白藜蘆醇對體外培養的水牛卵丘細胞增殖活力及其相關基因mRNA表達的影響

鄭海英，楊春艷，李玲玉，唐麗萍，鄭 威，尚江華

(中國農業科學院廣西水牛研究所，農業農村部水牛遺傳繁育技術重點實驗室，南寧 530001)

卵丘細胞是卵母細胞周圍的一種顆粒細胞，具有維持卵母細胞減數分裂停滯狀態，幫助誘導減數分裂恢復和促進細胞質成熟等特殊的生理功能。卵丘細胞的增殖、擴展和凋亡會影響卵母細胞成熟、受精及后續早期胚胎的發育。卵丘-卵母細胞在體外成熟培養過程中易受外界環境影響，細胞內氧化-抗氧化系統平衡易被打破，引起卵丘-卵母細胞內產生過多的活性氧(ROS)，使卵丘-卵母細胞遭受氧化損傷，進而影響卵母細胞體外成熟并降低胚胎體外生產效率[1]。白藜蘆醇(resveratrol，RES)屬非黃酮類多酚化合物，是一種天然植物抗毒素，存在于花生、葡萄、紫斑牡丹、桑椹和虎杖等多種植物中，RES具有抗氧化、抗腫瘤[2]、抗炎[3]、抗凋亡[4]和抗衰老[5]等多種生物活性。RES通過影響卵母細胞膜和氧化體系來清除自由基，調節卵母細胞周期、增殖和凋亡相關基因的表達，提高胚胎發育潛能[6]。研究發現，0.5 μmol/L RES能提高綿羊卵丘細胞的擴展和孕酮(P4)的濃度，并減少卵母細胞內ROS含量，增強了卵母細胞抗氧化能力以促進卵母細胞體外成熟[7-8]。邢鵬等[9]研究發現，50 μmol/L RES顯著提高了人卵泡顆粒細胞抗凋亡基因B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)表達量，降低了凋亡標記基因半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表達量，從而增強了顆粒細胞的抗凋亡能力，但添加10 μmol/L RES則無顯著差異。Wang等[10]研究發現，1 μmol/L RES能夠提高牛卵丘細胞擴展和卵丘細胞P4分泌量，并通過調節牛卵母細胞抗氧化酶相關基因的表達，促進卵母細胞成熟。在豬上的研究發現，添加2 μmol/L RES顯著下調了Caspase-3和促凋亡基因Bcl-2相關蛋白(Bax)的表達，抑制了卵母細胞凋亡[11]。同時Li等[12]研究發現，添加2 μmol/L RES維持了豬卵母細胞內超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶在一個平衡狀態。另外研究顯示，成熟液中添加1 μmol/L RES，同樣能夠提高小鼠卵母細胞內CAT和超氧化物歧化酶1(SOD1)的表達，改善卵母細胞的質量[13]。在氧化應激狀態下，10 μmol/L RES顯著下調小鼠心肌及內皮細胞p21蛋白表達量，延緩了細胞衰老[14]。目前，關于RES對水牛卵丘-卵母細胞體外成熟的影響及其作用尚不明確。因此，本試驗以水牛卵丘細胞為研究對象，探究添加RES對卵丘細胞活力、激素分泌及卵丘擴展相關基因(透明質酸合酶2(HAS2)、穿透素3(PTX3)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2))、凋亡相關基因(Bcl-2、Bax、Caspase-3、細胞周期蛋白激酶抑制因子(p21))和抗氧化酶相關基因(SOD1、CAT)表達的影響，為研究RES對水牛卵母細胞成熟及發育的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 卵巢采集 試驗所用水牛卵巢取自南寧市某屠宰場。采集的水牛卵巢放入含有雙抗、溫度為25～30 ℃的生理鹽水保溫杯中，在2～3 h 送回實驗室。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基和胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；實時熒光定量PCR試劑SYBR?Premix ExTaqTM購自寶生物工程(大連)有限公司；雌二醇(E2)和P4ELISA試劑盒均購自江蘇酶標生物科技有限公司；白藜蘆醇、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素、鏈霉素、磷酸緩沖液(PBS)、胰蛋白酶、透明質酸酶均購自Sigma公司。

