豬塞尼卡谷病毒單克隆抗體的制備及鑒定

莫紅芳，揭 凱，陳 鑫，文 威，劉文強(qiáng)，陳煥春，錢 平，李祥敏

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué),農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，南寧 530007)

豬塞尼卡谷病毒(SenecaValleyvirus，SVV)是小RNA病毒科(Picornaviridae)塞尼卡病毒屬(Senecavirus)的唯一成員[1]，基因組序列大小約為7.2 kb，包含1個(gè)開放閱讀框(ORF)，編碼含2 181個(gè)氨基酸的多聚蛋白[2-3]，編碼1個(gè)先導(dǎo)蛋白質(zhì)L和3個(gè)前體蛋白(P1、P2和P3)[4]。P1前體蛋白編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP1和VP3，VP0成熟后裂解成VP2和VP4，構(gòu)成病毒衣殼；P2和P3前體蛋白編碼7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(2A～2C和3A～3D)，與病毒毒力密切相關(guān)，共同參與病毒復(fù)制[4]。SVV衣殼與宿主細(xì)胞膜受體相結(jié)合，已作為其參與天然免疫的依據(jù)[5]。 目前，關(guān)于SVV疫苗和免疫診斷研究的報(bào)道相對(duì)較少，但由于SVV與口蹄疫病毒(FMDV)屬于同科病毒，基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比相似，因此，SVV疫苗類型和免疫診斷產(chǎn)品與FMDV相似[6]。

自2007年有國家發(fā)現(xiàn)豬群感染SVV后，美國、巴西、加拿大等國家也陸續(xù)報(bào)道了該病[7]。2015年以來，中國廣東、湖北、廣西、安徽、河南、遼寧等地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)了豬感染SVV的報(bào)道[8]。至此，SVV在中國豬群中明確存在且有蔓延趨勢[6]，應(yīng)引起國內(nèi)養(yǎng)豬行業(yè)的高度關(guān)注[9]。由于豬塞尼卡谷病毒病具有與口蹄疫(FMD)、豬水皰性疹(VES)、豬水皰病(SVD)和水皰性口炎(VS)等嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的疫病相似的臨床癥狀[4]，因此需借助實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行確診。當(dāng)前，用于SVV診斷的實(shí)驗(yàn)室方法主要為病毒分離、免疫熒光抗體檢測、病毒中和試驗(yàn)(VNT)、免疫組化(IHC)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、反轉(zhuǎn)錄PCR、新型RNA原位雜交技術(shù)等,其中ELISA方法用于常規(guī)篩查，其余方法用于進(jìn)一步確診[9]。

