微生物發酵中藥的研究現狀及其在養殖業中的應用

楊新波，張曉軒，蔡亞南，倪宏波，趙 權，馬 赫

(1.吉林農業大學動物醫學院，長春 130118；2.青島農業大學動物醫學院，青島 266109)

微生物發酵中藥(以下簡稱發酵中藥)指用微生物處理中藥材及其有效成分，將中藥中的大分子物質轉化成能被腸道直接吸收的小分子物質，制備成含有新的有效成分，或當前有效成分含量增加的中藥制劑[1-2]。發酵法是中藥炮制的傳統方法，這種方法在中國最早的中藥學著作《神農本草經》中便有記載[3]。直到現在，臨床上也常使用發酵炮制的中藥，如六神曲、建神曲、半夏曲、沉香曲等[4]。傳統發酵技術是利用環境中的微生物在中藥中自然發酵，由于環境的溫度、濕度、酸堿度都無法精準控制，有時也會存在菌種不純，影響發酵質量[5]。但隨著現代微生態學、發酵工程等學科和技術的發展，現代發酵制藥技術不僅克服了傳統發酵技術發酵條件不可控的問題，更是可以根據發酵需求利用高純度的單一菌種或是混合菌種進行發酵[6]，因此發酵中藥在現代發酵技術的加持下能夠標準化、規?；a，這使得發酵中藥制劑種類不斷增加，質量也進一步提高，在畜牧、保健、化妝品等多個領域得到了更廣泛的應用[3,7]。以下舉例并闡述了發酵中藥的優勢，固體發酵、液體發酵、雙向固體發酵的優缺點，以及發酵中藥在畜禽養殖業和水產養殖業中的應用，討論了發酵中藥研究存在的問題及展望，旨在為發酵中藥的深入研究提供思路。

1 發酵中藥的優勢

1.1 提高有效成分提取率

能用來發酵的中藥一般是中草藥，中草藥中的有效成分大多在其細胞壁內，而植物細胞壁富含木質素、纖維素、果膠等致密結構成分，使細胞壁硬度增加且不易分解，阻礙了中藥有效成分從胞內釋出[3,8]。而通過微生物發酵所產生的胞外酶(如纖維素酶和果膠酶)可以一定程度地降解植物細胞壁，有助于中藥活性物質的溶出。楊旭等[9]通過微生物固態厭氧發酵煙梗，發現乳酸菌降解纖維素最為明顯，纖維素含量由20.83%降至15.90%；而芽孢桿菌可較好地分解木質素和半纖維素，木質素和半纖維素的含量分別由10.91%和10.66%降至5.55%和7.40%。金順義[10]用含有產朊假絲酵母、干酪乳桿菌、糞腸球菌的復合益生菌發酵王不留行和益母草，結果表明發酵后的中草藥有效成分均有不同程度地提高，如發酵中草藥中的可溶性黃酮、生物堿、粗多糖、皂苷等有效成分較未發酵前分別增加了55.14%、127.28%、55.42%、49.21%。

