綠色熒光蛋白的真核表達及其單克隆抗體制備

胡換儀，汪建中，劉昌錦，林 敏，劉小蘭，魏黃思梧，鄧舜洲

(江西農業大學動物科學技術學院，南昌 330045)

1962年，Shimonura等[1]在維多利亞水母中發現了一種能釋放出生物熒光的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。GFP的分子質量約27 ku，是一條由238個氨基酸組成的多肽鏈，經紫光或藍光照射會發出綠色熒光。GFP的熒光來源于生色團，由3個氨基酸殘基Ser65-Tyr66-Gly67形成的對羥基苯咪唑啉酮構成。GFP的獨特之處在于有氧條件下無需任何輔助因子或特定的酶即可產生熒光[2]。但野生型GFP在藍光激發下熒光強度偏低，在幾種哺乳動物細胞中表達不穩定，針對此情況，Zhang等[3]對GFP的氨基酸進行了替換(Ser65→Thr，Phe64→Leu)，即為增強型GFP(enhanced GFP，EGFP)，其熒光強度提高了35倍。GFP具有性質穩定、無毒、靈敏度高、載體構建簡單等優點，因此，近二十多年已在各個領域被廣泛應用，主要用于顯像和示蹤技術、報告基因、活細胞內的熒光感受器、篩選和純化及抗體生產等方面[4]。

在利用GFP對內源蛋白進行定量時，活體細胞本身存在的自熒光物質會影響試驗結果，導致無法準確定量；此外，組織或細胞在各種理化處理過程中熒光易淬滅，不利于對組織中GFP標記蛋白進行細胞內定位及所在組織的結構和功能的原位分析[5]。因此，如果有針對GFP的高特異性、高靈敏度抗體，可在一定程度上彌補上述不足，作為一種有效的補充手段提高GFP檢測的靈敏度和準確度，擴大熒光檢測范圍。

本研究以豬痘病毒(Swinepox virus，SWPV)TK基因為外源基因插入位點，采用同源重組技術構建重組SWPV表達GFP,在此基礎上，制備抗GFP的單克隆抗體，以期為今后建立GFP的免疫學檢測方法提供特異性抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、毒株和細胞 含有SWPVTK基因左右臂的基礎質粒載體pSW[6]、SWPV-JX20G株、PK15細胞、SP2/0骨髓瘤細胞、原核表達的EGFP-His蛋白和抗PCV2單克隆抗體6E2均由江西農業大學預防獸醫室構建或保存;EGFP-N1質粒(含P28-EGFP-His片段)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要試劑NotⅠ和XhoⅠ均購自Thermo公司；T4 DNA連接酶、PCR反應相關試劑均購自TaKaRa公司；新生牛血清、高糖DMEM培養基、OPTI-MEM均購自Gibco公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；Western blotting相關試劑均購自Solarbio公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購自北京全式金生物技術有限公司；His標簽蛋白純化試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；PEG2000、HAT、HT、低熔點瓊脂糖和弗氏佐劑均購自Sigma公司。

1.1.3 試驗動物 6～8 周齡雌性BALB/c小鼠和成年昆明小鼠均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.1.4 P28啟動子序列 根據Winslow等[7]對痘苗病毒啟動子P28的相關報道，本試驗采用的P28啟動子大小為33 bp，序列為：5′-CTTTTT-TTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATG-3′。

1.2 方法

1.2.1 EGFP-His蛋白的表達及純化

1.2.1.1 目的基因擴增 以EGFP-N1質粒為模板，PCR擴增P28-EGFP-His片段，上游引物EGFP-F：5′-AAATATGCGGCCGCCCCGGGCTT-TTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATG-GTGAGCAAGGGCGA-3′，5′-端加上NotⅠ酶切位點(下劃線處)；下游引物EGFP-R：5′-CCTCGAG-TTAATGATGGTGGTGATGATGCTTGTACAGCT-CGTCCATGCCGAGAGTGATCC-3′，5′-端加上XhoⅠ酶切位點(下劃線處)，預期擴增片段大小為768 bp，含有P28啟動子、EGFP基因和6×His標簽。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR反應體系50 μL：HiFi Buffer Ⅰ 5 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物各0.5 μL，HiFi酶0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.1.2 重組SWPV轉移載體的構建及鑒定 P28-EGFP-His片段和pSW質粒分別經NotⅠ和XhoⅠ雙酶切、純化，T4 DNA連接酶連接后轉化大腸桿菌Trans5α感受態細胞，挑取單個菌落進行PCR鑒定、雙酶切鑒定，篩選陽性克隆進行測序。按高純度質粒小提中量試劑盒說明書操作，大量制備用于轉染的重組質粒pSW-EGFP-His，測量質粒濃度，計算轉染體積，-20 ℃保存備用。