作為豬的新發(fā)傳染病，目前尚無有效的SVV商品化疫苗和診斷試劑，使得豬塞尼卡谷病毒病的防控面臨巨大的挑戰(zhàn)[10]。近年來，SVV單克隆抗體被廣泛應(yīng)用于免疫組化及競爭ELISA檢測[11]。SVV結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4較保守，其中VP1和VP2是主要的抗原表位區(qū)域[12]，VP1包含多個(gè)中和結(jié)構(gòu)域、相對(duì)保守，是衣殼蛋白中免疫原性最強(qiáng)的，已被用于確定多種小RNA病毒的血清型，能與宿主細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[13-15]，為SVV診斷提供了重要保障[16]。本研究擬在SVV-CH-HB2016病毒顆粒基礎(chǔ)上制備其結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體，以期為血清學(xué)檢測方法的建立提供生物學(xué)材料，也為SVV抗體診斷試劑盒、疫苗的研發(fā)及結(jié)構(gòu)蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、質(zhì)粒、細(xì)胞及試驗(yàn)動(dòng)物 SVV-CH-HB2016、SVV CH/GXI09/2016、SVV AH01-2017毒株、真核質(zhì)粒pTRIP-3Flag-SVV-CH-HB2016-VP1/VP2/VP3、倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)、人源腎上皮細(xì)胞(293T)均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。6周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 SVV-CH-HB2016 VP1兔源多克隆抗體由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；FITC羊抗小鼠IgG購自ABclonal公司；羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)二抗、羊抗小鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗均購自武漢安特捷生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司；Sucrose、50% PEG4000、HAT/HT培養(yǎng)基干粉、Hisopaque-1083淋巴細(xì)胞分離液、弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；ELISA顯色液及終止液均購自武漢科前生物股份有限公司；SuperSignal Chemiluminescent Substrates顯色液、Pierce?Rapid ELISA Mouse mAb Isotying Kit均購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 SVV純化與鑒定 參照彭成成等[17]方法制備、濃縮與純化病毒，參照楊文靜等[18]Western blotting方法鑒定病毒特異性。將SVV-CH-HB2016毒株接種BHK-21細(xì)胞進(jìn)行增殖，室溫反復(fù)凍融3次后，于4 ℃、10 000 r/min離心30 min以除去細(xì)胞碎片，超高速離心和蔗糖密度梯度離心方法濃縮、純化SVV全病毒顆粒，脫糖處理后通過12% SDS-PAGE檢測純化后目的蛋白純度。依次以SVV-CH-HB2016 VP1兔源多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)二抗孵育后，Western blotting方法鑒定病毒顆粒特異性，再利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù)，最終以純度好、拷貝數(shù)高的病毒顆粒免疫BALB/c小鼠。

1.2.2 動(dòng)物免疫 參照周曼莉等[19]方法進(jìn)行小鼠免疫。將30 μg純化的SVV-CH-HB2016病毒顆粒與等體積弗氏完全佐劑乳化，用頸背部皮下兩點(diǎn)注射法對(duì)6周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠進(jìn)行首次免疫。分別于2和4周后更換為弗氏不完全佐劑以同樣劑量和方法進(jìn)行第2、3次免疫。三免10 d后進(jìn)行斷尾采血，檢測血清抗體效價(jià)及其特異性，以判斷是否需進(jìn)行第4次免疫。細(xì)胞融合前3～5 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，即腹腔注射與前幾次免疫等劑量的病毒顆粒。

1.2.3 間接ELISA檢測方法的建立 參照趙月龍等[20]方法，通過方陣滴定法確定抗原的最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.4 免疫小鼠血清效價(jià)檢測 采用間接ELISA方法檢測免疫血清效價(jià)。按抗原最佳包被濃度包被純化的SVV-CH-HB2016病毒顆粒，4 ℃孵育過夜。將分離得到的待檢陽性及空白小鼠陰性血清從1∶200倍開始稀釋，依次2倍倍比稀釋至1∶25 600作為一抗，用1.2.3建立的間接ELISA方法檢測免疫小鼠的血清效價(jià)。當(dāng)待檢血清與陰性血清的D630 nm比值(P/N)≥2.1，且待檢血清的D630 nm值≥0.4時(shí)的最大稀釋倍數(shù)為該免疫小鼠的血清效價(jià)。

1.2.5 細(xì)胞融合及亞克隆 參照項(xiàng)自來等[21]方法進(jìn)行細(xì)胞融合及篩選。取800 μL 50% PEG4000誘導(dǎo)免疫脾細(xì)胞(1×108)與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(1×107～2×107)進(jìn)行物理性融合。融合后用含2% HAT、20% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，并與飼養(yǎng)細(xì)胞混合培養(yǎng)，第5天更換為2% HT培養(yǎng)基，培養(yǎng)至11 d采用間接ELISA結(jié)合間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。將陽性雜交瘤細(xì)胞利用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆，直至細(xì)胞培養(yǎng)上清陽性率100%，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.2.6 單克隆抗體Western blotting檢測 參照林偉東等[22]方法,利用Western blotting檢測單克隆抗體與SVV結(jié)構(gòu)蛋白的反應(yīng)性。以真核質(zhì)粒pTRIP-3Flag-SVV-CH-HB2016-VP1/VP2/VP3表達(dá)的3種重組結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原，置于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，陽性雜交瘤細(xì)胞上清為一抗室溫孵育1 h，再用羊抗小鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，加入SuperSignal Chemiluminescent Substrates顯色液(1∶1)在Bio-Rad照膜儀上進(jìn)行避光顯色讀取反應(yīng)結(jié)果。

