馬臍帶不同部位間充質干細胞的分離培養及成軟骨誘導分化

唐小云，周桂珍，周正娜，鄧雅迪，張 慧，張欣如，王旭光

(新疆農業大學動物科學學院，新疆馬繁育與運動生理重點實驗室，烏魯木齊 830052)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源十分廣泛，最初在骨髓中分離得到，但骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)受供體年齡和健康狀況的影響，并且其收集過程會對供體造成創傷[1]。近年來，臍帶MSCs(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)成為BM-MSCs的理想替代物，能表達多種胚胎干細胞特有的分子標志，分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無倫理道德問題的限制[2-5]，是最具臨床應用前景的多能干細胞之一。然而，隨著對UC-MSCs的深入研究，人們發現不同實驗室分離培養得到的UC-MSCs在MSCs特性上存在差異，這可能與物種、供體和細胞分離培養方法有關[6-7]。來自成年和胎兒組織的MSCs具有不同的特性，在胎兒MSCs中，特別是臍帶MSCs在臨床應用方面更具優勢[8]。Semenova等[9]對人臍帶華通氏膠、臍血管周圍間隙和臍帶羊膜3個區域的MSCs進行比較，華通氏膠MSCs具有高且穩定的增殖潛力和表型，并且可以作為醫學應用的優選細胞來源。周桂珍等[10]利用野生動物盤羊的臍帶也成功分離培養得到MSCs，保存了珍稀動物的遺傳資源。

馬作為大型家畜，適合作為不同自發性疾病的動物模型，這些疾病在臨床上與類似的人類疾病相關，包括馬在內的大型動物實驗模型的開發，可能會為研究MSCs的生理學及其在人類及獸醫再生醫學的應用開辟替代策略。由于物種不同，所獲得的臍帶長度不同，其分離培養方法也不相同。綿羊臍帶長度僅為5 cm左右，而馬的臍帶長15～20 cm，馬臍帶中MSCs的分布是否均一及哪個部位獲得的華通氏膠分離后可以得到純度較高的MSCs還鮮見報道。本研究以剛分娩馬胎兒附著的臍帶為材料，采用組織塊分離法制備不同部位的馬臍帶間充質干細胞(equine umbilical cord mesenchymal stem cells，eUC-MSCs)并進行生物學特性以及成軟骨誘導分化潛能的檢測，通過比較來自同一臍帶不同部位MSCs的特性，檢測其在增殖能力、細胞表面標記、多潛能性表達和成軟骨誘導分化上性能的異同，旨在明確更適合分離MSCs的馬臍帶部位。

1 材料與方法

1.1 材料

剛分娩的馬雌性胎兒臍帶，無菌處理，4 ℃保存。

1.2 主要試劑

胎牛血清(FBS)、DMEM/F12、0.25%胰蛋白酶(1×)均購自Gibco公司；PBS(1×)購自Solarbio公司；微量樣品總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green)均購自天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑除特別說明外均購自Merck公司。

1.3 方法

1.3.1 eUC-MSCs分離培養 無菌收集馬胎兒的整段臍帶，將其分為靠近胎兒部分(近端)、整段臍帶中間部分(中段)、靠近胎盤部分(遠端)3個不同區域的臍帶(4～5 cm)。采用組織塊分離法分別分離3個部位的細胞，剔除臍帶外層羊膜、兩條臍動脈和一條臍靜脈；將膠狀物質(華通氏膠)剪碎為1 mm3的組織塊，移入T-25細胞培養瓶(Corning)中，加入3 mL含10% FBS的DMEM/F12，置于38.5 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱內培養。 第7天進行換液，之后每3 d換1次液。 在細胞貼壁生長至80%～90%時，使用0.25%胰蛋白酶進行消化，1 000 r/min離心5 min清洗、收集細胞，按1∶2的比例傳代培養，在熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX71)下觀察細胞生長狀況。

