線粒體融合蛋白2基因干擾與過表達對布魯氏菌誘導巨噬細胞凋亡的影響

謝珊珊，楊 琴，鄧肖玉，易繼海，王 震，陳創夫

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.人獸共患傳染性疾病防治協同創新中心,石河子 832000；3.動物疫病防控兵團重點實驗室，石河子 832000)

布魯氏菌病是一種由布魯氏菌引起的人獸共患傳染病，對人類健康和畜牧經濟發展具有極大威脅[1]。布魯氏菌致病機制的一個關鍵是其與宿主細胞的相互作用，它能夠利用自身的多種機制逃避宿主細胞的識別及殺傷，適應胞內環境并進行復制及生存[2]。布魯氏菌侵入細胞后，可通過調控宿主細胞的凋亡過程影響布魯氏菌的胞內存活[3-4]。線粒體是細胞供能的主要細胞器，其形態的異常和功能的紊亂是造成細胞凋亡的主要因素[5]。研究表明，布魯氏菌感染后會破壞線粒體的形態，引起線粒體發生腫脹、嵴減少和斷裂[6]，布魯氏菌也常常會因為打破線粒體正常的功能運轉環境，從而誘發細胞凋亡。

線粒體融合蛋白2 (mitochondrial fusion protein 2，MFN2)是位于線粒體外膜的蛋白，通過調節線粒體形態，間接調控其功能及細胞凋亡[7]，同時也是維系內質網與線粒體物理連接的關鍵物質，對于內質網和線粒體間的鈣離子傳遞至關重要[8]，在細胞增殖、細胞凋亡等過程中扮演著重要角色[9]。此外，有研究發現，MFN2與抗病毒感染密切相關，MFN2可作為抗病毒信號的抑制劑[10]。Lee等[11]研究表明，巨噬細胞中MFN2的過表達促進了結核分枝桿菌的生長，MFN2通過調節細胞凋亡來調節結核分枝桿菌的胞內存活。結核分枝桿菌和布魯氏菌都是兼性胞內寄生菌，但MFN2在布魯氏菌感染巨噬細胞過程中發揮的作用還未明確，深入探索MFN2的功能可為進一步解析布魯氏菌的致病機制提供理論依據。

本研究通過RNA干擾和過表達技術對MFN2基因進行改造，建立MFN2基因的干擾和過表達轉染巨噬細胞RAW264.7模型，用布魯氏菌侵染干擾和過表達MFN2基因的細胞，進而探究MFN2基因干擾及過表達對布魯氏菌誘導的細胞凋亡的影響，以期為MFN2基因功能的研究及布魯氏菌致病機制的解析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞和質粒 小鼠巨噬細胞系RAW264.7和牛種布魯氏菌A19疫苗株(Brucellaabortus vaccine strain A19)為動物疫病防控兵團重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 兔抗B淋巴細胞-2相關X蛋白(BAX)單克隆抗體(14796S)購自CST公司；兔抗線粒體融合蛋白2(MFN2)單克隆抗體(ab124773)購自Abcam公司；RNA提取試劑盒(CW0581)和cDNA第一鏈合成試劑盒(CW2569)購自康為世紀生物科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒(abs50001)購自上海愛必信生物科技有限公司；Advanced DNA RNA轉染試劑(AD6OOO50)購自Zeta Life公司。高通量實時熒光定量PCR儀(QuantStudioTM 5 Real-Time PCR Instrument)購自賽默飛世爾科技公司；流式細胞儀(FACSCalibur)購自BD公司；SDS-PAGE電泳儀(DYY-7C)購自北京六一儀器廠；凝膠成像系統(SYSTEM Gel Doc XR+)購自Bio-Rad公司。

1.2 siRNA與引物的設計與合成

在GenBank中查找MFN2基因序列(登錄號：NM_133201)和BAX基因序列(登錄號：NM_173894)，利用RNA干擾技術設計針對MFN2基因的3條特異性siRNA序列siMFN2-450、siMFN2-1161和siMFN2-2275和1條陰性干擾對照siMFN2-Negative序列(表1)；用Primer Premier 5.0軟件設計MFN2和BAX基因的引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.3 pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質粒的構建及雙酶切鑒定

利用DNA純化回收試劑盒回收MFN2基因目的片段后，用pcDNA3.1-EGFP載體在T4 DNA連接酶的作用下4 ℃連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，放入搖床中37 ℃震蕩40～60 min，隨后接種到含有氨芐西林(Amp)的LB固體培養基上，倒置放于37 ℃隔水培養箱中，過夜培養10 h后，挑取陽性菌落，進行菌落PCR鑒定。PCR反應體系20 μL：Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH2O 7.6 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環。鑒定正確的重組質粒送成都生工生物技術有限公司測序。用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ內切酶對測序正確的pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質粒進行雙酶切驗證，酶切反應體系為20 μL，其中pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質粒8 μL，兩種內切酶各1 μL,10× Buffer 2 μL，ddH2O 8 μL，37 ℃酶切4 h。