1.2.1.3 重組質粒轉染及重組SWPV(rSWPV-EGFP-His)純化 培養PK15細胞匯合度至80%，感染SWPV-JX20G株，吸附2 h后，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行轉染。轉染細胞培養48 h時，觀察有無熒光及細胞病變，維持5～6 d收毒。參考劉昌錦等[8]方法進行重組病毒蝕斑純化。

1.2.1.4 rSWPV-EGFP-His的PCR鑒定 根據SWPV-JX20G株的TK基因序列，設計1對檢測引物，上游引物TK1：5′-GGACCTATGTTCTCTG-GAAAGAGT-3′；下游引物TK2：5′-TGTTCCA-TCTAATGCAGCAACG-3′，親本SWPV預期擴增片段大小為309 bp，rSWPV-EGFP-His預期擴增片段大小為1 077 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。反應體系及反應條件同1.2.1.1。

1.2.1.5 EGFP-His蛋白表達和純化 將表達EGFP-His蛋白的rSWPV-EGFP-His接種PK15細胞進行擴大培養，病毒吸附4～5 h后加入適量含5%血清的DMEM培養液，48～72 h觀察細胞熒光，細胞達100%熒光時用無血清DMEM培養液洗滌細胞3 次，加入適量無血清DMEM培養液繼續培養至細胞全部病變后收毒。 病毒液凍融3 次后取1 mL 12 000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE觀察EGFP-His蛋白表達形式。按照His標簽可溶性蛋白純化試劑盒說明書純化EGFP-His蛋白，SDS-PAGE觀察純化效果。

1.2.2 抗EGFP-His單克隆抗體的制備

1.2.2.1 小鼠免疫 將純化的EGFP-His蛋白與弗氏完全佐劑乳化，蛋白含量為100 μg/0.2 mL,免疫5 只6～8 周齡雌性BALB/c小鼠，皮下多點注射，0.2 mL/只，每隔10 d加強免疫一次(第2次免疫開始用弗氏不完全佐劑)，共免疫5 次，每次免疫前及第5次免疫后10 d斷尾采血取血清。融合前加強免疫，尾靜脈注射EGFP-His蛋白(50 μg/只)，3 d后取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。

1.2.2.2 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 按照方陣滴定法，將純化后的EGFP-His蛋白用0.05 mol/L pH 9.6 碳酸鹽緩沖液連續稀釋(濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10和20 μg/mL)，100 μL/孔，4 ℃包被酶標板過夜；5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h；將陽性小鼠血清(免疫小鼠血清)和陰性小鼠血清稀釋(1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000和1∶512 000)，100 μL/孔，同時設空白對照，37 ℃濕盒孵育1 h；PBST洗板3 次，加HRP標記山羊抗鼠IgG(1∶2 000稀釋)，100 μL/孔，37 ℃濕盒孵育1 h；PBST洗板4～5次，加OPD底物溶液，100 μL/孔37 ℃濕盒避光顯色15～20 min；每孔加50 μL終止液終止顯色。酶標儀讀D492 nm值，選擇陽性小鼠血清D492 nm值接近1.0，P/N值最大時對應的濃度為抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。

1.2.2.3 免疫小鼠抗體水平檢測 將待測免疫小鼠血清1∶1 000稀釋，利用條件優化后建立的間接ELISA方法檢測免疫小鼠抗體水平。

1.2.2.4 雜交瘤細胞的制備和篩選 取血清抗體效價最高的小鼠脾細胞與SP2/0細胞以適當比例混合均勻，參考王雅文等[9]方法進行細胞融合。融合后10～15 d，采用間接ELISA方法對雜交瘤細胞進行2次篩選，第1次篩選時包被抗原為真核表達的EGFP-His蛋白，第2次篩選時抗原為原核表達的EGFP-His蛋白。篩選到的陽性雜交瘤細胞按照常規方法進行亞克隆。