1.2.7 抗體亞型鑒定 采用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit進(jìn)行單克隆抗體的亞型鑒定，具體操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.8 雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù) 將建立細(xì)胞株后的陽性雜交瘤細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞板，細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)在培養(yǎng)基中添加終濃度為0.6 μg/mL的秋水仙素，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)3 h。輕輕吹下雜交瘤細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞沉淀，加入37 ℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCl低滲溶液1 mL，重懸細(xì)胞沉淀，于37 ℃恒溫箱靜置30 min。 加入新配制的固定液(甲醇∶冰醋酸=1∶3)處理細(xì)胞，吸取50 μL細(xì)胞懸液滴至4 ℃預(yù)冷的載玻片上，使液面均勻展開，并于室溫下自然干燥，取10% Giemsa染色液染色10～15 min，ddH2O沖洗染色液后自然晾干。光學(xué)顯微鏡下初步觀察確定染色體位置，轉(zhuǎn)換油鏡頭再觀察染色體的形態(tài)和數(shù)目。

1.2.9 單克隆抗體的IFA鑒定 待BHK-21細(xì)胞長至匯合度為80%～90%時(shí)，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為0.1的劑量接種SVV-CH-HB2016病毒液，設(shè)置不接種病毒的細(xì)胞對(duì)照組，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。加入固定液(甲醇∶丙酮=1∶1)100 μL/孔，于-20 ℃固定30 min；每孔加入含2% BSA的PBS緩沖液100 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱封閉1 h；加入陽性雜交瘤細(xì)胞上清作一抗，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱與抗原結(jié)合1 h；避光加入Cy3 Goat Anti-Mouse IgG二抗(1∶2 000稀釋) 100 μL/孔，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)1 h，在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.10 單克隆抗體的病毒中和試驗(yàn) 為觀察制備的單克隆抗體對(duì)SVV的中和效應(yīng)，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清50 μL依次作2倍倍比稀釋至1∶28，分別接入SVV-CH-HB2016、SVV CH/GXI09/2016和SVV AH01-2017毒株，接種劑量為200 TCID50/100 μL，孵育1 h后感染BHK-21細(xì)胞。每株雜交瘤細(xì)胞作4排重復(fù)孔，設(shè)立病毒和細(xì)胞對(duì)照孔，24 h后觀察細(xì)胞病變情況并記錄結(jié)果。

1.2.11 病毒吸附試驗(yàn) 為探究中和單克隆抗體是否通過影響SVV-CH-HB2016毒株吸附過程來抑制病毒增殖，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和空斑試驗(yàn)檢測其在293T細(xì)胞的吸附情況。首先測定具有中和作用的單克隆抗體培養(yǎng)基上清的IgG濃度，取IgG含量為2 mg的上清與2×106TCID50的SVV-CH-HB2016毒株于37 ℃感作1 h，加入4×106個(gè)293T細(xì)胞于4 ℃轉(zhuǎn)盤上反應(yīng)1 h，4 ℃低速離心棄掉上清，用預(yù)冷的PBS洗滌4次，分別加入100 μL無血清DMEM反復(fù)凍融，收集病毒進(jìn)行空斑檢測，加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，設(shè)立IgG對(duì)照組。

1.2.12 抗體相加試驗(yàn) 參照裴超[23]方法進(jìn)行抗體相加試驗(yàn)。采用間接ELISA法進(jìn)行相加試驗(yàn)，計(jì)算相加指數(shù)(AI)來分析抗原表位。分別用純化的VP1、VP2和VP3蛋白包被酶標(biāo)板，然后每孔加入各種單克隆抗體培養(yǎng)上清各100 μL，以及兩兩組合各50 μL，37 ℃孵育1 h，以羊抗小鼠IgG-HRP作為二抗進(jìn)行ELISA檢測，用酶標(biāo)儀讀取D630 nm值，記錄并根據(jù)下列公式計(jì)算AI。