1.3.2 eUC-MSCs增殖能力測定 將P3代生長狀況較好的3組eUC-MSCs以1×104/mL的密度接種至六孔板(Corning)中，分別在第3、5、7、9、11、13天進行細胞計數，繪制3組eUC-MSCs的生長曲線，按照如下公式計算各組細胞倍增時間。

TD=t(log2/logNt-logN0)

TD為細胞倍增時間；t為培養時間；N0為接種細胞數；Nt為培養t時間后的細胞數。

1.3.3 eUC-MSCs多潛能性和表面標記分子檢測 通過NCBI查找基因序列，利用AlleleID 6.0軟件，分別設計多潛能基因NANOG(nanog homeobox)、八聚體結合轉錄因子(POU class 5 homeobox 1，POU5F1)和Y染色體性別決定區基因盒2(SRY-box transcription factor 2，SOX2)，表面標記分子單核細胞分化抗原CD14(CD14 molecule，CD14)、B-淋巴細胞表面抗原B4(CD19 molecule，CD19)、造血祖細胞抗原CD34(CD34 molecule，CD34)、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C型(protein tyrosine phosphatase receptor type C，CD45)、5′-核苷酸外切酶(5′-nucleotidase ecto，CD73)、B細胞抗原受體復合物相關蛋白α鏈(CD79a molecule，CD79a)、Thy-1細胞表面抗原(Thy-1 cell surface antigen，CD90)和內皮糖蛋白(endoglin，CD105)，軟骨誘導分化特異性基因Y染色體性別決定區基因盒9(SRY-box transcription factor 9，SOX9)、蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)和Ⅱ型膠原蛋白1鏈(collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1)的PCR引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通過微量樣品總RNA提取試劑盒提取P1代和P5代3組eUC-MSCs的總RNA，反轉錄后，通過實時熒光定量PCR檢測多潛能性基因NANOG、POU5F1、SOX2和表面標記分子CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD79a、CD90、CD105的表達。 PCR反應體系20 μL：2×Pre Mix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補足20 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃延伸32 s，共40個循環。

表1 引物信息

1.3.4 eUC-MSCs成軟骨誘導分化及鑒定 將P2代的3組eUC-MSCs以2×104/mL接種在6孔板中，使用含10% FBS的DMEM/F12培養液培養細胞，直至細胞匯合度達到80%左右，將誘導分化組的培養液更換為成軟骨誘導分化培養液(含1% FBS、0.1 μmol/L地塞米松、10 ng/mL TGF-β3、50 nmol/L抗壞血酸-2-磷酸、6.25 μg/mL胰島素、100 IU/mL青-鏈霉素的DMEM/F12)，每2 d換1次液。未誘導分化的對照組繼續使用含10% FBS的DMEM/F12培養液培養。分別在誘導分化第7、14、21天提取各組的總RNA，反轉錄后，通過實時熒光定量PCR檢測成軟骨細胞特異性基因SOX9、ACAN和COL2A1的相對表達量；且在誘導分化第7、14、21天對各組細胞進行阿利新藍染色，主要步驟如下：棄去原有培養液，用PBS清洗3～5次，4%多聚甲醛固定30 min，用ddH2O清洗3～5次，使用阿利新藍染色液染色30 min，再用ddH2O清洗3～5次，每孔加入適量ddH2O，防止干燥，于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數據分析

使用Excel對實時熒光定量PCR獲得的各基因Ct值進行統計整理，采用2-△△Ct方法計算各基因的相對表達量。采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 eUC-MSCs形態學觀察

在原代細胞分離培養第1天3組eUC-MSCs均可見大量圓形細胞和一些紅細胞；在第2天有細胞開始貼壁，呈梭形，連片分布；第7天進行換液以去除未貼壁細胞和組織塊，當細胞長至80%～90%進行傳代。傳代后的細胞繼續貼壁生長，呈集落狀，隨后細胞向四周延伸呈典型的成纖維狀，當細胞之間相互接觸后開始出現克隆狀生長，細胞呈克隆狀、簇狀，各組細胞培養至P5代時，細胞的形態未發生變化，呈成纖維狀和簇狀(圖1)。