1.2 降低毒副作用

許多中藥雖然有很好的療效，但毒性很大，利用發酵法可將中藥毒副作用降低、減少不良反應[11]。傳統中藥雷公藤具有良好的免疫調節及抗炎作用，但因毒性較大嚴重限制了其在臨床上的應用。何欒櫻等[12]利用靈芝作為發酵菌種對雷公藤進行發酵，發現其主要毒性成分雷公藤內酯甲的準分子離子峰的峰強度由發酵前的184 028降低至123 972，說明經發酵后雷公藤內酯甲的含量減少，而雷公藤內酯甲含量減少與雷公藤的減毒作用直接相關。吳曉峰[13]比較了巴豆發酵品和其他巴豆炮制品及巴豆生品的物質基礎及毒性，采用小鼠灌胃給藥方式進行急性毒性試驗，結果生種仁的半數致死量(LD50)是0.308 g/kg，而滅菌種仁和發酵品靈巴菌質、白巴菌質的LD50分別是0.728、1.541和1.495 g/kg，毒性分別下降了136.4%、400.3%和385.4%，可見發酵和其他炮制法均可使巴豆的毒性降低，而且發酵法減毒效果最佳。中藥的毒性與其物質基礎息息相關，為進一步闡明發酵法降低巴豆毒性的作用機理，作者利用重量分析法和考馬斯亮藍G250染色法對巴豆的毒性成分脂肪油及總蛋白進行含量測定，結果表明經發酵后，脂肪油及總蛋白含量明顯低于生品及其他炮制品。并通過氣相色譜法-質譜法聯用技術(GC-MS)分析發現，脂肪油在整個發酵過程中共分離和鑒定出42種成分，其中相對含量在1.0%以上有11種，至發酵第32天時有6種成分與發酵剛開始(第0天)時相比含量有所增加，有5種成分則有所減少，且至少產生了8種新物質，說明巴豆發酵品與生品巴豆相比，脂肪油的種類和含量都存在明顯差異，也初步解釋了巴豆發酵品毒性降低的原因[13]，但是由于中藥成分的復雜性，巴豆中脂肪油及總蛋白組成成分變化與其藥效之間的相關性及其發酵品生物轉化的機制尚不清楚，有待于進一步研究和總結。

1.3 產生新的有效成分

微生物代謝過程中產生的某些初級代謝產物和次級代謝產物能夠與藥材中的活性成分及非活性成分發生反應，形成新的前體化合物[3,8,14]。這為中藥有效成分的合成及新活性物質的發現提供了新思路。李馨蕊等[15]從川芎內生真菌的發酵液中分離得到一個新的內酯化合物。Li等[16]用枯草芽孢桿菌發酵三七，發現在發酵過程中產生了一種抗腫瘤化合物人參皂苷Rh4，證明了微生物可以改變中藥的物質組成，從而導致藥效的改變。Chen等[17]從土大黃的共生真菌——尖孢鐮刀菌ZZP-R1的發酵液中分離得到了2種新的化合物：Fusariumins C(1)和D(2)，這2種新型鐮刀菌素分別對金黃葡萄球菌有較強和中等強度的抑制作用。張棟健[18]用傳統的自然發酵法炮制枳殼，發現了3種新成分，分別為圣草酚-7-O-葡糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷和5-去甲基川陳皮素，其中圣草酚-7-O-葡糖苷具有較強的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)清除能力，5-去甲基川陳皮素具有多樣的抗動脈粥樣硬化的生物活性。越來越多的研究表明，利用中藥的共生菌或者藥用真菌來發酵中藥材更容易產生新的活性物質，從而產生新療效，但目前產生新成分的機理研究較少。因此探討在一定發酵條件下，中藥在此過程中的化學變化，以及因這些變化而產生的藥理、毒理作用的改變和這些改變所產生的臨床意義，才是發酵中藥研究的核心和關鍵所在。

1.4 節約中藥資源

隨著國內外對中藥資源需求的不斷增加，中藥產業規模也快速增長，但目前中藥資源的利用度較低，中藥渣廢棄物對環境帶來的挑戰不容忽視[19]。據不完全統計，中國每年的中藥材產量在7 000萬t左右，而廢棄中藥渣在3 500萬t左右，中藥材利用率只有一半[20]。因此通過生物催化技術實現中藥材的有效開發已成為必由之路，利用微生物發酵將廢棄中藥渣中的有效成分進一步釋放，制成飼料或飼料添加劑可有效地對中藥資源進行二次利用。倪亮[21]利用黏質沙雷氏菌發酵中藥廢棄物，制備得到了具有抑菌活性的靈菌紅素，實現了廢棄中藥資源的有效利用。

2 中藥發酵技術

2.1 固體發酵技術

固體發酵是指在沒有或幾乎沒有自由水的條件下，以一定濕度農副產品為營養基質，以一種或多種菌種進行發酵的發酵技術，該發酵方法是從制曲工藝發展而來，后經改進優化形成[22-24]。