AI=(A1+2-A1)/A2

式中，A1、A2分別為各株單克隆抗體單獨(dú)反應(yīng)后的A值；A1+2為兩兩組合的混合單克隆抗體反應(yīng)后的A值；AI>10%表示兩株單克隆抗體細(xì)胞株針對(duì)不同的抗原表位，具有相加效應(yīng)；AI<10%則表示兩株單克隆抗體細(xì)胞株針對(duì)的抗原表位相同或相近。

1.2.13 小鼠腹水制備與純化 采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法來進(jìn)行單克隆抗體的大量制備。選取8～10周齡的雌性BALB/c小鼠20只，通過腹腔注射0.5 mL弗氏不完全佐劑的方式進(jìn)行刺激，5～7 d后收集擴(kuò)大培養(yǎng)的陽性雜交瘤細(xì)胞(105～106個(gè))注射到小鼠腹腔內(nèi)，7～10 d后待小鼠腹腔變得極度腫脹，用注射器無菌抽取腹水，經(jīng)1 000 r/min離心10 min分離的上清即為單克隆抗體腹水，再利用辛酸-硫酸銨沉淀方法純化腹水及SDS-PAGE方法檢測純化效果。 將純化好的單克隆抗體置于10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0)緩沖液中透析72 h，透析結(jié)束后與甘油按1∶1比例混合，于-20 ℃保存。

1.2.14 小鼠腹水效價(jià)的測定 采用間接ELISA方法檢測抗體效價(jià)。用濃度為1 μg/mL的SVV-CH-HB2016病毒顆粒包被酶標(biāo)板，將小鼠腹水從1∶200倍開始2倍倍比稀釋至1∶25 600作為一抗，設(shè)立SP2/0培養(yǎng)上清對(duì)照組。以羊抗小鼠IgG-HRP作為二抗，以630 nm處吸光度的P/N值>2時(shí)的腹水最大稀釋倍數(shù)為其抗體效價(jià)。

1.2.15 統(tǒng)計(jì)分析 病毒吸附試驗(yàn)各組樣本的差異均采用雙樣本等方差t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，使用生物軟件GraphPad Prism進(jìn)行顯著性分析，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SVV純化與鑒定

將SVV-CH-HB2016毒株接種BHK-21細(xì)胞，利用蔗糖密度梯度超速離心法進(jìn)行病毒的濃縮與純化，結(jié)果顯示在蔗糖梯度20%～35%(W/V)、35%～45%(W/V)和45%～60%(W/V)之間均有一條明顯的病毒帶(圖1)。SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，蔗糖梯度35%～45%之間有3條明顯的條帶，大小分別為39、37和34 ku，與SVV-CH-HB2016毒株的結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP1和VP3大小一致(圖2)。以SVV-CH-HB2016 VP1兔源多克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blotting鑒定，結(jié)果顯示有一條大小為37 ku的特異性條帶(圖3)，與VP1蛋白大小一致。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，蔗糖梯度35%～45%之間病毒含量為1.7×1012拷貝/mL，測定蛋白濃度達(dá)400 μg/mL，以此作為抗原免疫BALB/c小鼠。

圖1 SVV-CH-HB2016蔗糖密度梯度離心Fig.1 Sucrose density gradient centrifugation of SVV-CH-HB2016

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，濃縮前；2，濃縮上層；3，濃縮下層；4，超高速離心最上層；5～7，蔗糖密度梯度分別為20%～35%、35%～45%和45%～60%M,Protein Marker；1,Before concentration；2,Concentrated upper layer；3,Concentrated lower layer；4,Super-detached top layer；5-7,Sucrose density gradient were 20%-35%,35%-45% and 45%-60%,respectively圖2 SVV-CH-HB2016蔗糖密度梯度離心SDS-PAGE檢測Fig.2 SDS-PAGE detection of sucrose density gradient centrifuged of SVV-CH-HB2016