圖1 eUC-MSCs形態(100×)Fig.1 Cell morphology of eUC-MSCs (100×)

2.2 eUC-MSCs倍增時間測定

由圖2可知，3組eUC-MSCs的生長曲線都呈S型。中段eUC-MSCs接種后1～5 d為潛伏適應期，第6天細胞開始增殖，之后進入對數生長期，第9天達到對數生長期的高峰，之后進入平臺期。近端和遠端eUC-MSCs培養的延滯期較中段eUC-MSCs稍長，培養至第7天后進入對數生長期，與中段eUC-MSCs相比增長速度較慢。經計算得知3組eUC-MSCs細胞倍增時間分別為：35.4(近端)、25.5(中段)和34.9 h(遠端)，3組細胞的平均倍增時間為31.9 h，中段細胞的倍增時間顯著低于近端和遠端細胞(P<0.05)。

圖2 eUC-MSCs生長曲線Fig.2 Growth curve of eUC-MSCs

2.3 eUC-MSCs多潛能性基因和表面標記分子的表達

2.3.1 多潛能性基因的表達 實時熒光定量PCR檢測發現，多潛能性基因NANOG相對表達量在P1代中段細胞顯著高于近端細胞(P<0.05)，在P5代各組細胞無顯著差異(P>0.05)；POU5F1基因相對表達量在P1代各組細胞均無顯著差異(P>0.05)，在P5代近端細胞顯著高于中段細胞(P<0.05)，且極顯著高于遠端細胞(P<0.01)，SOX2基因的相對表達量在各組細胞之間差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

①A～C，NANOG、POU5F1、SOX2基因的相對表達量。②*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01);無*，差異不顯著(P>0.05)。下同①A-C,The relative expression of NANOG,POU5F1 and SOX2 genes,respectively.②*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);No*,No significant difference.The same as below圖3 不同部位eUC-MSCs多潛能性基因的相對表達量Fig.3 Relative expression of eUC-MSCs pluripotency genes at different parts

2.3.2 表面標記分子的表達 3組eUC-MSCs均高表達CD34、CD73、CD90和CD105，低表達CD14、CD19、CD45和CD79a。CD14的相對表達量在P5代近端細胞顯著高于中段和遠端細胞(P<0.05)；CD19、CD45和CD73的相對表達量均為近端細胞顯著高于中段和遠端細胞(P<0.05)；CD34的相對表達量是遠端細胞顯著高于近端和中段細胞(P<0.05)；CD79a的相對表達量在P5代遠端細胞顯著高于近端和中段細胞(P<0.05)；CD90的相對表達量在P1代遠端細胞極顯著高于近端和中段細胞(P<0.01)，在P5代遠端細胞顯著低于近端和中段細胞(P<0.05)；CD105的相對表達量在各組細胞之間差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

A～H，CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD79a、CD90和CD105的相對表達量A-H,The relative expression of CD14,CD19,CD34,CD45,CD73,CD79a,CD90 and CD105,respectively圖4 不同部位eUC-MSCs表面標記分子的相對表達量Fig.4 Relative expression of eUC-MSCs surface marker molecules at different parts

2.4 eUC-MSCs成軟骨分化能力檢測

2.4.1 成軟骨特異性基因的表達 3組eUC-MSCs誘導分化為成軟骨細胞后，其特異性基因的相對表達量如圖5所示。由圖5可知，在誘導分化第7天，各組細胞SOX9基因的相對表達量無顯著差異(P>0.05)，第14天時近端細胞的相對表達量極顯著高于遠端細胞(P<0.01)，誘導21 d后遠端細胞的相對表達量極顯著高于中段細胞(P<0.01)；在誘導第7和14天，中段細胞ACAN和COL2A1基因相對表達量均極顯著高于近端和遠端細胞(P<0.01)，第21天時均顯著高于近端和遠端細胞(P<0.05)(圖5)。

2.4.2 阿利新藍染色結果 經阿利新藍染色后，3組eUC-MSCs在誘導第7、14、21天均都可見特異性著色，3組細胞染色結果無明顯差異，而未誘導分化的對照組沒有特異性著色(圖6)。

