大白豬ENO3基因多態(tài)性及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

趙玉強，陳 鑫，李清春，馬繼林，董銀河，汪德明，郭凌云，黃 濤

(1.烏魯木齊正大畜牧有限公司博士后科研工作站，烏魯木齊 830000；2.石河子大學動物科技學院，石河子 832000)

烯醇化酶(enolase,ENO)，又稱為磷酸丙酮酸脫氫酶，是一種金屬酶，負責催化糖酵解途徑中磷酸烯醇丙酮酸和2-磷酸甘油酸的相互轉(zhuǎn)化[1]。哺乳動物細胞中ENO存在3種亞型：α或非神經(jīng)元性烯醇化酶(NNE，ENO1)、γ或神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE，ENO2)和β或肌肉特異性烯醇化酶(MSE，ENO3)，它們是參與糖酵解或異生的細胞質(zhì)酶[2]。ENO1在許多組織中都有表達，ENO2只在神經(jīng)系統(tǒng)的細胞中表達，而ENO3定位于肌肉組織[3]。豬ENO3基因(Gene ID：692156)位于12號染色體上[4]，含有12個外顯子。Fougerousse等[5]研究表明，ENO3在增殖的成肌細胞和分化的肌管中表達，是人肌源性分化的最早標志物之一。在肌管的功能成熟階段，ENO3的數(shù)量增加[6]；ENO3缺乏會導(dǎo)致遠端糖酵解代謝性肌病[7]，提示ENO3可能參與調(diào)控肌肉的生長過程。Wu等[8]研究表明，ENO3基因的表達量在梅山豬和大白豬之間存在差異，且ENO3基因多態(tài)性與豬脂肪率、平均背膘厚、大理石紋及肌內(nèi)脂肪有關(guān)。以上研究提示，ENO3基因可能與肌肉的生成及豬的生長有關(guān)。目前，ENO3基因多態(tài)性與大白豬生長性狀的關(guān)聯(lián)分析鮮見報道。鑒于此，本試驗以大白豬為研究對象，應(yīng)用混池PCR擴增目的區(qū)段，通過CE測序挖掘多態(tài)位點，結(jié)合GenoPlexs分型技術(shù)辨別試驗個體的基因型，并與試驗群體的校正體重達100 kg時的日齡、日增重、背膘厚、眼肌面積、眼肌厚共5個性狀進行關(guān)聯(lián)分析，挖掘與生長性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點，以期為大白豬的分子標記輔助選育提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從新疆某公司下屬的種豬場選取316頭生長表現(xiàn)正常且表型記錄完整的經(jīng)產(chǎn)大白母豬，用耳缺鉗收集大白母豬的耳緣組織于裝有1 mL 75%酒精的1.5 mL離心管中，母豬耳標號與離心管編號依次對應(yīng)記錄，低溫運輸回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

瓊脂糖購自Biowest公司；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司。梯度PCR儀購自SensoQuest公司；電泳儀(DDY-8C型)購自北京六一生物科技公司；NanoDrop 2000型超微量分光光度計購自Thermo Fisher公司。

1.3 基因組DNA提取

用眼科剪在離心管中剪碎耳組織，按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)操作步驟提取DNA，分別用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計進行DNA完整性、濃度和純度檢驗，選擇條帶完整、明亮且濃度、純度均符合要求的樣本用于后續(xù)試驗。

1.4 引物設(shè)計與合成

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載豬ENO3基因全長序列(登錄號：NC_010454.4)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，用于擴增ENO3基因的各個外顯子及其附近區(qū)域，引物序列見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.5 混池建庫與PCR測序

從試驗群體DNA樣本中隨機選取40個樣本，每個樣本用移液器各取5 μL至同一個1.5 mL無菌離心管中，輕微振蕩混勻，利用表1引物對混合DNA樣進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系10 μL：2×EsTaqMasterMix(Dye) 5 μL，去離子水2 μL，Primer Mix(10 μmol/L) 1 μL，DNA模板 2 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(退火溫度見表1)30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸3 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定合格后將引物和混合DNA樣本送至生工生物工程(上海)股份有限公司，利用ABI測序儀進行CE測序，利用Chromas DNA分析軟件篩選多態(tài)位點。