1，BHK-21細(xì)胞；2，濃縮前；3，濃縮上層；4，濃縮下層；5，超高速離心最上層；6～8，蔗糖密度梯度分別為20%～35%、35%～45%和45%～60%；M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1,BHK-21 cells；2,Before concentration；3,Concentrated upper layer；4,Concentrated lower layer；5,Super-detached uppermost layer；6-8,Sucrose density gradient were 20%-35%,35%-45% and 45%-60%,respectively；M,Protein Marker圖3 SVV-CH-HB2016蔗糖密度梯度離心Western blotting鑒定Fig.3 Western blotting detection of sucrose density gradient centrifuged of SVV-CH-HB2016

2.2 免疫小鼠血清效價(jià)檢測

3次免疫完成后，對(duì)小鼠進(jìn)行斷尾采血，通過間接ELISA方法檢測血清抗體效價(jià)水平。結(jié)果顯示，SVV-CH-HB2016病毒顆粒免疫的3只小鼠血清抗體效價(jià)均達(dá)到了1∶12 800，其中2號(hào)小鼠免疫效果最佳(圖4)，故首先選擇其進(jìn)行細(xì)胞融合試驗(yàn)。

A，1號(hào)小鼠血清；B，2號(hào)小鼠血清；C，3號(hào)小鼠血清；D，陰性血清A,Serum of No.1 mouse；B,Serum of No.2 mouse；C,Serum of No.3 mouse；D,Negative serum圖4 間接ELISA檢測免疫小鼠血清效價(jià)Fig.4 Detection of serum titer of immunized mice by indirect ELISA

2.3 陽性雜交瘤細(xì)胞篩選結(jié)果

用純化的SVV-CH-HB2016病毒顆粒作為包被原，通過方陣滴定法確定抗原最佳包被濃度為1 μg/mL，以此濃度包被酶標(biāo)板，利用間接ELISA結(jié)合IFA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆直至陽性率達(dá)到100%，最終篩選出17株能穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1A3、1A5、1C2、1E7、1F5、1C12、2A5、2B9、2E1、2G6、3D1、3E2、3F2、4A3、4B8、4C11和4F11。

2.4 單克隆抗體的Western blotting分析

Western blotting檢測結(jié)果顯示，14株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體分別能與SVV 3種重組結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生特異性作用，其中1C2、1E7、1F5、2E1、2G6和4C11株單克隆抗體能與VP1蛋白特異性結(jié)合，1A3、1C12、3E2、3F2、4B8和4F11株單克隆抗體能與VP2蛋白特異性作用，1A5和2A5株單克隆抗體能與VP3蛋白特異性反應(yīng)。Western blotting部分結(jié)果見圖5。

①A～I(xiàn)，分別以1A5、1C12、1E7、1F5、2A5、2G6、3E2、4C11和4F11株單克隆抗體為一抗。②M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3，分別為重組蛋白VP1、VP2和VP3①A-I,Monoclonal antibody of 1A5,1C12,1E7,1F5,2A5,2G6,3E2,4C11,4F11 strain as first antibody,respectively.②M,Protein Marker；1-3,Recombinant protein VP1,VP2 and VP3,respectively圖5 單克隆抗體Western blotting分析Fig.5 Western blotting analysis of monoclonal antibodies

2.5 單克隆抗體亞型鑒定

SVV-CH-HB2016單克隆抗體細(xì)胞株亞型鑒定結(jié)果顯示,1A3、1C2、1E7、1C12、2A5、2E1、2G6、3D1、4A3、4B8、4C11和4F11株單克隆抗體亞型均為IgG/Kappa，1A5、1F5、2B9、3E2和3F2株單克隆抗體亞型均為IgM/Kappa。