發酵中藥的新活性成分除了中藥本身化學成分的改變，還包括了微生物次級代謝產物[2]，而固體發酵更適用于生產次級代謝物，因為主要用于生產次級代謝物的微生物的菌絲形態非常適合在固體基質上生長[25]。固體發酵具有高轉化、高產出的優點，與液體發酵相比，可提高終產品的濃度，固體發酵技術可以轉化高達20%～30%的底物，而液體發酵技術最大僅能轉化5%[26]。固體發酵由于耗水量低，減少了污水的產生，因此這種方法更加環保[27-28]。而且固體發酵對發酵設備的要求較液體發酵技術更為簡單且易操作[29]。然而，固體發酵利用有機廢物生產酶的一項研究指出，固體發酵方法會導致CH4、NO2和NH3等揮發性有機化合物的釋放[30]。固體發酵是一種潛力巨大的發酵技術，不管是在微生物次級代謝產物和酶的生產上，還是在生物固體廢物的降解或再利用上，幾乎所有的報道都指出其相較液體發酵具有明顯的優勢。

2.2 液體發酵技術

液體發酵是指在適合的溫度、pH、氣體環境等條件下，以一定比例中藥材提取液和液體培養基為營養基質，以一種或多種菌種進行發酵的發酵技術，這種方法來源于抗生素的生產工藝，也稱為深層發酵[22,24]。

相較于固體發酵，液體發酵具有產物穩定性高、生產條件量化、可在線監測、自動化的優點，這使得它更適合于微生物產品的大規模工業生產[11,31-32]。而且液體發酵可以降低使用霉菌時真菌菌絲干燥的風險[33]，對可培養的微生物種類的限制也較少[25,27]。但是與抗生素相比，大多數中藥的直接抗菌作用較弱，它們在發酵過程中容易受到細菌的污染，因此需要嚴格的滅菌要求[34]。在目前采用的液體發酵工藝條件下，中藥中有效成分轉化率低，相對成本高，存在一定的藥材浪費[26]。此外，液體發酵的主要困難還有擴大菌絲培養[25]。雖然液體發酵是一種相對成熟的發酵技術，但是由于中藥在發酵過程中容易被雜菌污染，并且有效成分轉化效率較低，因此還需對液體發酵工藝及發酵設備進行優化。

2.3 雙向固體發酵技術

雙向固體發酵是在固體發酵技術的基礎上衍生而來，它是以中藥材替代傳統營養基質，以一種或多種藥用真菌進行發酵的發酵技術，其雙向性在于具有活性成分的藥性基質為藥用真菌提供生長所需營養，同時藥用真菌產生的酶又能改變藥性基質原來的組織成分，使其產生新成分，具有新功效[35]。 雙向固體發酵易產生新物質、新功效[34]，但因真菌與藥材之間的不同組合，使發酵產物和化學成分變得復雜，而且藥用真菌影響藥性基質的機理不明確，有待進一步研究探索。

3 發酵中藥在養殖業中的應用

中國是世界上最大的獸用抗生素生產國和使用國，而且中國近年生產的抗生素有一半用于動物飼料[36]。盡管抗生素的使用極大地促進了畜牧業的發展，但抗生素的濫用在動物體內造成大量殘留物，并通過食物鏈轉移耐藥細菌和基因，對人類健康構成威脅[37-38]。為此2019年農業農村部第194號公告指出，自2020年7月1日起，飼料生產企業停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。因此尋找合適的抗生素替代產品，成為很多研究者和從業人員的關注點。許多研究表明，發酵中藥具有提高動物生產性能、提高機體免疫力以及預防疾病的能力，可替代抗生素在養殖過程中的應用。

3.1 在生豬養殖中的應用

生豬生產在畜牧業經濟中占有很大比重，是全球農業經濟的支柱[37]。養豬業是抗生素濫用的重災區，牲畜糞便占獸用抗生素排放量的42.6%，而豬糞便占牲畜糞便中抗生素殘留量的98.7%[39]。微生物發酵中藥作為一種飼料添加劑，能夠降解抗營養因子、提高飼料的生物利用度、改善豬的胃腸功能、預防腹瀉、提高豬的生產性能和健康水平，因此有望代替生長促進劑在生豬養殖上的應用[40]。