1.6 GenoPlexs分型

篩選出基因多態(tài)位點后，利用多重PCR的靶向基因捕獲技術(shù)(GenoPlexs)對每個個體的目標SNP及其附近區(qū)域設(shè)計引物，通過PCR擴增富集目的片段，結(jié)合二代測序技術(shù)對每個樣本進行高深度測序，通過生物信息學分析對目標個體進行基因分型[9]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

在育種場測定并記錄316頭大白豬的表型信息：結(jié)測日齡、結(jié)測體重、結(jié)測背膘厚、結(jié)測眼肌面積和結(jié)測眼肌厚。利用電子過道秤測定活體體重，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)值；利用B超儀測定大白豬正常站立情況下倒數(shù)3-4肋間左側(cè)距背中線5 cm處的活體背膘、眼肌厚及眼肌面積，參照《種豬生產(chǎn)性能測定規(guī)程》(NY/T 822-2004)計算以上表型的校正數(shù)據(jù)。利用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行整理，利用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，采用LSD進行多重比較，分析各SNP位點與大白豬體重達100 kg時的日齡、日增重、背膘厚、眼肌面積和眼肌厚的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果用平均值±標準差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增產(chǎn)物

對大白豬ENO3基因外顯子1～10進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，7對引物PCR擴增產(chǎn)物條帶長度分別為675、801、499、633、420、684和706 bp(圖1)，均符合預(yù)期大小，可用于后續(xù)試驗。

1～7，ENO3基因外顯子PCR擴增產(chǎn)物；M，DL5000 DNA Marker1-7，PCR amplification products of ENO3 gene exons;M，DL5000 DNA Marker圖1 ENO3基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of ENO3 gene

2.2 突變位點測序峰圖

由圖2可知，通過混池PCR直接測序發(fā)現(xiàn)9個SNPs位點，均為已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含子突變位點，分別為：rs325279236(A/G)、rs342598032(A/G)、rs341541240(C/T)、rs329283992(G/C)、rs327882211(G/A)、rs345530479(G/C)、rs324943047(T/C)、rs786427749(A/-)和rs196953768(A/G)。其中rs196953768、rs324943047、rs327882211、rs341541240、rs325279236、rs342598032為轉(zhuǎn)換；rs345530479和rs329283992為顛換；rs786427749為缺失。

rs325279236、rs342598032、rs341541240、rs327882211和rs324943047是由反向測序獲得，其余位點均是由正向測序獲得rs325279236，rs342598032，rs341541240，rs327882211 and rs324943047 were obtained by reverse sequencing,and the remaining sites were obtained by forward sequencing圖2 ENO3基因突變位點測序峰圖Fig.2 Sequencing peak map of mutation sites of ENO3 gene

2.3 分型結(jié)果及群體遺傳學分析

送樣個體中有2個樣本由于嚴重降解導(dǎo)致分型失敗，其余樣本分型成功，基因分型結(jié)果見表2。由表2可知，9個SNPs位點中，rs196953768、rs324943047、rs345530479、rs329283992、rs342598032和rs786427749的優(yōu)勢基因型分別為AG、TC、GC、GC、AG和A/-，均為雜合型，rs327882211、rs341541240和rs325279236位點的優(yōu)勢基因型分別為GG、CC和AA，均為純合型；9個SNPs位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。ENO3基因遺傳多樣性分析結(jié)果見表3。由表3可知，rs196953768、rs324943047、rs345530479、rs329283992和rs342598032位點雜合度較高，rs786427749、rs327882211、rs341541240和rs325279236位點純合度較高；多態(tài)信息含量(PIC)均屬于中度多態(tài)，說明這些位點所受到的選擇壓力較小，可用作候選分子標記。