2.6 雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)

染色體計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，17株雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目均在90～110對(duì)之間，表明這17株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目約為脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞染色體數(shù)目之和，是融合成功的細(xì)胞株。

2.7 單克隆抗體的IFA鑒定

IFA結(jié)果顯示，17株單克隆抗體均能與SVV不同毒株發(fā)生反應(yīng)，具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，而陰性對(duì)照則無任何熒光信號(hào)，表明該17株雜交瘤細(xì)胞均是特異性針對(duì)SVV的單克隆抗體。IFA部分結(jié)果見圖6。

A～K，分別以1C2、1E7、1F5、1C12、2A5、2G6、3D1、4A3、4B8、4C11和4F11株單克隆抗體為一抗；L，BHK-21細(xì)胞對(duì)照A-K，Monoclonal antibody of 1C2,1E7,1F5,1C12,2A5,2G6,3D1,4A3,4B8,4C11,4F11 strain as first antibody respectively；L，BHK-21 cell control圖6 單克隆抗體IFA鑒定(20×)Fig.6 IFA identification of monoclonal antibodies (20×)

2.8 單克隆抗體的病毒中和試驗(yàn)結(jié)果

中和試驗(yàn)48 h后，觀察病毒對(duì)照組BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)明顯變圓、皺縮及脫落等病變，試驗(yàn)組中SVV CH/GXI09/2016、SVV AH01-2017毒株感染的單克隆抗體處理組的細(xì)胞均呈現(xiàn)典型細(xì)胞病變現(xiàn)象，而僅有SVV-CH-HB2016感染的單克隆抗體處理組細(xì)胞無病變或僅少數(shù)孔出現(xiàn)病變。結(jié)果表明，2G6、4C11、4A3 3株單克隆抗體對(duì)SVV-CH-HB2016毒株感染的細(xì)胞具有明顯中和保護(hù)效果，而對(duì)SVV CH/GXI09/2016和SVV AH01-2017毒株無保護(hù)效果(表1)。

表1 單克隆抗體對(duì)不同SVV毒株的中和效價(jià)測定

2.9 病毒吸附試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，2G6、4C11、4A3 3株具有中和作用的單克隆抗體可極顯著抑制SVV-CH-HB2016毒株吸附293T細(xì)胞的過程(P<0.01)，其中2G6單克隆抗體株的抑制吸附效果最好(圖7)。

①A，IgG對(duì)照；B～D，分別為2G6、4C11和4A3株單克隆抗體。 ②與對(duì)照組相比，**,差異極顯著(P<0.01)。 圖8同A,IgG as control；B-D,Monoclonal antibody of 2G6,4C11 and 4A3 strains,respectively.②Compared with control group,**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.8圖7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SVV-CH-HB2016毒株的吸附效果Fig.7 Adsorption effect of SVV-CH-HB2016 strain detected by Real-time PCR

空斑試驗(yàn)結(jié)果顯示，2G6、4C11和4A3 3株中和性單克隆抗體可極顯著抑制SVV-CH-HB2016毒株對(duì)293T細(xì)胞的吸附(P<0.01),其中2G6單克隆抗體株的抑制吸附效果最好(圖8)。

圖8 空斑試驗(yàn)檢測SVV-CH-HB2016毒株的吸附效果Fig.8 Adsorption effect of SVV-CH-HB2016 strain detected by plaque assay

采用以上2種研究方法檢測2G6、4C11和4A3 3株中和性單克隆抗體對(duì)SVV-CH-HB2016毒株吸附293T細(xì)胞過程的抑制效果，均表明3株中和性單克隆抗體可極顯著抑制SVV-CH-HB2016毒株對(duì)細(xì)胞的吸附，其中2G6單克隆抗體株的抑制吸附效果最好。