RES濃儲液配制：使用DMSO溶解白藜蘆醇，配制20 mmol/L的濃儲液。

1.2 方法

1.2.1 水牛卵丘細胞的收集與培養 用10 mL注射器穿刺抽吸卵巢上4～8 mm大小卵泡的卵泡液。在體視顯微鏡下用撿卵針挑選細胞質均勻、包裹有2層以上卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復合體(cumulus oocyte complexes,COCs)，用PBS液清洗3次，轉入0.1%透明質酸酶中消化并用移液槍反復吹打使卵丘細胞與卵母細胞完全分離，挑出裸露的卵母細胞。用1.5 mL離心管收集卵丘細胞混懸液，2 500 r/min離心5 min，棄上清后用DMEM培養液離心洗滌2次。將收集的卵丘細胞接種于細胞培養板中培養(培養液為：DMEM培養基+10%FBS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)，24 h細胞開始貼壁生長。培養2～3 d，貼壁細胞達到50%～60%匯合度即可進行添加白藜蘆醇分組試驗：以DMEM+10% FBS為基礎液，將RES濃儲液配制成1、10、20、30、40、50、60 μmol/L的培養液，以不加RES(0 μmol/L)為對照組。 所有試驗均重復3次。

1.2.2 細胞活力測定 將水牛原代卵丘細胞調整為105/mL,以每孔100 μL接種到96孔細胞培養板中，在37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度的培養箱中培養至細胞匯合度達50%時，棄去原培養液，添加0(對照組)、1、10、20、30、40、50、60 μmol/L的RES繼續培養12、24、36、48及60 h時，分別更換新培養液100 μL和CCK-8 10 μL，于培養箱中繼續孵育4 h后，采用酶標儀測定吸光度，測定波長為450 nm。每組設3個復孔。 以只加培養液的孔為空白組。 細胞活力(%)=(D處理組-D空白組)/(D對照組-D空白組)×100。通過檢測各組的細胞活力篩選最佳RES濃度及處理時間進行后續試驗。

1.2.3 細胞培養液中激素含量檢測 對照組和最佳RES濃度組水牛卵丘細胞培養36 h后，用移液槍吸取細胞上清液，采用ELISA法測定E2和P4的含量。

1.2.4 總RNA提取、反轉錄及實時熒光定量PCR檢測 對照組和最佳RES濃度組水牛卵丘細胞培養36 h后，用PBS清洗3次，用微量RNA提取試劑盒提取水牛卵丘細胞總RNA，經反轉錄合成cDNA。然后根據GenBank中牛HAS2、PTX3、PTGS2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、SOD1、CAT和p21基因的參考序列，利用NCBI Primer Blast設計引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以β-actin為內參基因，以cDNA為模板，用實時熒光定量PCR檢測各基因的表達。PCR反應體系15 μL：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 5.9 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。每個樣品設置3個重復，用Roche LightCycler 480采集熒光信號并分析，用2-△△Ct方法計算各目的基因的相對表達量。

表1 引物信息

續表

1.3 統計分析

用SPSS 20.0統計軟件對數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Duncan’s法進行多重比較，結果用平均值±標準差表示，用GraphPad Prism 5.0軟件進行繪圖。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 RES對水牛原代卵丘細胞增殖活力的影響

由表2可知，與對照組相比，在體外培養24～36 h內，1、10和20 μmol/L RES組水牛卵丘細胞的增殖活力均有升高趨勢，在培養36 h時，10 μmol/L RES組細胞活力顯著高于對照組(P<0.05)，1和20 μmol/L RES組與對照組差異不顯著(P>0.05)。但培養36 h后，隨著添加時間的延長，細胞增殖活力呈逐漸下降趨勢，且40、50和60 μmol/L RES組無論作用時間長短，細胞活力均顯著低于對照組(P<0.05)，抑制卵丘細胞生長。10 μmol/L RES組細胞活力最強，因此，選擇10 μmol/L RES為后續試驗的最佳添加濃度。

