM_001098142.1)、人(登錄號：NM_001080432.3)、豬(登錄號：NM_001112692.1)、綿羊(登錄號：NM_001104931.1)、山羊(登錄號：NM_001319276.1)和羊駝(登錄號：XM_006207838.3)的FTO基因序列進行相似性比對，利用Mega 11.0軟件構建系統發育樹。

1.2.5 生物信息學分析 使用ExPASy中ProtParam和ProtScale在線軟件對FTO蛋白進行理化性質、親/疏水性預測；利用PSORT Ⅱ Prediction、TMHMM 2.0、NetPhos 3.1、NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0在線軟件對FTO蛋白的亞細胞定位、跨膜區域、磷酸化位點及糖基化位點進行預測；利用SOPMA、SWISS-MODEL及NCBI中CDD網站預測FTO蛋白的二級結構、三級結構和結構域等，詳細信息見表2。

表2 預測FTO氨基酸功能的生物信息學分析網站

1.2.6 組織差異表達 以廣靈驢7種組織cDNA為模板，以β-actin為內參基因，使用實時熒光定量PCR檢測FTO基因表達水平。PCR反應體系10 μL：模板1 μL，2×Real-time PCR Super Mix 5 μL，上、下游引物各0.25 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 20 s，共40個循環。每組樣品3個重復。以肝臟組織為對照，利用2-ΔΔCt法計算FTO基因相對表達量，運用GraphPad Prism 8.0工具選擇單因素方差分析(One-Way ANOVA)方法處理試驗數據，繪圖呈現出不同組織的基因表達差異，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 FTO基因CDS區克隆與測序

PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果見圖1。由圖1可知，擴增序列長度分別為724、861和515 bp，與預期片段大小一致。對鑒定正確的PCR產物進行克隆測序，對所獲序列進行拼接，得出長為1 518 bp的廣靈驢FTO基因CDS區序列，序列提交至NCBI，登錄號：MZ169553。通過ORF Finder工具進行開放閱讀框預測分析，結果表明，FTO基因開放閱讀框長1 518 bp，編碼505個氨基酸殘基。

M，Trans2K DNA Marker；1～3，引物FTO-1、FTO-2、FTO-3的PCR擴增產物M，Trans2K DNA Marker；1-3，PCR amplification products of primers FTO-1，FTO-2 and FTO-3,respectively圖1 廣靈驢FTO基因的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of FTO gene in Guangling donkey

2.2 廣靈驢FTO基因核苷酸及氨基酸序列的相似性比對

運用MegAlign在線軟件進行序列的相似性比對，結果顯示，廣靈驢FTO基因與馬、人、羊駝、豬、牛、綿羊和山羊的核苷酸序列相似性分別為99.3%、90.8%、90.7%、90.3%、89.5%、89.2%和89.2%(圖2)；氨基酸序列相似性分別為98.9%、87.1%、94.7%、92.8%、91.4%、91.3%和91.3%(圖3)。

圖2 廣靈驢FTO基因核苷酸序列相似性比對Fig.2 The similarity alignment of nucleotide sequences of FTO gene in Guangling donkey

圖3 廣靈驢FTO基因氨基酸序列相似性比對Fig.3 The similarity alignment of amino acid sequences of FTO gene in Guangling donkey

2.3 系統進化樹構建

通過Mega 11.0軟件利用NJ(Neighbor-Jioning)法構建廣靈驢FTO基因與其他物種的系統進化樹，結果見圖4。由圖4可知，與廣靈驢親緣性最近的是馬，其次與人聚為一類；再與羊駝和豬匯聚成一類；最后與牛、山羊、綿羊匯聚成一大類，說明廣靈驢與山羊、綿羊的親緣性最遠，與相似性比對結果相一致。

圖4 廣靈驢FTO基因系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of FTO gene in Guangling donkey

2.4 生物信息學分析

2.4.1 理化性質 FTO蛋白分子式為C2597H4021N705O775S26，分子質量為58.35 ku，脂肪系數為80.36，理論等電點為5.07，表明FTO極可能是酸性蛋白。FTO蛋白編碼的505個氨基酸中亮氨酸數量最多(11.1%)，甲硫氨酸數量最少(2.4%)，帶負電的氨基酸殘基數量多于帶正電的(表3)。FTO蛋白穩定系數為48.82，說明該蛋白性質不穩定。

表3 廣靈驢FTO蛋白的氨基酸組成

2.4.2 親/疏水性 通過ProtScale在線軟件對廣靈驢FTO蛋白進行親/疏水性分析，在第483異亮氨酸(I)處疏水性最大(2.500)；在第12位精氨酸(R)處疏水性最小(-3.222)，FTO蛋白的平均疏水指數為-0.550，證明該蛋白為親水性蛋白(圖5)。

圖5 廣靈驢FTO蛋白的親/疏水性預測Fig.5 Hydrophilicity/hydrophobicity prediction of FTO protein in Guangling donkey