圖6 eUC-MSCs成軟骨誘導分化染色結果Fig.6 Staining results of eUC-MSCs for chondrogenic induction of differentiation

3 討 論

3.1 eUC-MSCs的分離培養及增殖能力

UC-MSCs因無倫理問題，易于獲得，無創分離，產量高，具有更大的分化和免疫調節潛力，是最有前景的多潛能性細胞之一。目前關于eUC-MSCs的報道較少，且對于馬臍帶不同部位MSCs的研究鮮有報道。Merlo等[6]報道馬臍帶細胞基質存在原始多能干細胞的替代來源，分離得到的MSCs貼壁生長呈成纖維狀，具有分化為骨、脂肪、軟骨和神經元細胞的能力，可以在出生時以非侵入性的方式收集并儲存，以備將來用作供體細胞治療馬病。有研究證明使用組織塊分離法比酶消化法更有優勢，因為采用酶消化法可能會引起細胞損傷[11]。為了避免酶對原代細胞的影響，本研究采用組織塊分離法獲得eUC-MSCs，細胞呈成纖維狀和簇狀，3組細胞傳代至P5代，細胞仍保持較好的增殖能力，各組細胞形態未發生明顯變化，表明整段臍帶都可分離得到eUC-MSCs。

使用MSCs用于臨床治療時，細胞的產量、存活性和倍增時間均要得到保證，因為細胞存活性更高和細胞倍增時間更低具有更好的療效。在本研究中，3組eUC-MSCs的生長曲線顯示，在第1～5天的培養過程中，細胞生長速度較慢，當進入對數生長期時，生長速度迅速增加。近端和遠端eUC-MSCs具有幾乎相同的細胞倍增時間，而中段eUC-MSCs更快進入對數生長期，且細胞倍增時間顯著低于其他兩組細胞。Iacono等[12]分離的eUC-MSCs從原代到P8代的細胞平均倍增時間為48 h。Passeri等[13]分離的eUC-MSCs傳代至P12代后細胞的平均倍增時間為36.5 h，都高于本研究的平均倍增時間(31.9 h)，近端和遠端eUC-MSCs倍增時間與Passeri等[13]研究相似，可能是本研究對不同部位eUC-MSCs進行增殖能力測定，且不同部位的倍增時間不同。其次，本研究只針對P3代細胞進行增殖能力測定，而Passeri等[13]研究中使用傳代至P12代的細胞進行增殖能力測定，由此可以看出針對臍帶不同部位獲取的eUC-MSCs及不同代數在倍增時間上存在一定的差異。

3.2 eUC-MSCs多潛能性和表面標記分子的表達

多能干細胞表達一組維持干細胞特性所必需的獨特因子，包括POU5F1、NANOG和SOX2[14-16]，這些轉錄因子參與多能性、自我更新和增殖的調節[17]。POU5F1是啟動哺乳動物胚胎發育所必需的，對于胚胎內細胞團的形成和胚胎干細胞的維持至關重要[18]。SOX2調節POU5F1的表達，維持干細胞的多能狀態，而NANOG是維持干細胞未分化狀態和自我更新所必需的[17]。

通過實時熒光定量PCR檢測多潛能性基因POU5F1、NANOG和SOX2 mRNA表達水平，隨著細胞從P1代傳至P5代，多潛能性基因的相對表達量明顯升高，間接說明了分離細胞的純度相對較高。P1代中段細胞NANOG基因的相對表達量顯著高于近端細胞；P1代3組細胞POU5F1基因相對表達量都較低，但在P5代中，近端細胞的基因相對表達量顯著高于中段細胞、極顯著高于遠端細胞；SOX2基因在3組細胞中差異均不顯著。前人研究表明，在馬臍帶、臍帶血、骨髓和脂肪MSCs的研究中，只有UC-MSCs表達了干細胞轉錄因子POU5F1[19]，也印證了本研究結果。