1.2.2.5 單克隆抗體腹水的制備、純化和效價測定 取成年雌性BALB/c小鼠，腹腔內注射液體石蠟0.5 mL/只；10 d后接種雜交瘤細胞，腹腔注射0.2 mL/只；7～10 d后，根據腹水產生情況采集腹水；4 000 r/min離心10 min，除去油脂及細胞成分，收集腹水，測腹水抗體效價。 按照辛酸-硫酸銨法純化腹水中的單克隆抗體，SDS-PAGE分析腹水純化效果，采用間接ELISA方法檢測純化腹水抗體效價。

1.2.2.6 單克隆抗體Western blotting的鑒定 參考1.2.1.5制備SWPV載體表達的EGFP-His蛋白樣品，經SDS-PAGE后轉印至PVDF膜上，分別以9株抗EGFP-His單克隆抗體(待檢樣品)和1株抗PCV2單克隆抗體6E2(陰性對照)為一抗，以1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，通過DAB顯色系統對單克隆抗體進行Western blotting檢測。

2 結 果

2.1 EGFP-His的表達及純化

2.1.1 EGFP-His基因片段的擴增 以合成質粒EGFP-N1為模板擴增P28-EGFP-His片段，擴增產物大小為768 bp(圖1)，與預期一致。

圖1 P28-EGFP-His的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification result of P28-EGFP-His

2.1.2 重組SWPV轉移載體的鑒定 構建好的重組質粒用引物EGFP-F/EGFP-R進行PCR驗證，結果均得到大小約768 bp的明顯條帶(圖2)，與預期相符。提取重組質粒，用NotⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到大小約768和4 700 bp的2個條帶(圖3)，與預期相符。測序結果顯示，插入的基因堿基序列、位置和方向均正確，證明重組轉移載體構建成功。

M，DL2000 DNA Marker；1～6，重組克隆菌M，DL2000 DNA Marker；1-6，Recombinant bacteria clonies圖2 重組質粒pSW-EGFP-His的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pSW-EGFP-His

M1，DNA Marker Ⅳ；1，pSW質粒；2，pSW-EGFP-His重組質粒；M2，DL2000 DNA MarkerM1，DNA Marker Ⅳ；1，pSW plasmid；2，Recombinant plasmid pSW-EGFP-His；M2，DL2000 DNA Marker圖3 重組質粒pSW-EGFP-His的酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pSW-EGFP-His by enzyme digestion

2.1.3 rSWPV-EGFP-His的純化與擴增 rSWPV-EGFP-His在第1輪純化時熒光斑較小，熒光細胞比較分散，熒光斑的數量也較少(圖4A)。經過7輪純化，熒光斑變大、變亮且致密(圖4B)。一般經過7～8輪純化可得到純化的重組病毒，將經驗證的重組病毒依次用24孔板、6孔板、25 cm2培養瓶進行擴增培養，直至在熒光顯微鏡下能觀察到所有細胞均發熒光(圖4C)。

A，第1輪純化；B，第7輪純化；C，增殖的熒光斑A，The first round of purification；B，The seventh round of purification；C，Fluorescent plaques after proliferation圖4 rSWPV-EGFP-His純化、增殖熒光斑(100×)Fig.4 Purification and proliferation fluorescence of rSWPV-EGFP-His (100×)

2.1.4 rSWPV-EGFP-His的PCR鑒定 提取純的rSWPV-EGFP-His和親本SWPV-JX20G的DNA，用引物TK1/TK2進行PCR擴增。結果顯示,親本病毒擴增出一條大小為309 bp的條帶，符合預期；重組病毒rSWPV-EGFP-His僅擴出一條大小為1 077 bp的條帶，而無309 bp的條帶(圖5)，表明EGFP-His基因成功插入到SWPVTK基因中并成功純化到rSWP-EGFP-His。

M，DL2000 DNA Marker；1；SWPV-JX20G strain；2，rSWP-EGFP-His圖5 rSWPV-EGFP-His的PCR擴增結果Fig.5 PCR amplification results of rSWPV-EGFP-His