3.1.1 降低仔豬腹瀉率并提高生產性能 方磊涵等[41]用乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌發酵白術、秦皮等中藥制成的發酵中藥飼喂仔豬，發現基礎飼糧組仔豬腹瀉率為5.58%，而發酵中藥組為2.65%，此種發酵中藥能夠降低仔豬腹瀉率。 王坤麗[42]用乳酸菌發酵清瘟敗毒散提取液制成的發酵中藥飼喂斷奶仔豬，即使是最大稀釋倍數組，較對照組斷奶仔豬的采食量(對照組587.8 g，發酵中藥400倍稀釋組648.9 g)、平均日增重(對照組297.5 g，發酵中藥400倍稀釋組345.8 g)也顯著提高，腹瀉率顯著降低(對照組31.2%，發酵中藥400倍稀釋組17.4%)。

3.1.2 增強懷孕母豬的繁殖性能 郭宏偉等[43]用乳酸菌發酵生乳散(黃芪、當歸、益母草等)制成的發酵中藥飼喂妊娠母豬，結果表明服用生乳散和發酵生乳散的母豬較對照組平均窩產活仔數分別提高了4.46%和14.55%，平均窩死胎數分別降低了14.44%和55.61%，仔豬斷奶重分別提高了9.83%和16.34%，顯然發酵生乳散相比于生乳散對母豬的繁殖性能和仔豬健康狀況有顯著提高與改善。金順義[10]用產朊假絲酵母、干酪乳桿菌、糞腸球菌發酵中草藥(王不留行、益母草)制成發酵中藥制劑，作為飼料添加劑飼喂泌乳母豬，提高了泌乳母豬的采食量、免疫力及泌乳力，顯著提高了仔豬的斷奶成活率和斷奶均重。

3.1.3 提高育肥豬的生產性能與胴體品質 葛如興等[44]用釀酒酵母菌等益生菌發酵含有黨參、黃芪等中藥材的營養基質，飼喂育肥豬，試驗組的免疫因子濃度和免疫細胞濃度均顯著高于對照組，同時瘦肉率和胴體重也均高于對照組，說明這種發酵中藥具有提高育肥豬免疫力和改善胴體性狀的功效。張治家[45]用嗜酸乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和糞腸球菌發酵黃芪、山楂等中藥制成的發酵中藥，同抗生素和基礎飼料飼喂育肥豬相比，抗生素組和發酵中藥組的平均日增重比基礎飼料組分別提高了4.1%和20.5%，腹瀉率分別下降了57.1%和71.4%，說明發酵中藥和抗生素在提高育肥豬生產性能和降低腹瀉率方面效果顯著，而且發酵中藥的效果優于抗生素。

3.2 在禽養殖中的應用

禽常患禽大腸桿菌病、壞死性腸炎以及由沙門菌或梭狀芽孢桿菌引起的疾病，這些疾病是家禽養殖中的一個主要問題，造成了巨大的經濟損失[46]，這類腸道感染多以抗生素防治[47]。目前發酵中藥在禽養殖業中的應用研究多集中于防治禽大腸桿菌病，提高肉禽的生長性能以及防治新城疫。

3.2.1 提高肉禽的生長性能 李雪雁等[48]用乳酸菌發酵中草藥飼料添加劑(黃芪、淫羊霍、甘草等)制成的發酵中藥飼喂廣東麻黃雜雛雞，4～5周后發酵中藥組平均重289.98 g、料重比為3.27∶1，對照組平均重240.89 g、肉料比為3.58∶1，說明該發酵中藥制劑提高了雛雞生長性能，降低了料肉比。汪鵬等[49]用枯草芽孢桿菌發酵中藥健雞散，飼喂白羽肉雞，健雞散組和發酵健雞散組較對照組平均體重分別提高了4.6%和13.1%，可見發酵健雞散和未發酵健雞散均能提高肉雞生產性能，而且發酵后效果更好。