2.4.3 跨膜區和亞細胞定位 使用TMHMM 2.0在線軟件分析FTO蛋白跨膜區，結果顯示，廣靈驢FTO蛋白沒有明顯的跨膜區域，且主要分布于膜外(圖6)，說明該蛋白為膜外蛋白。使用PSORT Ⅱ Prediction在線工具對蛋白亞細胞定位進行預測，結果顯示，FTO蛋白位于細胞質中的可能性大于細胞核，可能性分別為73.9%和26.1%，可信度顯示76.7%，表明該蛋白存在于細胞質中的可能性較大。

圖6 廣靈驢FTO蛋白的跨膜區預測Fig.6 Transmembrane prediction of FTO protein in Guangling donkey

2.4.4 磷酸化位點與糖基化位點預測 運用NetPhos 3.1、NetNGlyc 1.0及NetOGlyc 4.0在線軟件預測FTO蛋白的修飾情況，結果顯示，共預測到34個磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化位點分別為17、13和4個(圖7A)；2個N-糖基化位點，分別位于第200及302位氨基酸處(圖7B)，3個O-糖基化位點。

圖7 廣靈驢FTO蛋白磷酸化位點(A)與N-糖基化位點(B)預測Fig.7 Phosphorylation (A) and N-glycosylation (B) site prediction of FTO protein in Guangling donkey

2.4.5 二級結構與三級結構 利用SOPMA在線軟件預測FTO蛋白二級結構，結果顯示，α-螺旋、無規則卷曲、延伸鏈和β-轉角分別占43.96%、37.82%、11.49%和6.73%(圖8)。利用SWISS-MODEL在線軟件預測FTO蛋白三級結構模型，其預測結果與二級結構預測結果相符(圖9)。

①h，α-螺旋；e，延伸鏈；t，β-轉角；c，無規則卷曲。②線條由長到短分別為α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和無規則卷曲①h，Alpha helix；e，Expended strand；t，Beta turn；c，Random coil.②The lines form long to short represent alpha helix，expended strand，beta turn and random coil,respectively圖8 廣靈驢FTO蛋白二級結構預測Fig.8 Secondary structure prediction of FTO protein in Guangling donkey

圖9 廣靈驢FTO蛋白三級結構預測Fig.9 Tertiary structure prediction of FTO protein in Guangling donkey

2.4.6 結構域 通過NCBI的CDD進行結構域預測發現，FTO蛋白存在2個結構域(圖10)， 在第36-325位氨基酸處存在FTO N-端催化結構域，具有催化脫甲基化酶活性，來自于FTO蛋白的催化類AlkB超家族；在第329-498位氨基酸處存在FTO C-端結構域，該結構域已被證明與人類體重指數(body mass index，BMI)和肥胖風險增加有關。

圖10 廣靈驢FTO蛋白結構域預測Fig.10 Domain prediction of FTO protein in Guangling donkey

2.5 廣靈驢FTO基因組織差異分析

由圖11可知，FTO基因在廣靈驢7種組織中均有表達，且呈現出明顯的表達差異，其中FTO基因表達最豐富的組織為皮下脂肪和肺臟，且兩者間差異不顯著(P>0.05)，但與肝臟、脾臟、腎臟、心臟和背最長肌的表達量存在極顯著差異(P<0.01)；FTO基因在肝臟中的表達量極顯著高于心臟、脾臟、腎臟和背最長肌(P<0.01)；在心臟和脾臟中的表達量較少，極顯著低于腎臟(P<0.01)，顯著高于背最長肌(P<0.05)。

肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖11 廣靈驢7種組織FTO基因表達差異Fig.11 Expression difference of FTO gene in 7 tissues of Guangling donkey

3 討 論

研究證明，除營養調控外，脂肪沉積很大程度上受分子遺傳水平層面的調控影響，肌內脂肪沉積不僅影響動物的體型與健康狀況，還能調控改善肉類品質，如肉色、嫩度、風味、大理石花紋等[12]。隨著全基因組關聯性分析、候選基因篩選和遺傳克隆等分子生物技術的成熟，與脂肪沉積相關的一些候選基因相繼被發現。脂肪沉積是一個動態平衡的過程，主要以甘油三酯(triglyceride,TG)的形式儲存和發揮生理作用[13]， 像過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)[14]、 激素敏感酯酶(hormone sensitive lipase,HSL)[15]、二酰基甘油酰基轉移酶(diacylglycerolacyl-transferase,DGAT)[16]等都是脂肪沉積過程中的轉錄因子或脂肪分泌因子，對脂肪級聯調控發揮一定作用[17]。研究顯示，FTO基因可通過頡頏脂肪分解的相關基因或上調脂肪合成的相關基因來幫助TG的聚集，從而使脂肪沉積量增加[18]。目前，廣靈驢FTO基因的肉質性狀關聯和遺傳調控的研究在國內外鮮見報道，本試驗通過克隆FTO基因的完整CDS區序列，并預測FTO蛋白的相關功能，來探究其在動物脂肪沉積與能量平衡過程中的作用。