表2 不同濃度RES組水牛原代卵丘細胞的增殖活力

2.2 RES對水牛原代卵丘細胞E2和P4分泌的影響

由圖1可知，與對照組相比，10 μmol/L RES組水牛卵丘細胞E2和P4分泌量均顯著高于對照組(P<0.05)。

與對照組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同Compared with control group, *, Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01)；No *, No significant difference (P>0.05). The same as below圖1 RES對水牛原代卵丘細胞E2、P4分泌的影響Fig.1 Effects of RES on E2 and P4 secretion of buffalo primary cumulus cells

2.3 RES對水牛原代卵丘細胞擴展、凋亡和抗氧化相關基因表達的影響

實時熒光定量PCR檢測結果表明，與對照組相比，10 μmol/L RES組卵丘細胞擴展相關基因PTX3、抗凋亡基因Bcl-2、抗氧化基因SOD1的mRNA表達量均顯著增加(P<0.05)，PTGS2基因表達量極顯著增加(P<0.01)，HAS2和CAT基因表達量均無顯著差異(P>0.05)；促凋亡基因Bax、p21和Caspase-3的表達量極顯著或顯著降低(P<0.01；P<0.05)(圖2)。

圖2 RES對水牛原代卵丘細胞HAS2、PTX3、PTGS2、Bax、Bcl-2、Caspase-3、SOD1、CAT及p21基因相對表達量的影響Fig.2 Effects of RES on the relative expression of HAS2,PTX3,PTGS2,Bax,Bcl-2,Caspase-3,SOD1,CAT and p21 genes of buffalo primary cumulus cells

3 討 論

卵丘細胞作為卵母細胞周圍的一種顆粒細胞，在卵泡發育和成熟卵泡排卵或閉鎖過程中發揮著重要作用，且顆粒細胞分化、增殖及其與卵母細胞之間的信號交流決定著卵母細胞的命運。同時卵巢顆粒細胞是雌性動物體內重要的類固醇激素分泌細胞，可合成并分泌E2和P4及其他一些細胞因子，這些類固醇激素對于雌性動物的正常生理節律和妊娠過程均至關重要。本研究發現，不同濃度RES對水牛卵丘細胞的增殖活力及E2和P4分泌有一定影響，體外培養36 h內低濃度RES促進細胞增殖，36 h后細胞增殖能力逐漸下降。而無論培養時間長短，高濃度RES均抑制卵丘細胞增殖。在培養36 h，10 μmol/L RES條件下，卵丘細胞增殖能力最強，卵丘細胞E2和P4分泌量增加。Ortega等[15]在大鼠上的研究顯示，10和30 μmol/L RES對顆粒細胞培養24和48 h的P4分泌量無顯著影響，同時隨濃度的升高顯著降低E2分泌量及芳香化酶基因(CYP19)的表達。Basly等[16]研究MFC-7細胞發現，10和25 μmol/L RES表現出E2興奮性作用，而0.1和1 μmol/L則表現出抗E2樣作用。本研究結果與上述10 μmol/L RES的研究結果不一致，可能與添加RES培養時長和細胞類型不同有關。而與在綿羊[7]和牛[10]上細胞E2分泌量降低結果正好相反，推測RES是通過正反饋作用促進水牛卵丘細胞E2的分泌。因為RES既可作為一種選擇性的E2受體調節劑,也可作為芳香化酶的抑制劑，在不同的動物試驗中表現出不同程度的E2受體激動劑活性[17]，并競爭性地與卵丘細胞上的E2受體結合，當卵丘-卵母細胞的E2受體達到飽和狀態，便會通過負反饋作用調節降低卵丘細胞E2的分泌量。