1.4 MFN2干擾和過表達的轉染及鑒定

1.4.1 siRNA及pcDNA3.1-EGFP-MFN2的轉染 干擾組按終濃度50 nmol/L分別取siMFN2-450、siMFN2-1661、siMFN2-2275和siMFN2-Negative(對照)各5 μL，再分別與5 μL Advanced DNA RNA轉染試劑混勻；過表達組分別取6 μg的pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質粒和pcDNA3.1-EGFP空質粒，再分別與6 μL的Advanced DNA RNA轉染試劑混合，將混合物室溫孵育10～15 min。最后，將制備好的混合物分別加入處于對數生長期的巨噬細胞中，正常生長的巨噬細胞作為未轉染組(NC)，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h后換液。在轉染48 h后，收集各組細胞檢測MFN2的轉錄和表達情況。

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測MFN2的干擾及過表達效率 轉染48 h后，用Trizol裂解細胞，按照RNA提取試劑盒說明書和cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行RNA的提取及反轉錄，以反轉錄產物cDNA為模板，GAPDH為內參基因，用實時熒光定量PCR檢測MFN2的轉錄水平。實時熒光定量PCR反應體系10 μL：SYBR 5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環；每孔設置3個重復對照，每組細胞每個時間點的細胞做3個重復。

1.4.3 Western blotting檢測MFN2的干擾及過表達效率 轉染48 h收集細胞，加入200 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，13 000 r/min離心10 min，留上清，用BCA法測蛋白濃度后進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉膜、洗膜，室溫封閉(0.5 g脫脂奶粉+10 mL TBST) 2 h，與MFN2單克隆抗體(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，與二抗(1∶5 000)常溫共孵育2 h，用顯色液在凝膠成像系統中曝光，觀察并拍照。

1.5 MFN2對布魯氏菌誘導的細胞凋亡的影響

1.5.1 布魯氏菌侵染巨噬細胞 干擾和過表達MFN2的巨噬細胞在轉染24 h后進行布魯氏菌侵染。將提前接種且活化的布魯氏菌8 000 r/min離心5 min，收集菌液，按照一定的比例稀釋后用比濁儀測定菌液的濃度，按照細菌數量∶細胞個數=100∶1的侵染比例將菌液加到細胞中，布魯氏菌侵染分為干擾組(siMFN2-1661組、siMFN2-Negative組和未轉染組)和過表達組(pcDNA3.1-EGFP-MFN2組、pcDNA3.1-EGFP組和未轉染組)，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，1 h后換新鮮的細胞培養液，然后加入慶大霉素繼續孵育45 min；孵育完畢后漂洗、換新鮮細胞培養液，繼續培養至6、12和24 h，收集細胞進行后續試驗。

1.5.2 實時熒光定量PCR和Western blotting檢測BAX的轉錄和表達 分別提取1.5.1中收集細胞的RNA和蛋白，按照1.4.2和1.4.3操作步驟對BAX進行實時熒光定量PCR和Western blotting檢測。

1.5.3 細胞凋亡率檢測 將1.5.1中各組細胞培養24 h，用不含EDTA的0.25%的胰酶進行消化，800 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌3次，然后用Binding Buffer重懸細胞，按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行細胞處理后，立即用流式細胞儀進行檢測。

1.6 數據統計與分析

用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，Image J軟件計算蛋白表達灰度值，GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結果用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 MFN2過表達重組質粒的雙酶切鑒定

由圖1可知，在6 000 bp處出現與pcDNA3.1-EGFP載體片段大小相符的條帶，在2 000 bp處出現與插入基因MFN2大小相符的條帶，結果與預期一致。測序結果顯示，鑒定正確的陽性重組質粒序列與GenBank上發表的MFN2基因序列一致，表明pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質粒構建成功。

M，DL1000 DNA Marker；1，pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質粒Hind Ⅲ、BamH Ⅰ雙酶切；2，pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質粒M,DL1000 DNA Marker;1,Double digestion of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 recombinant plasmid by Hind Ⅲ and BamH Ⅰ;2,pcDNA3.1-EGFP-MFN2 recombinant plasmid圖1 pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質粒的雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pcDNA3.1-EGFP-MFN2

2.2 siRNA及pcDNA3.1-EGFP-MFN2的轉染

2.2.1 MFN2干擾序列的篩選與驗證 干擾序列轉染結果顯示，與siMFN2-Negative組相比，3條干擾序列均能抑制MFN2的轉錄，siMFN2-1661處理組MFN2相對表達量最低，且極顯著(P<0.01)(圖2A)，siMFN2-450處理組顯著抑制MFN2的轉錄(P<0.05)；Western blotting結果與PCR鑒定結果相符(圖2B、2C)，因此siMFN2-1661為最佳干擾序列，可用于后續試驗。