本研究克隆獲得廣靈驢FTO基因CDS區序列，與其他物種相比具有較高的保守性。研究發現，FTO基因內含子1中的SNP是與體重指數和體脂相關的常見變異體，其主要與食物攝入和能量平衡有關[19-20]。Karra等[21]證實，FTO基因上的SNP位點rs9939609可以通過食欲肽的表達水平影響食欲并影響攝食量，以達到脂肪含量的沉積與能量消耗代謝。因此，推測FTO基因突變位點可能會通過同樣的方式對廣靈驢的脂肪沉積產生影響，為深入探究廣靈驢FTO基因功能提供了新的思路。 本試驗結果發現，廣靈驢FTO基因開放閱讀框長1 518 bp，可編碼505個氨基酸， 分析結果與豬[22]和山羊[23]一致。在豬中，FTO基因會隨著體重的增加而增加， 并與肌內脂肪組織呈顯著相關，表明FTO很有可能是脂肪沉積性狀的重要候選基因[24]。

FTO蛋白質分子式為C2597H4021N705O775S26，屬于酸性親水蛋白且性質不穩定，通過對蛋白序列比對和理化性質預測得知，FTO蛋白與其他物種間高度保守一致。RNA結合蛋白SFPQ能夠與FTO相互作用，FTO的亞細胞定位直接影響其接近不同RNA底物的能力[25]。亞細胞定位結果顯示，FTO蛋白可能定位于細胞質中，而RNA主要存在于細胞核，與FTO不處于同一空間，這個現象可能與其去甲基化能力的強弱有直接關聯，進而影響脂肪沉積含量。FTO具有34個磷酸化位點和5個糖基化位點，磷酸化和糖基化作為蛋白質翻譯后修飾作用可決定蛋白質的功能，FTO蛋白作為一種重要的去甲基化酶，能夠通過調節6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)的去甲基化來調控脂肪沉積過程。Wu等[26]揭示了FTO依賴的m6A甲基化的去甲基化作用通過磷酸腺苷蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)信號通路參與骨骼肌脂質積累的調節，同時，FTO基因作用于m6A的去甲基化還與肥胖、心血管疾病和腫瘤的發生有關[27]。蛋白質二級結構預測發現，α-螺旋及無規則卷曲是廣靈驢FTO蛋白最主要的結構形式，進一步證實了FTO蛋白性質不穩定的結果，易于改變其空間構象。結構域預測分析顯示，FTO第36-325位氨基酸處存在N-端催化結構域(NTD)，第329-498位氨基酸處存在β-折疊的C-端結構域(CTD)，NTD決定著FTO的去甲基化酶活性，使其在脂質積累過程中發揮作用，CTD則與人類肥胖風險有關。

FTO基因廣泛表達于與能量穩態相關的外周區域，包括肝臟、脂肪組織和骨骼肌。 廣靈驢不同組織FTO基因表達差異結果發現，在皮下脂肪、肺臟、肝臟和腎臟中的表達量極顯著高于心臟、脾臟和背最長肌，這與Chen等[28]試驗結果基本一致。皮下脂肪組織是肌內脂肪沉積的主要位置，而肺臟是啟動免疫保護功能的重要組織器官，FTO基因在肺臟中的高表達指示其可能在保護免疫中發揮作用，肝臟和腎臟則主要影響著機體的能量積累與代謝。已有研究認為，免疫能力取決于營養狀況，也可能會受到包括肥胖在內的相關疾病的負面影響，FTO基因可以從遺傳堿基多態性上誘導Ⅱ型糖尿病的發生、損害免疫功能，從而引起相關傳染病的發生[29]。另外，背最長肌中FTO基因表達量最低的原因可能是受肌肉纖維類型的影響，Gan等[30]通過研究雜交鴨腿肌和胸肌的肉質性狀影響發現，2個不同肌肉部位的肌內脂肪含量存在顯著差異，肌內脂肪含量與紅色肌纖維含量呈正相關，與白色肌纖維含量呈負相關。因此，FTO基因并不局限于單一部位的表達，可在機體多個組織中表達，對脂肪沉積調控和免疫功能等方面發揮關鍵作用，并與控制能量支出平衡有關。

4 結 論

本研究成功克隆了廣靈驢FTO基因CDS序列，提交到NCBI，登錄號：MZ169553，序列長度為1 518 bp，可編碼505個氨基酸，其與馬親緣關系最近，與綿羊和山羊親緣關系最遠。FTO蛋白是不穩定的酸性蛋白，包含34個磷酸化位點和5個糖基化位點，具有屬于AlkB超家族的C-端結構域及N-端催化結構域，不存在信號肽剪切位點和跨膜結構，高級結構以α-螺旋和無規則卷曲為主。FTO基因在廣靈驢7種組織中均有不同程度的表達，其中表達水平最豐富的組織為皮下脂肪和肺臟，但在背最長肌中的表達豐度最低，推測FTO基因對脂肪沉積發揮作用，為將來提高脂肪沉積含量及改善肉品質量提供參考依據。