卵母細胞來源對水牛體細胞核移植胚胎發育潛能的影響

李玲玉，鄭海英，陳明棠，唐麗萍，尚江華，楊春艷

(中國農業科學院廣西水牛研究所，農業農村部水牛遺傳與繁育技術重點實驗室，南寧530001)

在過去的10年中，水牛作為一種乳肉兼用的經濟型家畜受到了越來越多的關注，尤其是奶水牛產業的發展使水牛的開發和利用邁入了一個新階段。然而，水牛繁殖周期長、繁育率普遍較低，嚴重制約了水牛產業的發展。近年來，科學家們嘗試使用不同的輔助生殖技術(ART)提高水牛的繁殖效率，包括性別控制、活體采卵(OPU)、體外受精(IVF)、體外胚胎生產(IVEP)、體細胞核移植(SCNT)和徒手克隆[1-4]等技術。其中，SCNT可充分利用豐富的沼澤型水牛卵巢，其卵母細胞可作為核移植的受體，采集并培養具有優良遺傳基因的河流型水牛體細胞作為核移植的供體，在短期內可生產大量的優秀河流型水牛[4]。

在家畜上，關于屠宰場(SLH)和活體采卵來源卵母細胞體外受精及體外胚胎生產結果并不完全一致。水牛活體采卵-體外受精胚胎的囊胚率顯著高于屠宰場卵巢-體外受精胚胎，但其分裂率無顯著差異[5]，黃牛活體采卵-體外受精胚胎的囊胚率顯著低于屠宰場卵巢組[6]。對山羊的研究發現，活體采卵和屠宰場來源卵母細胞不影響其體外成熟率、受精胚胎的分裂率及囊胚率[7]。此外，在體外胚胎生產研究中發現，囊胚中的E-鈣黏蛋白(E-cadherin)可介導細胞黏著和胞外信號到胞質的傳遞，且作為一種依賴Ca2+的細胞黏連糖蛋白，在早期胚胎發育過程的細胞識別、遷移和組織分化中具有關鍵作用[8]，常被用以預測早期胚胎發育。而轉錄因子Sox2是胚胎發育的先鋒因子，在早期胚胎的內細胞團中表達，因此Sox2標志著早期胚胎發育的發生[9]。目前，SCNT的受體卵母細胞主要來源為屠宰場卵巢，多為淘汰的低繁殖性能或高齡母水牛，其卵母細胞質量較差，而活體采卵技術可反復從適齡的良種河流型水牛體內得到優質的卵母細胞用于SCNT[10]。本實驗室已通過SCNT技術先后培育了30余頭克隆水牛[11-12]。然而，與屠宰場來源卵巢相比，通過活體采卵技術獲得的卵母細胞數量有限，在一定程度上會限制SCNT的應用。因此，本研究擬將屠宰場卵巢和活體采卵來源的卵母細胞體外成熟培養后用于SCNT，比較SCNT重構胚的融合率、分裂率、囊胚率及胚胎發育潛能相關蛋白E-cadherin和Sox2的表達水平，以探明卵母細胞來源對SCNT重構胚發育能力及發育潛能關鍵蛋白表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

TCM199、牛血清白蛋白(BSA)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液、表皮生長因子(EGF)和胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、丙酮酸鈉、半胱氨酸、細胞松弛素B等均購自Sigma公司；35 mm培養皿、載玻片及蓋玻片等耗材均購自Thermo Fisher公司；兔源E-cadherin(ab16505)、鼠源Sox2(ab97959)一抗及Hochest 33342購自Abcam公司；山羊抗兔IgG H&L、山羊抗鼠IgG H&L二抗均購自Bioworld公司。試驗需用的主要儀器包括超聲波活體采卵儀(2100，TOKYO公司)、集卵杯(CCA-200，富士平公司)、體視顯微鏡(DM750，萊卡公司)、紡錘體觀察儀(CRI，Nikon公司)、倒置顯微鏡(TE200-S，Nikon公司)、電融合儀(ECM-2001，BTX公司)、二氧化碳培養箱(Heracell VIOS V160i，Thermo公司)、激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1，Nikon公司)。

1.2 卵母細胞的采集

試驗共分為2組，分別為活體采卵組(OPU組)和屠宰場卵巢組(SLH組)。OPU組所用10頭非泌乳期尼里-拉菲水牛供體來自廣西水牛研究所種畜場，年齡、營養狀況和飼養條件一致，年齡(6.40±0.65)歲，體重(602.0±80.0)kg。利用B超或內窺鏡監測并穿刺水牛卵巢上的可見卵泡，進行活體采卵，具體操作參照Liang等[13]所述方法。SLH組所用屠宰場尼里-拉菲水牛卵巢來自廣西南寧屠宰場，當天宰殺取得的新鮮卵巢置于37 ℃生理鹽水中保存，2～3 h運回實驗室，用連接有10 mL注射器的17號針頭抽吸所有3～8 mm卵泡，收集的卵泡液在體視顯微鏡下挑選包裹3層以上卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)。