國際細胞治療學會曾報道，MSCs對CD73、CD90、CD105呈陽性表達，對CD14、CD19、CD34、CD45、CD79a呈陰性表達[20]。本研究中分離得到的3組eUC-MSCs高表達典型間充質表面分子CD73、CD90和CD105，低表達造血分子CD14、CD19、CD45和CD79a。CD34標記的是原始造血祖細胞和內皮細胞[20]，但本研究中CD34呈陽性表達，在P1代時相對表達量較低，傳代至P5代時出現高表達。 在Merlo等[8]和Iacono等[21]的研究中UC-MSCs陽性表達CD34，CD34的表達取決于細胞生長環境、體外培養的細胞代次或細胞來源[22-23]。

3.3 eUC-MSCs成軟骨誘導分化

在本研究中，3組細胞誘導為成軟骨細胞，經阿利新藍染色后各誘導組的染色結果均可見特異性著色點，但各組間無明顯差異，說明3組細胞分化程度相同。成軟骨誘導分化的特異性基因ACAN和COL2A1在中段細胞的相對表達量均高于近端和遠端細胞。隨著誘導時間增加，COL2A1特異性基因的相對表達量逐漸增加，但ACAN基因的相對表達量逐漸下降，SOX9基因相對表達量只有在遠端細胞中隨著誘導時間增加而增加。ACAN基因是軟骨的主要結構成分之一，在維持軟骨結構和功能方面發揮著多種作用。SOX9基因主要負責正向調節軟骨細胞中膠原和細胞外基質基因的表達，COL2A1基因形成軟骨基質的基本網絡，馬臍帶血MSCs誘導分化為軟骨細胞時，在誘導7 d后可檢測到特異性基因SOX9基因mRNA表達，但在誘導分化21 d后檢測不到，在這兩個時間都可檢測到特異性基因COL2A1[24]。在不同部位人UC-MSCs體外誘導分化為成骨、成軟骨和成脂細胞的研究中，臍帶中段分離的MSCs在成軟骨細胞誘導分化中特異性基因COL-11和ACAN表達量均顯著高于靠近胎盤端和靠近胎兒端的細胞[25]。Merlo等[6]在研究人與馬的UC-MSCs體外誘導分化時，發現eUC-MSCs表現出較高的成軟骨和成骨分化能力。

綜上所述，馬同一臍帶不同部位分離得到的eUC-MSCs，雖在形態上無明顯差異，但中段eUC-MSCs細胞倍增時間顯著低于近端與遠端細胞；通過對多潛能性和表面標記分子的檢測可知，3組細胞均表達多潛能基因和間充質表面標記分子，不表達造血分子，且隨著傳代后細胞純度提高，大部分基因的相對表達量都有所增加；阿利新藍對3個部位eUC-MSCs軟骨誘導后染色結果相似，無法從染色結果上判斷差異性，但軟骨特異性基因的檢測表明只有遠端eUC-MSCs各基因相對表達量是隨著誘導時間持續上升的，說明本研究中設計的誘導時間節點更適合遠端eUC-MSCs進行誘導分化，而中段細胞對于軟骨特異性基因ACAN和COL2A1的相對表達量顯著高于近端和遠端eUC-MSCs。

4 結 論

本研究通過組織塊分離法得到3組eUC-MSCs，其形態呈成纖維狀和簇狀。3組eUC-MSCs細胞倍增時間分別為35.4(近端)、25.5(中段)和34.9 h(遠端)，平均倍增時間為31.9 h。3組eUC-MSCs均表達MSCs多潛能性基因NANOG、POU5F1和SOX2，高表達CD34、CD73、CD90和CD105，低表達CD14、CD19、CD45和CD79a表面標記分子，且具有分化為成軟骨細胞的潛能；隨著誘導時間的增加，成軟骨分化的特異性基因ACAN和COL2A1在中段細胞的相對表達量高于近端和遠端細胞。總的來說，在馬整段臍帶上都可以分離得到有價值的MSCs，但中段eUC-MSCs增殖能力和軟骨分化潛能優于近端和遠端分離得到的MSCs。