2.10 抗體相加試驗(yàn)結(jié)果

抗體相加試驗(yàn)結(jié)果表明，除1F5與2E1、4B8與4F11的AI值<10%外，其余10株單克隆抗體的AI值均>10%，說明1A3、1A5、1C2、1E7、1C12、2A5、2B9、2G6、3D1、3E2、3F2、4A3和4C11 10株單克隆抗體分別針對(duì)不同的抗原表位(表2～4)。

表2 抗VP1蛋白單克隆抗體的抗體相加指數(shù)

表3 抗VP2蛋白單克隆抗體的抗體相加指數(shù)

表4 抗VP3蛋白單克隆抗體的抗體相加指數(shù)

2.11 單克隆抗體腹水制備與純化

利用SDS-PAGE方法檢測純化的單克隆抗體腹水，可見兩條大小分別為55和25 ku的明顯條帶，無任何雜帶，說明純化的單克隆抗體回收率較高、純度較好。

2.12 小鼠腹水效價(jià)測定

用間接ELISA方法檢測小鼠腹水效價(jià)，結(jié)果顯示，17株雜交瘤細(xì)胞制備的小鼠腹水抗體效價(jià)均達(dá)到了較高水平，其中2E1、3D1和4C11株腹水效價(jià)達(dá)到了1∶6 553 600。

3 討 論

SVV是一種新出現(xiàn)的動(dòng)物病原，近年來發(fā)現(xiàn)其感染與豬的特發(fā)性水皰病(porcine idiopathic vesicular disease,PIVD)和流行性暫時(shí)性新生仔豬死亡(epidemic transient neonatal losses,ETNL)相關(guān)[12]。SVV主要感染豬，不同性別、年齡階段的豬均易感，但在不同的病例中表現(xiàn)的臨床癥狀有所差異[24]。感染的繁殖母豬和公豬鼻吻、冠狀帶及蹄部可觀察到病變，成年豬通常呈亞臨床感染，1～4日齡新生仔豬病死率可達(dá)30%～70%[25]。作為一種新發(fā)的家畜傳染病，豬塞內(nèi)卡病毒病的暴發(fā)與流行已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[26]。隨著SVV在中國的傳播，亞臨床感染在國內(nèi)養(yǎng)豬場也頻繁發(fā)生[27]。大量亞臨床感染和商用疫苗的缺乏增加了中國對(duì)該病防控和凈化的難度[28]。

SVV感染的診斷主要依靠病原學(xué)和血清學(xué)方法[20]，目前國內(nèi)外尚無檢測該病的商品化試劑盒,常用病毒分離鑒定、RT-PCR方法進(jìn)行檢測[29]，ELISA方法具有操作簡便、敏感性高、適于大規(guī)模樣品檢測的優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室常用的檢測方法[20]。鑒于該病在中國目前的流行態(tài)勢，迫切需要開發(fā)出SVV的快速診斷方法，單克隆抗體以其良好的特異性、準(zhǔn)確性和敏感性在疾病診斷方面具有良好的效果[30]。SVV VP1結(jié)構(gòu)蛋白有重要的抗原性，病毒衣殼底部和前部之間最明顯的差異位于VP1結(jié)構(gòu)蛋白[4]，開發(fā)出基于VP1結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體，在SVV診斷方面具有重要意義[30]。