本試驗檢測卵丘細胞擴展、凋亡和抗氧化相關基因的mRNA表達量發現,10 μmol/L RES能顯著上調水牛卵丘細胞PTX3、PTGS2、Bcl-2和SOD1基因的表達量，顯著下調Bax、Caspase-3和p21基因的表達量。卵丘細胞擴展依靠相關基因的參與，以保證卵丘細胞的完整、擴展及卵母細胞的成熟。卵丘細胞的擴展程度是評價卵母細胞成熟及其質量的關鍵指標之一，卵丘擴展相關基因HAS2、PTGS2和PTX3促進卵丘細胞的增殖和擴展[18]。HAS2主要參與卵丘細胞外基質透明質酸酶的合成，PTGS2參與相關激素的信號轉導途徑，PTX3在卵丘細胞外基質的組織中起關鍵作用[19]。研究發現，體外成熟培養液中添加2 μmol/L RES可提高豬的卵丘細胞擴展、極體形成及調節卵母細胞成熟過程中的基因表達[11]。RES作為一種抗氧化劑，具有很強的活性氧清除能力，能夠清除氧自由基和羥自由基，并通過調節與細胞凋亡有關基因的表達，可減少細胞凋亡[20]。本研究結果與人卵泡顆粒細胞添加50 μmol/L RES的研究結果基本一致，但與添加10 μmol/L RES的結果不同[15]。Kwaka等[11]研究發現，添加2 μmol/L RES對豬卵母細胞Bcl-2基因的表達無顯著影響，但明顯下調了Caspase-3和Bax基因的表達，抑制了卵母細胞凋亡。該研究結果與在牛[17]和山羊[21]卵母細胞研究的結果一致。然而，在人乳腺癌細胞體外培養中發現RES存在劑量依賴效應，低濃度促進細胞分裂、抑制細胞凋亡，高濃度則抑制細胞增殖、促進細胞凋亡[22]。另外對在豬卵母細胞研究顯示，添加10 μmol/L的RES時，Bax基因表達量升高，Bcl-2基因表達量下降，細胞呈現凋亡狀態，Bcl-2基因表達量甚至低于對照組[23]。 這與Lee等[24]和Torres等[17]添加高濃度RES所得研究結果類似，但與本研究添加10 μmol/L的RES研究結果恰好相反，推測這可能與不同物種、不同細胞類型、不同的細胞培養基成分及添加后培養時長差異有關。體外培養過程中會產生氧化應激從而導致卵丘-卵母細胞的衰老和死亡，而抗氧化酶對于機體的抗氧化能力起到重要的作用。大量的體外研究表明，添加一定濃度的RES，細胞內的ROS水平明顯降低，能夠緩解多種因素誘導的氧化應激[25]。對小鼠和豬的研究發現，添加一定濃度的RES顯著提高了卵母細胞CAT、SOD1和Bcl-2基因的表達量，維持了豬卵母細胞內SOD和CAT等抗氧化酶基因在一個平衡狀態，從而改善卵母細胞的質量[12-13，23]。當細胞受到氧化應激時，細胞周期異常調控會導致細胞增殖失控等細胞正常功能異常發生。p21基因是抑癌基因，具有誘導細胞周期阻滯、促進細胞衰老和凋亡等功能，p21在細胞凋亡、分化方面具有重要作用。研究發現，氧化應激狀態下，10 μmol/L RES顯著下調小鼠心肌及內皮細胞p21蛋白量，延緩了衰老[14]。Liang等[26]對中年小鼠注射RES可以有效改善氧化應激引起的輸卵管卵母細胞衰老。本研究結果顯示，10 μmol/L RES顯著上調SOD1基因的表達量，下調p21基因的表達量，與上述研究結果基本一致。

4 結 論

本試驗結果表明，添加10 μmol/L RES體外培養36 h能夠顯著提高水牛卵丘細胞增殖活力，促進卵丘細胞分泌E2和P4，顯著促進水牛卵丘細胞擴展相關基因(PTX3、PTGS2)、凋亡抑制基因Bcl-2和抗氧化基因SOD1的相對表達，并顯著降低促凋亡基因Bax、Caspase-3和p21的表達。 說明10 μmol/L RES能夠促進水牛卵丘細胞增殖和擴展，提高卵丘細胞抗氧化能力的同時減少細胞凋亡，并參與水牛卵丘細胞激素分泌的調節。