3.2.2 防治禽大腸桿菌病 金海林[50]用保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌發酵中草藥(黃芩、金銀花、大青葉等)制成發酵中藥飼喂大腸桿菌病理模型雞，感染組的十二指腸分泌型IgA含量為76.63 μg/mL，十二指腸絨毛破壞嚴重，發酵中藥組的十二指腸分泌型IgA含量為45.78 μg/mL，十二指腸絨毛完整，說明這種發酵中藥對雞大腸桿菌有良好的抑制效果。顧艷麗等[51]用植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母發酵中草藥(穿心蓮、白頭翁、敗醬草等)制成發酵中藥液飼喂患大腸桿菌病模型雞，發酵中藥高劑量組、中劑量組和抗生素組的死亡率分別為20%、23.4%和20%，而治愈率分別為80%、70%和70%，說明中劑量發酵中藥液抗菌效果明顯，高劑量發酵中藥液效果優于抗生素。

3.2.3 防治新城疫 黃迪海[52]用雞腸道乳桿菌發酵金梔板青溶液(金銀花、梔子、板藍根)制成的發酵中藥，分別飼喂攻毒(新城疫病毒)前SPF公雞和攻毒后SPF公雞，死亡率分別降低了60%～70%和52%～60%，說明金梔板青發酵溶液具有防治新城疫的效果。張桂枝等[53]用枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、產朊假絲酵母發酵由黃芪、茯苓、黨參等組成的復方中藥，飼喂1日齡的肉雞，結果基礎飼糧組、基礎飼糧+LPS組、基礎飼糧+LPS+1%發酵中藥組的新城疫抗體效價指數分別為4.50、3.50、5.50，說明這種發酵中藥能有效地緩解脂多糖(LPS)應激對雛雞免疫功能的影響，并顯著提高了新城疫抗體效價。

3.3 在反芻動物養殖中的應用

發酵中藥在反芻動物上的應用較少，目前主要集中于疾病的預防。王颯爽等[54]用酵母菌和黑曲霉菌等復合菌劑發酵黨參、黃芪、白術等中草藥，飼喂成年隱性乳腺炎奶牛，試驗52 d，乳腺炎試驗組奶牛乳中體細胞數量從53.45×104/mL降到23.25×104/mL，而乳腺炎對照組則從52.17×104/mL升到66.89×104/mL，說明這種發酵中藥能顯著降低隱性乳腺炎奶牛的體細胞數量。梁文軍等[55]發明了一種由乳酸菌發酵姜半夏、陳皮、茯苓等中草藥的發酵中藥制劑，飼喂患乳房炎的奶山羊，試驗組的乳房炎治愈率在85%左右，對照組為45%左右，說明這種發酵中藥在防治山羊乳房炎上有良好的效果。

3.4 在水產養殖中的應用

水產養殖是提供可食用蛋白質的可持續農業生產模式之一[56]。水產養殖產量在過去20年中保持持續增長[57]，這得益于半集約化或集約化水產養殖方法以及抗生素的使用[58-59]，但也導致了養殖水產品中抗生素殘留和細菌耐藥。目前也有關于發酵中藥作為飼料添加劑在水產養殖中應用的研究。

3.4.1 提高生長性能 孫艷霞等[60]用乳酸菌發酵的中藥發酵膏飼喂南美白對蝦，0.4%中藥發酵膏組的成活率為90.48%、增重率為1944.1%，對照組成活率為61.19%、增重率為1068.2%，該中藥發酵膏可以顯著提高南美白對蝦的生長性能。趙倩等[61]用枯草芽孢桿菌發酵黃芪、甘草、板藍根等制成的發酵中藥飼喂鯉魚，2%發酵中藥組的增重率為210.69%、飼料系數為1.6，對照組的增重率為172.7%、飼料系數為1.94，可見該發酵中藥2%的添加量可以顯著提升鯉魚的生長性能。

3.4.2 優化腸道菌群 孫艷霞等[60]研究發現，發酵中藥膏顯著影響了南美白對蝦的腸道菌群結構，0.4%中藥發酵膏組的乳酸菌總數為12×106CFU/g、弧菌總數為1.4×106CFU/g，對照組的乳酸菌總數為1.3×106CFU/g、弧菌總數為14.4×106CFU/g，益生菌乳酸菌數量增加，致病性弧菌數量減少。趙倩等[62]用產朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌分別發酵黃芪、甘草、板藍根、枸杞等制成發酵中藥飼喂鯉魚，發現以鼠李糖乳桿菌發酵中藥組腸道菌群最豐富，與其他各組比較相似性最低。