單克隆抗體在生物學(xué)領(lǐng)域較多，開發(fā)出相應(yīng)的單克隆抗體意義重大[30]，目前國內(nèi)極少有SVV單克隆抗體的相關(guān)報(bào)道，更無中和性單克隆抗體的研究成果。趙月龍[20，30]利用pET-32a(+)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)A型塞尼卡谷病毒(SVA) VP1(rVP1)，純化上清中rVP1蛋白作為包被抗原，初步建立了SVA間接ELISA抗體檢測方法，同時(shí)利用其作為免疫原制備了抗rVP1蛋白的單克隆抗體。陳露露[31]將截短的VP3片段序列插入pCold Ⅱ原核表達(dá)載體，制備能穩(wěn)定分泌針對(duì)SVA VP3蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，并進(jìn)行了其抗原表位的精確鑒定。本研究制備的17株單克隆抗體穩(wěn)定性好、純度高、特異性強(qiáng)，經(jīng)過IFA驗(yàn)證能在病變的細(xì)胞中定位病毒粒子，Western blotting檢測該單克隆抗體與SVV結(jié)構(gòu)蛋白具有良好的反應(yīng)性，其中14株單克隆抗體可同時(shí)識(shí)別構(gòu)象表位與線性表位，3株單克隆抗體只能識(shí)別構(gòu)象表位。值得一提的是，本研究在國內(nèi)首次成功篩選出3株具有中和作用的SVV單克隆抗體，經(jīng)Western blotting鑒定2G6、4C11株單克隆抗體均只與結(jié)構(gòu)蛋白VP1發(fā)生特異性結(jié)合，以此驗(yàn)證了VP1基因上確實(shí)存在中和結(jié)構(gòu)域。這為下一步重組亞單位疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，也為基于單克隆抗體的雙抗夾心ELISA方法的建立、膠體金試紙條的開發(fā)提供了條件。

本研究第一次細(xì)胞融合發(fā)現(xiàn)原本陽性的細(xì)胞孔經(jīng)亞克隆后轉(zhuǎn)陰，可能是由于雜交瘤細(xì)胞狀態(tài)不佳，分裂過程中導(dǎo)致染色體丟失，進(jìn)而引起抗體分泌停止，此外非分泌抗體細(xì)胞和抗體細(xì)胞之間的競爭也可能會(huì)致使陽性亞克隆丟失[30]。篩選出的5株單克隆抗體為IgM，這可能與抗原對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，抗原量增加引起免疫耐受，進(jìn)而易誘導(dǎo)產(chǎn)生IgM抗體[30]。本研究測定了17株單克隆抗體與SVV 3種不同毒株的中和效價(jià)，篩選得到的3株中和性單克隆抗體除了對(duì)免疫小鼠用的SVV-CH-HB2016毒株有較好的中和效果外，對(duì)其余2種毒株的中和效價(jià)均為1∶1，說明中和性單克隆抗體與SVV其他2種毒株的反應(yīng)性非常弱，不具有中和保護(hù)作用，造成中和性單克隆抗體在以后應(yīng)用性研究方面有較大局限性。病毒中和試驗(yàn)中，由于病毒吸附細(xì)胞發(fā)生于進(jìn)入細(xì)胞之前，病毒進(jìn)入效率可能受吸附效率影響。 因此，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果初步得出以下結(jié)論：中和單克隆抗體可有效抑制SVV-CH-HB2016毒株對(duì)293T細(xì)胞的吸附過程，而其對(duì)病毒進(jìn)入的影響則不清楚。陳露露[31]報(bào)道了中和抗體在防止小RNA病毒感染中起關(guān)鍵作用，目前中國SVA毒株在抗原性上與其他毒株密切相關(guān),并具有共同的中和表位。盡管存在共同的表位，但衣殼蛋白(VP1、VP2和VP3)中的氨基酸變化導(dǎo)致不同SVA毒株的抗原性存在差異，所以有必要在流行病學(xué)調(diào)查中監(jiān)測抗原性的變化[31]。

4 結(jié) 論

本研究成功純化了SVV-CH-HB2016毒株的病毒顆粒，免疫小鼠后制備了17株特異性針對(duì)SVV-CH-HB2016毒株結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株，驗(yàn)證了17株單克隆抗體均能與SVV-CH-HB2016毒株發(fā)生IFA作用及其中14株單克隆抗體能與SVV-CH-HB2016毒株重組結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生Western blotting反應(yīng)，并成功篩選出了3株對(duì)SVV-CH-HB2016毒株感染具有中和保護(hù)效果的單克隆抗體，為SVV ELISA方法的建立、膠體金試紙條的開發(fā)及病毒感染機(jī)制的研究提供了物質(zhì)材料與理論依據(jù)。