表2 ENO3基因的基因型頻率及基因頻率

表3 ENO3基因遺傳多樣性分析

2.4 連鎖不平衡分析

由圖3可知，rs196953768與rs324943047、rs345530479、rs329283992間完全連鎖(D’=1，r2=1)，與rs342598032呈強連鎖(D’=1,r2=0.99)；rs327882211與rs341541240、rs325279236呈強連鎖(D’=1,r2>0.7)，其余多態(tài)位點間呈弱連鎖。

淺灰色表示D’<0.3；灰色表示0.3≤D’<0.6；深灰色表示0.6≤D’<1；黑色表示D’=1；數(shù)字表示r2值的小數(shù)點后兩位，不顯示數(shù)字表示完全連鎖(r2=1，D’=1)Light gray indicates D’<0.3；Gray means 0.3≤D’<0.6；Dark grey indicates 0.6≤D’<1；Black indicates D’=1；And a number indicates the r2 value to two decimal places，no number indicates full linkage (r2=1，D’=1)圖3 ENO3基因SNP連鎖分析Fig.3 SNP linkage analysis of ENO3 gene

2.5 ENO3基因多態(tài)性與大白豬生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表4可知，rs196953768位點GG基因型個體體重達100 kg時的日齡顯著小于AG基因型(P<0.05)，日增重顯著高于AG基因型(P<0.05)，其余性狀各基因型間差異均不顯著(P>0.05)；rs327882211位點AA基因型個體體重達100 kg時的眼肌面積和眼肌厚均顯著小于GA和GG基因型(P<0.05)，其余性狀各基因型間差異均不顯著(P>0.05)；rs341541240位點CC基因型個體體重達100 kg時的眼肌面積和眼肌厚均顯著高于TT基因型(P<0.05)，其余性狀各基因型間差異均不顯著(P>0.05)；rs325279236位點AA基因型個體體重達100 kg時的眼肌面積顯著高于GG基因型(P<0.05)，其余性狀各基因型間差異均不顯著(P>0.05)；rs786427749、rs342598032位點各性狀在各基因型間差異均不顯著(P>0.05)。

表4 ENO3基因SNPs與大白豬生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

生豬育種在中國的發(fā)展相對較晚，雖然近年來逐漸受到重視，但仍有待完善。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，動物育種技術(shù)已進入分子水平，分子育種技術(shù)對豬的育種和生產(chǎn)產(chǎn)生了巨大影響[10]，其中，分子標記輔助選擇結(jié)合常規(guī)育種方法加速了遺傳改良進程[11]。因此，挖掘與性狀相關(guān)的SNPs作為輔助選擇的分子標記位點，對提高生豬養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟效益、增強中國育種能力有著重要意義。多重PCR靶向捕獲技術(shù)是在單一PCR反應(yīng)體系中加入2對或2對以上引物，用于富集目的片段，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑盒操作過程與一般PCR相同[9]，且MPprimer[12]、MultiPLX[13]等軟件均可用于多重PCR引物的設(shè)計。同時結(jié)合二代測序技術(shù)對富集到的目的片段構(gòu)建測序文庫，上機進行深度測序[14]，用以獲得高質(zhì)量的目的序列。通過數(shù)據(jù)質(zhì)控、過濾及質(zhì)量評估，比對到參考基因組，對目標區(qū)域序列進行基因組定位和功能注釋，分析SNP、InDel后對樣品進行準確分型。該技術(shù)的優(yōu)勢是支持針對任一位點設(shè)計引物，其特異性、測序深度及覆蓋度均較高，能夠明顯提高效率，降低經(jīng)濟成本[15]。本試驗中獲得了較好的基因分型結(jié)果，送測316個樣本，成功檢測314個樣本，多態(tài)位點檢出率為99.37%，充分說明了該技術(shù)的可靠性。