①A，MFN2干擾序列實時熒光定量PCR檢測；B，MFN2干擾序列Western blotting檢測；C，蛋白的相對表達量。②*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同①A,Real-time quantitative PCR detection of MFN2 interference sequences;B,Western blotting detection of MFN2 interference sequences;C,Relative expression of protein.②*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);No *,No significant difference (P>0.05).The same as below圖2 MFN2干擾序列的實時熒光定量PCR和Western blotting檢測Fig.2 Real-time quantitative PCR and Western blotting detection of MFN2 interference sequences

2.2.2 MFN2重組過表達質粒轉染效果鑒定 由圖3可知，細胞中有綠色熒光蛋白表達，說明轉染成功，可用于進行后續試驗。重組過表達質粒結果顯示，轉染pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質粒過表達的巨噬細胞中MFN2的轉錄和蛋白表達水平均極顯著高于轉染pcDNA3.1-EGFP組(P<0.01)，而轉染pcDNA3.1-EGFP組與未轉染組無顯著差異(P>0.05)(圖4)。

A、B，pcDNA3.1-EGFP轉染細胞的明、暗場視野；C、D，pcDNA3.1-EGFP-MFN2 轉染細胞的明、暗場視野A and B,Light and dark fields of pcDNA3.1-EGFP transfected cells;C and D,Light and dark fields of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 transfected cells圖3 pcDNA3.1-EGFP-MFN2重組質粒的轉染結果(40×)Fig.3 Transfection results of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 recombinant plasmid (40×)

A，pcDNA3.1-EGFP-MFN2實時熒光定量PCR檢測；B，pcDNA3.1-EGFP-MFN2過表達效率Western blotting檢測；C，蛋白的相對表達量A,Real-time quantitative PCR detection of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 overexpression efficiency;B,Western blotting detection of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 overexpression efficiency;C,Relative expression of protein圖4 pcDNA3.1-EGFP-MFN2過表達效率檢測Fig.4 Detection of pcDNA3.1-EGFP-MFN2 overexpression efficiency

2.3 MFN2對布魯氏菌誘導的BAX表達水平的影響

2.3.1 MFN2干擾對布魯氏菌誘導的BAX表達水平的影響 布魯氏菌侵染后，siMFN2-1661組BAX的轉錄水平極顯著高于siMFN2-Negative組和未轉染組(P<0.01)(圖5A)；Western blotting結果與實時熒光定量PCR結果(圖5B、5C)相符，說明干擾MFN2能夠促進布魯氏菌誘導的巨噬細胞凋亡。

A，BAX基因實時熒光定量PCR檢測；B，BAX蛋白Western blotting檢測；C，蛋白的相對表達量。圖6同A,Real-time quantitative PCR detection of BAX gene;B,Western blotting detection of BAX protein;C,Relative expression of protein.The same as fig.6圖5 MFN2干擾對布魯氏菌誘導的BAX表達變化的影響Fig.5 Effects of MFN2 interference on changes in BAX expression induced by Brucella

2.3.2 MFN2過表達對布魯氏菌誘導的BAX表達水平的影響 布魯氏菌侵染后，pcDNA3.1-EGFP-MFN2組BAX的mRNA表達水平顯著低于pcDNA3.1-EGFP組(P<0.05)，而未轉染組與pcDNA3.1-EGFP組BAX的mRNA表達水平差異不顯著(P>0.05)(圖6A)；Western blotting結果與實時熒光定量PCR結果(圖6B、6C)相符，表明MFN2基因的過表達可降低布魯氏菌誘導細胞凋亡的能力。

圖6 MFN2過表達后對布魯氏菌誘導的BAX表達變化的影響Fig.6 Effects of MFN2 overexpression on changes in BAX expression induced by Brucella

2.4 MFN2對布魯氏菌誘導的細胞凋亡的影響

2.4.1 MFN2干擾對布魯氏菌誘導的細胞凋亡的影響 由圖7可知，布魯氏菌感染后，干擾組的細胞凋亡率極顯著高于siMFN2-Negative組和未轉染組(P<0.01)(圖7)，進一步說明干擾MFN2的表達能夠促進布魯氏菌誘導的巨噬細胞凋亡。

A～C，分別代表未轉染組、siMFN2-Negative和siMFN2-1661組細胞凋亡流式圖；D，各組的細胞凋亡率A-C,Flow cytometry pictures of apoptosis of untransfected,siMFN2-Negative and siMFN2-1661 transfected groups,respectively;D,Apoptosis rate in each group圖7 MFN2干擾對布魯氏菌誘導的細胞凋亡的影響Fig.7 Effects of MFN2 interference on Brucella induced apoptosis