2.1.5 EGFP-His蛋白的表達與純化 由圖6可知，EGFP-His蛋白存在于重組病毒的細胞培養上清中，蛋白大小約27 ku，為可溶性表達。培養液上清濃縮透析后，采用鎳柱純化，獲得了高純度的EGFP-His蛋白(圖7)。原核表達的EGFP-His溶液為無色，而SWPV載體表達的EGFP-His在可見光下呈現綠色熒光(圖8)。

M，預染蛋白質分子質量標準；1，rSWPV-EGFP-His病毒液懸液；2,rSWPV-EGFP-His病毒液上清；3，rSWPV-EGFP-His病毒液沉淀M，Pre-staining Protein Marker；1，Virus suspension of rSWPV-EGFP-His；2，Supernatant of virus solution of rSWPV-EGFP-His；3，Precipitation of virus solution of rSWPV-EGFP-His圖6 EGFP-His蛋白可溶性分析Fig.6 Soluble analysis of EGFP-His protein

M，預染蛋白質分子質量標準；1，rSWPV-EGFP-His細胞懸液；2～4，EGFP-His蛋白第2、3、4管洗脫液M，Pre-staining Protein Marker；1，Cell suspensions of rSWPV-EGFP-His；2-4，Tube 2,3,4 elution of EGFP-His protein圖7 EGFP-His蛋白純化Fig.7 Purification of EGFP-His protein

1，SWPV載體表達的EGFP-His；2，原核載體表達的EGFP-His1,EGFP-His expressed by SWPV vector；2，EGFP-His expressed by prokaryotic vector圖8 不同載體表達的EGFP-His蛋白Fig.8 EGFP-His protein expressed in different expression vectors

2.2 抗EGFP-His單克隆抗體的制備

2.2.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定 由表1可知，EGFP-His蛋白濃度為5 μg/mL，陰陽性小鼠血清稀釋度為1∶64 000時，陽性小鼠血清D492 nm值接近1.0，P/N值最大，因此，選擇上述濃度作為抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。

表1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

2.2.2 免疫小鼠血清EGFP抗體水平檢測 間接ELISA結果顯示，隨免疫次數增加免疫鼠抗體效價明顯上升(圖9)，其中，5號小鼠免疫效價最高，為1∶256 000，表明SWPV載體表達的EGFP-His蛋白具有良好的免疫原性。

圖9 免疫小鼠血清抗體水平Fig.9 Serum antibody level of immunized mice

2.2.3 雜交瘤細胞篩選結果 選擇效價最高的免疫鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，經間接ELISA篩選到9株能穩定分泌抗EGFP單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為7E12、2F2、4B3、11H6、9H8、17C8、9A10、18A6和17H2。這9株單克隆抗體均能與SWPV載體表達的EGFP-His蛋白反應，其中7株(2F2、4B3、11H6、9H8、17C8、18A6和17H2)能與原核表達的EGFP-His蛋白反應，2株(7E12和9A10)不與原核表達的EGFP-His蛋白反應。

2.2.4 單克隆抗體制備、純化及效價測定 制備的單克隆抗體效價在1∶8×103至1∶2.048×106之間。SDS-PAGE結果顯示，在大小約52和26 ku的位置出現2條明顯的條帶且無其他雜帶(圖10)，表明純化到單克隆抗體，2條條帶分別對應抗體的重鏈和輕鏈，純化效果較好。

M，預染蛋白質分子質量標準；1，抗EGFP-His單克隆抗體17H2腹水；2，純化的抗EGFP-His單克隆抗體17H2M，Pre-staining Protein Marker；1，Ascites of monoclonal antibody 17H2 against EGFP-His；2，Purified monoclonal antibody 17H2 against EGFP-His圖10 EGFP-His單克隆抗體純化結果Fig.10 Purification results of EGFP-His monoclonal antibody

2.2.5 單克隆抗體Western blotting檢測結果 由圖11可知，經Western blotting檢測，2F2、4B3、11H6、9H8、17C8、18A6和17H2這7株單克隆抗體在27 ku處均有明顯的特異性反應條帶，說明其能與變性的SWPV載體表達的EGFP-His蛋白反應，而7E12和9A10這2株單克隆抗體在27 ku處沒有條帶，說明其不能與變性的SWPV載體表達的EGFP-His蛋白反應。抗PCV2單克隆抗體6E12在27 ku處沒有條帶，與預期一致。

