地菍粗多糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠脂代謝的影響

李 麗，朱 盼，郭興蘭，潘炳強(qiáng)，周敬凱，陳 俊

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西高校中藥藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530200)

肥胖是一種慢性疾病，也是Ⅱ型糖尿病、血脂異常癥、心血管疾病等發(fā)生的主要誘因，對(duì)人們的健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅[1]。目前，市場(chǎng)上用于治療肥胖的化學(xué)合成藥雖然很多，但長(zhǎng)期服用效果并不理想，而且存在嚴(yán)重的副作用，如頭疼、嘔吐、腸胃不適和血壓升高等。研究表明，許多中草藥植物提取精華和植物中活性成分可作為膳食補(bǔ)充劑干預(yù)肥胖[2]。近年來(lái)，富含多糖的植物的提取物用于降脂減肥作用的研究受到了廣泛關(guān)注[3-4]。地菍(別名地稔、鋪地稔)為野牡丹科植物地菍(MelastomadodecandrumLour.)的全草，植物資源豐富，是瑤醫(yī)的常用藥材之一[5-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，地菍具有降血糖、調(diào)血脂、抗氧化和保肝等多種藥理活性[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，地菍不同部位提取物對(duì)胰島素抵抗、鏈脲佐菌素(STZ)所致高血糖大鼠和小鼠模型(空腹血糖FBG>11.1 mmol/L)均有不同程度的降血糖和降血脂作用[8-14]，其中地菍粗多糖可降低STZ所致高血糖小鼠的血糖和血脂水平，提高小鼠的抗氧化能力[15]。地菍粗多糖還具有較強(qiáng)的自由基清除作用，并能抑制人紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化[16]。乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成的關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)脂肪酸合成和脂肪積累，可作為肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝等慢性代謝疾病潛在的治療靶點(diǎn)[17-18]。目前鮮見(jiàn)關(guān)于地菍粗多糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠干預(yù)作用的研究報(bào)道，本研究參考《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》的規(guī)定，在給予高脂、高糖食物誘發(fā)小鼠肥胖的同時(shí)用地菍粗多糖進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)肥胖小鼠體重、血脂水平等生理生化指標(biāo)變化及地菍粗多糖對(duì)肥胖小鼠體內(nèi)脂肪酸合成關(guān)鍵酶ACC1基因表達(dá)的影響，探究地菍粗多糖對(duì)肥胖發(fā)生的干預(yù)作用及其可能的作用機(jī)制，以期為地菍藥材的臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 地菍粗多糖及飼料 地菍購(gòu)自南寧小瑤王藥店，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室鑒定為地菍干燥全草。本試驗(yàn)所用的地菍粗多糖提取工藝如下：提取溶劑無(wú)水乙醇，固液比1∶3，加熱回流提取3次，過(guò)濾，得到藥渣揮發(fā)至無(wú)任何醇味備用。提取溶劑水，固液比1∶3，加熱回流提取3次，紗布過(guò)濾，得到水溶液，4 ℃、3 000 r/min離心15 min 后濃縮至藥與溶劑比為1∶1.5，在藥液中加入75%乙醇進(jìn)行沉淀，靜置24 h后4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取沉淀水浴蒸干，獲得地菍粗多糖備用。普通維持飼料(粗脂肪≥4%)購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；高脂飼料參考《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》的規(guī)定由實(shí)驗(yàn)室自行制作，配方為：蔗糖15%、豬油15%、蛋黃粉8%、膽固醇1%、膽酸鈉0.2%及普通維持飼料60.8%。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種雄性小鼠，17～21 g，購(gòu)自湖南斯萊克景實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004。