1.3 SCNT重構胚的構建

1.3.1 卵母細胞體外成熟 挑選包裹2層及以上卵丘細胞的COCs，每10～20枚COCs放入覆蓋石蠟油的40 μL體外成熟培養液(TCM199+10% FBS+5 μg/mL FSH+10 μg/mL LH+0.2 mmol/L丙酮酸鈉+1 μg/mL E2+50 μmol/L半胱氨酸+25 ng/mL EGF)微滴中，38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養22～24 h。卵母細胞成熟以排出第一極體為標志。

成熟率(%)=排出第一極體卵母細胞數/入孵總卵母細胞數×100%

1.3.2 供體細胞復蘇培養 從液氮中取出凍存的水牛耳纖維細胞，37 ℃水浴解凍后，加入2 mL細胞培養液(DMEM+10% FBS)混勻，2 500 r/min離心5 min，細胞沉淀用細胞培養液重懸，接種至40 μL微滴中繼續培養，每24 h換液。待細胞長至40%～50%，更換為含0.5% FBS的DMEM培養液進行血清饑餓處理3～5 d，用0.25%胰蛋白酶進行消化，1 500 r/min離心5 min收集細胞用于SCNT。

1.3.3 重構胚的融合和激活 COCs成熟后，用移液槍反復吹吸去除COCs周圍的卵丘細胞。挑選具有第一極體的卵母細胞并將其移入去核液(TCM199+10% FBS+7.5 μg/mL細胞松弛素B)中，利用紡錘體觀測儀進行精確去核，然后沿著去核時留下的透明帶切口將單個供體細胞注入卵母細胞的卵周間隙，使之與卵母細胞緊密接觸，獲得SCNT重構胚。將SCNT重構胚移至融合液(250 mmol/L山梨醇+0.1 mmol/L醋酸鈣+0.5 mmol/L醋酸鎂+0.5 mmol/L HEPES+0.1% BSA)中清洗2次后，轉入含融合液的1 mm3融合槽內，撥動重構胚使卵母細胞與體細胞的接觸面與電流方向垂直，施加2次電脈沖(1 kV/cm，10 μs)進行電融合。電融合后，將重構胚移入胚胎培養液(TCM199+10% FBS)中，在38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下的培養箱中培養30 min，體視顯微鏡下觀察卵周隙，未見體細胞則視為融合成功。

融合后的重構胚用5 μmol/L離子霉素激活處理5 min，然后用2 mmol/L的二甲氨基嘌呤(dimethylaminopurine,6-DMAP)培養3～4 h。激活的重構胚轉移到含有單層顆粒細胞的40 μL培養液微滴中，在38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，每2 d換液1次，培養48 h，觀察并統計重構胚的分裂率，5～8 d觀察并統計囊胚率。

1.4 E-cadherin和Sox2蛋白免疫熒光檢測

發育至7 d的SCNT重構胚用PBS清洗3次，在室溫下于4%多聚甲醛溶液中固定30 min，PBST(含0.1% Tween-20的PBS)清洗3次，5 min/次，而后轉移到含有0.1% Triton X-100的滲透液中通透30 min，用PBST清洗后移入封閉液(PBST+5% BSA)中室溫封閉1 h，PBST清洗后轉移到一抗(E-cadherin 1∶250，Sox2 1∶200)中，陰性對照組不孵育一抗，置于濕盒中4 ℃孵育過夜；PBST清洗后轉入二抗(山羊抗兔IgG H&L，1∶1 000，山羊抗鼠IgG H&L，1∶1 000)中室溫孵育2 h，PBST清洗后移入10 μg/mL的Hoechst 33342中進行核復染15 min，PBST清洗后轉入玻片上少量的抗淬滅劑微滴中，用蓋玻片覆蓋固定，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。利用Image J v1.8.0軟件對其熒光強度進行分析，用平均熒光強度半定量表征特異性蛋白E-cadherin及Sox2的表達。

1.5 數據統計與分析

用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 不同來源卵母細胞體外成熟效果

由表1可知，OPU組卵母細胞體外成熟率顯著高于SLH組(P<0.05)。

表1 各組卵母細胞體外成熟率

2.2 不同來源卵母細胞對SCNT重構胚發育潛能的影響

由表2、圖1可知，OPU組SCNT重構胚的融合率和分裂率與SLH組相比差異均不顯著(P>0.05)，囊胚率顯著高于SLH組(P<0.05)。

表2 各組SCNT重構胚的融合率、分裂率和囊胚率

圖1 各組SCNT重構胚不同發育階段的狀態(200×)Fig.1 State of SCNT reconstructed embryos at different developmental stages in each group (200×)

2.3 不同來源卵母細胞SCNT胚胎E-cadherin和Sox2蛋白表達水平

由圖2可知，E-cadherin蛋白定位于細胞膜上，Sox2蛋白分布在細胞核膜及細胞質中。由圖3可知，OPU組SCNT胚胎E-cadherin和Sox2蛋白的平均熒光強度均顯著高于SLH組(P<0.05)。