2.4.2 MFN2過表達對布魯氏菌誘導的細胞凋亡的影響 由圖8可知，pcDNA3.1-EGFP-MFN2組細胞凋亡率極顯著低于pcDNA3.1-EGFP組和未轉染組(P<0.01)，pcDNA3.1-EGFP組與未轉染組的細胞凋亡率差異不顯著(P>0.05)，表明過表達MFN2基因能夠抑制布魯氏菌誘導細胞凋亡的能力。

A～C，分別代表未轉染組、pcDNA3.1-EGFP和pcDNA3.1-EGFP-MFN2轉染組細胞凋亡流式圖；D，各組細胞凋亡率A-C,Flow cytometry pictures of apoptosis of untransfected,pcDNA3.1-EGFP and pcDNA3.1-EGFP-MFN2 transfected groups,respectively;D,Apoptosis rate in each group圖8 MFN2過表達對布魯氏菌誘導的細胞凋亡的影響Fig.8 Effects of MFN2 overexpression on Brucella induced apoptosis

3 討 論

近年來，RNA干擾技術經常被用來研究基因功能，siRNA是RNA干擾的重要中間產物[12]。設計合成干擾序列后，利用轉染試劑對合成的siRNA序列進行干擾效率檢測，篩選出高效siRNA干擾序列[13]。siRNA合成方便且操作簡單，是研究基因功能的有力工具[14]。本研究通過合成MFN2基因的3條siRNA干擾序列，篩選到1條干擾效率最好的siRNA-1661序列進行后續試驗，與siMFN2-Negative組相比，siRNA-1661轉染組細胞能夠極顯著抑制MFN2 mRNA及蛋白水平的表達。研究表明，病毒載體會對體外培養的細胞產生毒性，影響細胞增殖與分化，可能會進一步導致試驗結果出現偏差[15]。本研究中通過構建pcDNA3.1-EGFP-MFN2過表達載體轉染小鼠巨噬細胞的方法來實現MFN2基因的過表達，該法簡單、方便，對細胞毒性較小。

線粒體是細胞的能量工廠，其形態和功能的異常與細胞凋亡息息相關[16]。MFN2參與調節線粒體形態，從而間接調控細胞凋亡[7-8]。研究表明，布魯氏菌感染豚鼠后會使線粒體發生斷裂及碎片化，破壞線粒體的形態[6]。最新研究還發現，MFN2參與結核分枝桿菌的胞內生存機制[11]，同時與巨噬細胞的吞噬、殺菌作用緊密相關[17]。巨噬細胞是機體內重要的免疫細胞，大量研究已經證實布魯氏菌能夠調控巨噬細胞凋亡[3-4]。胞內寄生菌抑制細胞凋亡是保證其生存、繁殖的重要策略[18]，而胞內寄生菌誘導的細胞凋亡往往有利于機體將其清除[19]。通往細胞凋亡的途徑通常有3條：死亡受體途徑、線粒體凋亡途徑和內質網應激途徑[20]。研究表明，布魯氏菌能夠通過誘導巨噬細胞凋亡線粒體途徑相關因子(如BAX、Bcl-2等)的表達來誘發凋亡[21]。BAX作為促細胞凋亡基因，其表達水平的變化可在一定程度上反應細胞凋亡情況[22]。研究發現，降低MFN2基因表達可增強膠質瘤細胞增殖能力[23]。Stavru[24]等研究表明，MFN2基因敲除會降低單增李斯特菌的胞內存活率。 本研究中Western blotting和實時熒光定量PCR檢測的MFN2干擾及過表達后布魯氏菌誘導的BAX mRNA和蛋白表達水平與流式細胞術檢測的細胞凋亡結果相符，表明干擾MFN2基因可提高布魯氏菌誘導細胞凋亡的能力，而過表達MFN2則抑制布魯氏菌誘導細胞凋亡的能力，此結果與Lee等[11]在結核分枝桿菌感染巨噬細胞的研究結果相似，可能是因為干擾MFN2破壞了線粒體正常的結構與形態，加劇了線粒體碎片化程度，損害了線粒體的功能而使細胞發生凋亡，也有可能是因為干擾MFN2阻礙了內質網與線粒體間鈣離子的正常傳遞，使線粒體鈣離子超載而凋亡，具體的機制還有待研究。

4 結 論

本研究結果表明，干擾MFN2基因促進布魯氏菌誘導的巨噬細胞凋亡，而過表達MFN2基因則抑制布魯氏菌誘導的細胞凋亡。本研究結果為進一步了解MFN2基因的功能及闡明布魯氏菌的致病機制提供參考，為MFN2基因作為今后開發預防及治療布魯氏菌病方案的潛在靶點提供依據。