1.1.3 主要試劑及儀器 奧利司他膠囊購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；羧甲基纖維素鈉購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇、二甲苯、中性樹(shù)膠均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HE染液、分化液、返藍(lán)液與總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒購(gòu)自普洛麥格生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRTMGreen Master Mix均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。TECAN全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Infinite M200PRO)購(gòu)自TECAN公司；冷凍低溫離心機(jī)(5430R)購(gòu)自Eppendorf公司；電熱恒溫水浴鍋(HWS-26)購(gòu)自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；脫水機(jī)(JJ-12J)、包埋機(jī)(JB-P5)均購(gòu)自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)(RM2016)購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司；正置光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100)、成像系統(tǒng)(Nikon DS-U3)均購(gòu)自Nikon公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler96)購(gòu)自Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 SPF級(jí)昆明種雄性小鼠72只，于(22±2)℃、30%～70%濕度的動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照體重隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、陽(yáng)性組(奧利司他0.025 mg/g)、地菍粗多糖高、中、低劑量組(1.2、0.6、0.3 mg/g)。除空白組給予普通維持飼料外，其余各組均給予高脂飼料。造模時(shí)配合灌胃給與相應(yīng)藥物，灌胃藥物為0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制而成，灌胃時(shí)間為每天晚上19：00。飼養(yǎng)期間各組小鼠均自由采食和飲水，每天統(tǒng)計(jì)小鼠的攝食量(每只鼠每天攝取食物的重量)。

1.2.2 樣本收集與處理 30 d后，各組小鼠禁食12 h，稱(chēng)重，摘眼球采血，隨即頸椎脫臼處死。剝離腎臟及附睪周?chē)尽⒏闻K，用冰冷的生理鹽水清洗表面血水后用吸水紙擦干，稱(chēng)重，一部分用4%多聚甲醛溶液固定48 h，用于HE染色；一部分于-80 ℃保存。

1.2.3 小鼠體重、Lee’s指數(shù)測(cè)定 在試驗(yàn)過(guò)程中，每3 d測(cè)1次小鼠體重；試驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)小鼠體長(zhǎng)(鼻尖到肛門(mén)的長(zhǎng)度)，計(jì)算Lee’s指數(shù)。

Lee’s指數(shù)=[體重(g)×103/體長(zhǎng)(cm)]1/3

1.2.4 小鼠肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù)的測(cè)定 將小鼠處死后，取肝臟及附睪和腎臟周?chē)闹窘M織，稱(chēng)量其濕重，并計(jì)算肝臟指數(shù)和脂肪指數(shù)。

肝臟指數(shù)(%)=肝濕重(g)/體重(g)×100%

脂肪指數(shù)(%)=脂肪濕重(g)/體重(g)×100%

1.2.5 生化指標(biāo)檢測(cè) 采集的血樣于4 ℃、3 500 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C及肝臟TC、TG含量。

1.2.6 組織病理學(xué)觀察 取小鼠肝臟和脂肪組織，用4%多聚甲醛溶液固定48 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)特征。

1.2.7 肝臟脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的測(cè)定 用總RNA提取試劑盒提取小鼠肝臟總RNA，并測(cè)定RNA樣品濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。 根據(jù)GenBank中小鼠ACC1(登錄號(hào)：NM_133360.2)、β-actin(登錄號(hào)：NM_007393.5)基因的mRNA序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見(jiàn)表1。引物均由上海捷瑞股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸60 s，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

表1 引物信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 地菍粗多糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的體重、Lee’s指數(shù)、攝食量、臟器重量及臟器系數(shù)的影響

由表2可知，在未灌胃藥物前，各組小鼠的體重均無(wú)差異。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白組相比，模型組小鼠的終體重、Lee’s指數(shù)、肝臟重量及附睪和腎臟周?chē)局亓烤@著高于空白組(P<0.05)，表明小鼠肥胖模型建立成功。與模型組相比，高、中劑量地菍粗多糖組小鼠終體重、Lee’s指數(shù)、攝食量、肝臟及附睪和腎臟周?chē)镜闹亓烤@著降低(P<0.05)，低劑量地菍粗多糖組小鼠體重、脂肪重量變化不大(P>0.05)，陽(yáng)性組小鼠攝食量、肝臟重量變化不大(P>0.05)。由圖1可知，與空白組相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)、脂肪指數(shù)均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性組、高劑量地菍粗多糖組小鼠的脂肪指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