3.4.3 防治疾病 謝炎福等[63]利用米曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌和嗜酸乳桿菌作為復合發酵菌種發酵大黃、板藍根、黃芩等復方中藥制成發酵中藥，飼喂出血病澎澤鯽，2%發酵中藥預防組較陽性對照組成活率提高75%，治療組成活率提高65%，顯示發酵中藥對嗜水氣單胞菌引起的鯽魚出血病均有明顯的預防和治療作用。

4 展 望

近年來，隨著國家飼料禁抗政策的實施，為中藥在畜牧行業中的擴大應用提供了重要的機遇，中藥在畜牧業綠色發展與健康產業、減抗、替抗以及在產業轉型中發揮著重要作用。但目前獸用中草藥制劑生產大多停留在初級階段，生產方式較為單一粗放，存在使用劑量偏大、有效成分難以溶出、中藥資源利用度差等弊端，影響了其在獸藥及飼料添加劑市場上的競爭力，因此通過生物催化技術實現中藥材的有效開發已成為必由之路。越來越多的研究表明，發酵中藥制劑可協同中藥與微生物的優勢與特長，在調節動物腸道微生物、提高動物生產性能、增強動物機體免疫力等方面具有顯著療效。因此發酵中藥制劑作為獸藥或飼料添加劑在養殖業中將得到更廣泛的應用，具有廣闊的應用前景及市場價值。

但是，目前發酵中藥的研究仍處于起步階段，對于其作用機理及物質基礎的研究仍相對匱乏：①發酵中藥的物質基礎還相對未知，目前研究多集中于已知活性成分含量的變化，對于生成的新物質研究較少，雖然對發酵前后物質基礎的研究難度較大，但只有全面了解中藥發酵前后理化性質和藥理作用的變化，以及產生臨床意義的改變，才能對發酵方法作出科學的評價，指導和促進發酵工藝的改進，以及制定相應的藥品質量標準，對發酵方法的發展具有極其重要的意義。②目前應用的微生物僅占已知微生物種類的一小部分，因此大量可用菌株仍有待挖掘，尤其是中藥共生菌、藥用真菌以及針對靶動物腸道微生物篩選出的有益菌株。如通過宏基因組和培養組等多組學聯合，篩選與豬腸道消化特點和屏障保護相關的特異性菌株，通過這些主要優勢菌群發酵中藥，可起到對患病豬腸道菌群精準調控的作用。③發酵機理，即活性成分和轉化產物之間的轉化機制尚不明確，因此缺乏能代表中藥功能的成分和藥理指標，也限制了最佳發酵條件的制定以及發酵工藝的改進和發展。④發酵中藥成分復雜，大部分發酵中藥的藥理作用機制尚不明確，如果將實驗藥理學和毒理學方法與化學方法結合起來研究發酵中藥，可使化學研究更注意活性物質發酵前后的改變，使其研究的針對性更強，更能體現發酵方法的本質。⑤發酵技術仍相對處于探索階段，暫時缺少穩定的產業技術體系和行業標準，因發酵技術有微生物的參與，更應該關注其衛生學檢查，例如細菌總數、霉菌總數及黃曲霉毒素等的限量檢查。因此應采用現代科學手段建立科學化、客觀化的質量標準，以更好地保證發酵品的質量安全、穩定及可控。

隨著菌種選育、生物發酵等技術的進一步發展，發酵中藥的物質基礎、藥效學及藥動學等數據的進一步完善，相信上述發酵中藥相關問題也會逐步得到有效解決，這對發酵工藝的規范化、發酵中藥質量標準化、管理現代化及發酵技術的發展具有重要意義，也將進一步加快發酵中藥制劑的產業化進程，實現中藥資源的可持續利用，以及開發安全、有效、經濟、質量可控的替抗藥物，符合無抗生態養殖的發展要求，具有重要的科學意義和社會價值。