ENO3基因在豬肌肉發(fā)育不同階段存在明顯的表達差異，但其多態(tài)性對豬生長性狀的影響鮮見報道。 ENO3定位于肌肉組織，α-烯醇化酶在肌肉發(fā)育過程中轉(zhuǎn)換成β-烯醇化酶[16]。在個體發(fā)育過程中，橫紋肌分化伴隨著β-烯醇化酶的增加和α-烯醇化酶的減少[5,17]。提示ENO3基因可能參與調(diào)控肌肉的生長發(fā)育。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ENO3基因存在9個SNPs位點，均符合Hardy-Weinberg平衡定律，處于中度多態(tài)，且與大白豬生長性狀有一定的關(guān)聯(lián)。

生物群體中，由于2個位點在染色體上的距離足夠近，導(dǎo)致這些位點上的等位基因經(jīng)常出現(xiàn)在同一染色體上，使得遺傳時位點上的等位基因出現(xiàn)非隨機組合的現(xiàn)象，就是連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)，又稱基因的連鎖遺傳[18]。位點間的距離與LD程度呈明顯的負相關(guān)，即距離越近，LD程度越高。SNP的連鎖性在遺傳中普遍存在，彭婭鑫等[19]、李常紅等[20]研究均發(fā)現(xiàn)存在完全連鎖或強連鎖的SNP。本試驗中，rs196953768與rs324943047、rs345530479、rs329283992間完全連鎖(D’=1，r2=1)，與rs342598032呈強連鎖，進一步分析發(fā)現(xiàn)，rs342598032位點SNP與其余SNPs間沒有完全連鎖，可能是由于測序錯誤造成該位點判定的基因型與真實基因型產(chǎn)生偏離，也可能是由于該位點與其余位點距離較遠使得LD程度降低。

Li等[21]通過分析豬編碼基因區(qū)公共SNP發(fā)現(xiàn)，豬ENO3基因BV726865_302位點與剪切力呈顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，人ENO3基因的2個錯義突變與一種罕見的代謝性肌病有關(guān)[22]；ENO3蛋白與綿茵安瓊奶牛的肌肉嫩度和大理石紋密切相關(guān)[23]；ENO3的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平在瘦肉型豬和脂肪型豬間存在顯著差異[8,24-25]。上述研究均提示，ENO3基因可能對動物骨骼肌的發(fā)育有著重要的影響。本研究通過對大白豬ENO3基因的9個SNPs位點與生長性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs196953768、rs324943047、rs345530479、rs329283992與體重達100 kg時的日齡和日增重呈顯著相關(guān)，rs327882211、rs341541240與體重達100 kg時的眼肌面積和眼肌厚呈顯著相關(guān)，rs325279236與體重達100 kg時的眼肌面積呈顯著相關(guān)，說明這些位點均可作為對應(yīng)性狀的候選分子輔助標記。而rs786427749和rs342598032與上述表型的相關(guān)性均不顯著，可能不是影響這些性狀的重要標記，不適用于本試驗大白豬群體生長性狀選育。綜上所述，ENO3基因多態(tài)性顯著影響大白豬部分生長性狀，但這些位點能否作為大白豬生長性狀相關(guān)的遺傳標記，還需要在更多、更大的群體中驗證；同時，還需要從ENO3基因的功能及其SNP的作用機制出發(fā)加以驗證。

4 結(jié) 論

本研究共鑒定到9個SNPs，其中rs196953768與rs324943047、rs345530479、rs329283992完全連鎖，與大白豬體重達100 kg時的日齡和日增重均呈顯著相關(guān)，rs327882211、rs341541240與大白豬體重達100 kg時的眼肌面積和眼肌厚均呈顯著相關(guān)，rs325279236與大白豬體重達100 kg時的眼肌面積呈顯著相關(guān)；共篩選到7個與生產(chǎn)性狀顯著相關(guān)的SNPs，可為大白豬的分子標記輔助選育提供數(shù)據(jù)支撐。