表2 各組小鼠體重、Lee’s指數(shù)、攝食量、臟器重量

與空白組相比，#，差異顯著(P<0.05)；與模型組相比，*，差異顯著(P<0.05)；無(wú)*，差異不顯著(P>0.05)。圖4同Compared with blank group，#，Significant difference( P<0.05)；Compared with model group，*，Significant difference (P<0.05)；No *,No significant difference (P>0.05).The same as fig.4圖1 各組小鼠肝臟指數(shù)及脂肪指數(shù)Fig.1 The liver and fat indexes of mice in each group

2.2 地菍粗多糖對(duì)小鼠血脂、肝臟脂類(lèi)水平的影響

由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C含量及肝臟TC、TG含量均顯著升高(P<0.05)，血清HDL-C含量下降，但差異不顯著(P>0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性組、高劑量地菍粗多糖組小鼠血清TC、TG、LDL-C及肝臟TC、TG含量均顯著降低(P<0.05)，HDL-C含量差異不顯著(P>0.05)；中劑量地菍粗多糖組小鼠血清TC、TG及肝臟TC含量均顯著降低(P<0.05)。

表3 各組小鼠血脂及肝臟脂類(lèi)測(cè)定結(jié)果

2.3 地菍粗多糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟、脂肪組織的影響

由圖2可知，空白組脂肪細(xì)胞體積較小，大小均一，形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)完整；與空白組相比，模型組脂肪細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞大小不均勻，排列不規(guī)則，相同視野范圍內(nèi)，模型組脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯減少，脂肪細(xì)胞體積明顯增大；與模型組相比，陽(yáng)性組和高、中、低劑量地菍粗多糖組小鼠脂肪細(xì)胞均不同程度的變小，相同視野范圍內(nèi)的脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯增多。

A，空白組；B，模型組；C，陽(yáng)性組；D，高劑量組；E，中劑量組；F，低劑量組。圖3同A，Blank group；B，Model group；C，Positive group；D，High dose group；E，Medium dose group；F，Low dose group.The same as fig.3圖2 各組小鼠脂肪組織切片(200×)Fig.2 Mouse adipose tissue section in each group (200×)

由圖3可知，空白組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)大小正常，無(wú)變性壞死，未見(jiàn)脂肪變性現(xiàn)象，肝細(xì)胞內(nèi)未出現(xiàn)脂滴；與空白組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了大小、數(shù)量不等的脂滴小空泡；與模型組相比，陽(yáng)性組和高、中、低劑量地菍粗多糖組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴小空泡明顯減少。

圖3 各組小鼠肝臟組織切片(200×)Fig.3 Mouse liver tissue section in each group (200×)

2.4 地菍粗多糖對(duì)小鼠肝臟脂代謝基因表達(dá)的影響

由圖4可知，與空白組相比，模型組ACC1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性組、各劑量地菍粗多糖組ACC1基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)，分別降低了20%、42%、15%和11%。

圖4 各組小鼠肝臟ACC1基因相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative expression of ACC1 gene in liver of mice in each group

3 討 論

體重、Lee’s指數(shù)和體內(nèi)脂肪含量是衡量肥胖程度的重要指標(biāo)[19-21]，控制體重或者減少體內(nèi)脂肪的積累是預(yù)防代謝性疾病的關(guān)鍵。本試驗(yàn)在用高脂飼料飼喂正常小鼠的同時(shí)，加以地菍粗多糖干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各劑量地菍粗多糖組均能不同程度地抑制小鼠體重的增長(zhǎng)，降低Lee’s指數(shù)與脂肪指數(shù)，尤其是高劑量地菍粗多糖組更明顯，說(shuō)明地菍粗多糖具有一定的抑制體重增長(zhǎng)的作用，可以降低高脂飲食小鼠體內(nèi)脂肪重量，抑制脂肪堆積。陽(yáng)性藥奧利司他雖能抑制膳食脂肪吸收，但短期內(nèi)并不抑制小鼠攝食量，而地菍粗多糖能在一定程度上抑制小鼠食欲，減少攝食量，降低終體重、Lee’s指數(shù)、肝臟重量和脂肪重量的效果優(yōu)于陽(yáng)性組，其影響原因有待進(jìn)一步探究。