圖2 各組SCNT重構胚E-cadherin及Sox2蛋白免疫熒光檢測(400×)Fig.2 Imunofluorescence detection of E-cadherin and Sox2 proteins of SCNT reconstructed embryos in each group (400×)

*,差異顯著(P<0.05)*,Significant difference (P<0.05)圖3 各組SCNT重構胚E-cadherin及Sox2蛋白的平均熒光強度Fig.3 Mean fluorescence intensity of E-cadherin and Sox2 of SCNT reconstructed embryos in each group

3 討 論

體細胞核移植在科學研究和遺傳繁育應用方面均具有重要意義，但目前體細胞克隆效率較低，其應用受到了很大的限制。在體細胞核移植中，卵母細胞作為受體可以為供體核遺傳物質的重編程提供材料，同時為胚胎的進一步發育提供所需的營養物質[14-15]，因此卵母細胞的質量被認為是影響SCNT效率的一個關鍵因素。有研究表明，利用活體采卵穿刺母牛卵泡獲得的卵母細胞，在體外成熟24 h的成熟率[16]、體外受精后的胚胎分裂率和囊胚率[17]均顯著高于屠宰場卵巢卵母細胞。本研究結果顯示，OPU組獲得的卵母細胞體外成熟率顯著高于SLH組，SCNT胚胎的囊胚率也顯著高于SLH組，此結果與黃牛不同來源卵母細胞的體外受精胚胎發育效率[8,17]相似。這可能是由于每周2次的活體采卵，致使卵巢卵泡發育波反復重置并增加了卵泡發生波的頻率[18-19]，使更多的原始卵泡發育成為成熟卵泡，且活體采集操作會在卵泡閉鎖前將卵母細胞吸出，減少了成熟卵泡的閉鎖，從而提升了活體采集卵母細胞的質量。相比于活體牛卵巢的繁殖性能狀態，屠宰場的水牛多為淘汰母牛，卵巢繁殖性能相對低下，且卵巢處于的卵泡發生波階段不定，導致活體采集卵母細胞的質量高于屠宰場來源卵母細胞，從而影響之后的胚胎發育能力。

本研究利用免疫熒光技術檢測了不同來源卵母細胞SCNT胚胎的E-cadherin和Sox2蛋白表達水平，發現OPU組SCNT胚胎中的E-cadherin和Sox2表達水平均高于SLH組SCNT胚胎。E-cadherin蛋白是一種黏附連接蛋白，在細胞與細胞間的黏附連接、緊實連接及細胞核形成中起著關鍵作用[20-21]，且可以作為細胞信號傳導的重要調節劑，維持細胞及胚腔結構的完整性[22]。有研究表明，健康囊胚中E-cadherin蛋白大量表達，其低表達水平會導致胚胎在致密化過程中產生極性，抑制胚胎細胞的分化，從而引起胚胎發育能力低下，甚至發育停滯[22-23]。Sox2蛋白是胚胎發育的先鋒轉錄因子，對維持胚胎干細胞(ES)多能狀態起關鍵作用[12]。在哺乳動物早期胚胎發育過程中，Sox2轉錄因子是內細胞團的形成標志[12,24]，也是早期胚胎發育發生的標志。前人的研究發現，Sox2定位于細胞核中，在胚胎發育的2-細胞期合子基因組中表達，且桑椹胚期和囊胚期之間的表達顯著增加[25]。利用基因編輯手段全身性敲除Sox2會致死胚胎[12]，條件性敲除Sox2會影響胚胎干細胞的特性，同時抑制了胚胎干細胞的增殖[26]，而在減數分裂的卵母細胞中敲除Sox2，并不會影響卵母細胞的形成[27]，說明Sox2對于卵母細胞成熟不是必需的，但在控制早期胚胎發育及誘導胚胎干細胞的多能分化中具有重要功能。本研究中OPU組SCNT胚胎的Sox2蛋白表達量高，進一步提示了OPU與屠宰場組SCNT重構胚的發育能力差異可能與其胚胎多能性分化能力相關。

本研究中OPU組SCNT重構胚的E-cadherin及Sox2蛋白表達均顯著高于SLH組SCNT胚胎，表明OPU組SCNT重構胚細胞間具有更強的黏附能力和胚胎完整性，且高表達的Sox2蛋白可能上調了SCNT胚胎的干細胞向神經或生殖細胞方向分化，滋養層細胞分化后分泌合成更多的促生長發育因子，繼而促進SCNT胚胎發育，但具體的信號傳導通路仍需要進一步研究探討。

4 結 論

本研究結果表明，OPU組卵母細胞的體外成熟效率顯著高于SLH組的卵母細胞，OPU組SCNT重構胚E-cadherin和Sox2蛋白的表達水平顯著高于SLH組SCNT重構胚，初步揭示了SLH組SCNT效率低下的原因。 試驗結果進一步解釋了屠宰場來源水牛卵母細胞SCNT重構胚低發育潛能的原因，也為研究活體和屠宰場卵巢來源卵母細胞SCNT重構胚的后續發育潛力及相關信號傳導提供理論基礎。