血脂反映了脂肪代謝的情況，主要與體內(nèi)脂肪含量和機(jī)體對(duì)脂肪的利用有關(guān)，高脂飲食通常會(huì)導(dǎo)致血脂升高和血脂異常。研究表明，血清TC、TG和LDL-C水平的降低能有效地預(yù)防或減少心血管疾病的發(fā)生[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，地菍粗多糖能抑制高脂飲食誘導(dǎo)的血清TC、TG和LDL-C及肝臟TC水平升高，其效果與陽(yáng)性組沒(méi)有差異，說(shuō)明地菍粗多糖具有預(yù)防血脂和肝臟脂質(zhì)升高的作用，但HDL-C水平升高不顯著，可能是由于試驗(yàn)周期過(guò)短。肥胖是Ⅱ型糖尿病發(fā)病的危險(xiǎn)因素，且隨體重的增加危險(xiǎn)性增加，當(dāng)血脂異常時(shí)，脂肪組織分泌因子的功能不能正常發(fā)揮，會(huì)使胰島素抵抗加重而誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生[23]。研究表明，地菍粗多糖能夠降低糖尿病小鼠TC、TG、LDL-C水平，改善脂代謝紊亂，具有降血脂作用[15]，這與本試驗(yàn)地菍粗多糖能夠降低高脂飲食小鼠血脂及肝臟脂類(lèi)結(jié)果一致。

肝臟是體內(nèi)脂肪代謝的主要器官，機(jī)體脂肪代謝異常與肝臟組織病變密切相關(guān)[24]。本試驗(yàn)中，模型組小鼠肝臟重量、肝臟系數(shù)均高于空白組，表明高脂飲食會(huì)引起肝臟脂肪沉積，但其他劑量組無(wú)顯著性變化，肝臟組織病理切片未發(fā)現(xiàn)明顯肝臟脂肪變性，說(shuō)明地菍粗多糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的肝臟異常具有一定的預(yù)防作用。脂肪組織病理切片結(jié)果表明，高脂飲食可以增大脂肪細(xì)胞體積，增加細(xì)胞內(nèi)脂肪含量，而地菍粗多糖能有效減小小鼠脂肪細(xì)胞的體積，其效果與陽(yáng)性組沒(méi)有差異。

體內(nèi)脂肪酸合成和氧化分解的調(diào)節(jié)與肝臟中各種代謝酶及其相關(guān)基因的表達(dá)有著密切聯(lián)系。ACC基因可以催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，而后者作為長(zhǎng)鏈合成的前體，既為脂肪酸合成提供供體，又可變構(gòu)抑制脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體氧化，因此，ACC基因在脂肪酸合成和代謝中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。劉海燕等[25]通過(guò)構(gòu)建小鼠預(yù)防肥胖模型探討幾種植物多糖結(jié)構(gòu)與預(yù)防高脂飲食小鼠肥胖活性的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，白茶多糖、枸杞多糖、桑葉多糖均能下調(diào)脂質(zhì)合成基因ACC1的表達(dá)，有效改善脂質(zhì)代謝紊亂。本研究結(jié)果表明，高、中、低劑量地菍粗多糖均可以降低小鼠肝臟ACC1基因的表達(dá)水平，抑制脂肪酸合成，減少肝臟的脂肪積累，且高劑量地菍粗多糖對(duì)ACC1基因表達(dá)的抑制作用優(yōu)于奧利司他，提示地菍粗多糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠脂代謝具有調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而干預(yù)肥胖的發(fā)生。試驗(yàn)結(jié)果可為廣西瑤藥地菍藥材的研發(fā)應(yīng)用提供新的思路和試驗(yàn)依據(jù)，但地菍粗多糖干預(yù)肥胖發(fā)生的具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠進(jìn)行地菍粗多糖干預(yù)可減輕小鼠體重、降低血清及肝臟血脂水平、減少肝臟細(xì)胞內(nèi)的脂滴、抑制脂肪細(xì)胞的膨大，其作用機(jī)制可能與參與脂肪酸合成的ACC1基因的表達(dá)有關(guān)。