M，預染蛋白質分子質量標準；1～4，抗EGFP-His單克隆抗體17C8、4B3、9A10和2F2；5，抗PCV2單克隆抗體6E12；6～10，抗EGFP-His單克隆抗體11H6、9H8、17H2、18A6和7E12M，Pre-staining Protein Marker；1-4，Monoclonal antibodies 17C8,4B3,9A10 and 2F2 against EGFP-His,respectively；5，Monoclonal antibody 6E12 against PCV2;6-10，Monoclonal antibodies 11H6,9H8,17H2,18A6 and 7E12 against EGFP-His,respectively圖11 單克隆抗體Western blotting檢測結果Fig.11 Detection results of monoclonal antibody by Western blotting

3 討 論

隨著分子生物學的發展，基因工程表達外源蛋白取得較大進展，迄今為止，已開發出多種原核和真核表達系統用于外源蛋白的表達，主要包括大腸桿菌、酵母細胞、桿狀病毒、哺乳動物細胞表達系統等。大腸桿菌表達系統為原核表達系統，具有表達背景清楚，表達水平高，操作簡單，培養周期短，抗污染能力強等優點，但其表達產物往往易形成包涵體且難以復性，表達真核基因缺乏翻譯后修飾功能[10]。酵母表達系統為真核表達系統，表達量高，可大規模生產，對異源蛋白有一點簡單的修飾作用，但其發酵過程中常大量產熱、產氣，需要復雜的處理系統。桿狀病毒表達系統具有完善的加工修飾功能，表達產物可組裝成病毒樣顆粒(VLPs)，具有與天然蛋白近似的功能，但其生產需要昂貴的細胞培養基和血清，生產成本較高，且外源蛋白處于極晚期病毒啟動子的調控之下，由于病毒感染引發細胞凋亡，導致細胞生存時間短無法進行連續性表達，表達量低[11]。哺乳動物表達系統能產生正確折疊的蛋白，提供復雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等翻譯后修飾功能，表達產物更接近于天然蛋白，是多種基因工程藥物的生產平臺[12-13]。研究發現，原核表達的GFP大部分以不可溶的包涵體形式存在，即使是經過改造的EGFP表達產物也只是少部分可溶，且在細菌系統中產生的大多數非細菌蛋白無法形成天然構象，相反，真核表達系統具有一系列翻譯后加工修飾體系，表達的外源蛋白更接近于天然蛋白[14]。朱反修等[15]用桿狀病毒表達載體表達的GFP在日光下可見微弱綠色，具有與天然GFP相似的生物活性。為獲得正確折疊及具有生物活性的GFP，本研究采用SWPV表達載體在豬腎上皮細胞中表達EGFP-His蛋白，該蛋白為可溶性表達，與原核表達的EGFP-His相比，在可見光下呈現明顯綠色。

GFP發色團的形成取決于肽鏈的正確折疊，其對溫度敏感，高于65 ℃時熒光形成不穩定[16]，熱變性的GFP無法有效復性或恢復熒光[17]。研究表明，GFP抗原結構中含有構象依賴型的抗原表位，經變性后會丟失，Nakamura等[18]制備了針對熱變性GFP的多克隆抗體，可識別經熱處理和變性劑處理后暴露的GFP表位，該多克隆抗體針對的是GFP的線性表位。為獲得不同種類的抗GFP單克隆抗體，本試驗分別利用SWPV載體和原核載體表達的EGFP-His蛋白為檢測抗原進行間接ELISA，共篩選到9株抗EGFP-His單克隆抗體。 間接ELISA和Western blotting結果顯示，其中有2株單克隆抗體(7E12和9A10)既不與原核表達的EGFP-His蛋白反應，也不與經SDS處理的SWPV載體表達的EGFP-His蛋白反應。這是因為2株單克隆抗體針對的是天然GFP的構象表位，該表位在蛋白變性(如熱處理和尿素處理)后可被破壞，從而導致針對構象表位的單克隆抗體無法和抗原發生反應。其余7株單克隆抗體均可識別變性和非變性形式的GFP，針對的是GFP的線性表位。

GFP自發現以來被作為理想的基因表達標記，已被廣泛應用于跟蹤蛋白在細胞、組織和生物體中的定位和相互作用，檢測外源基因表達情況等[19-22]。通過熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀可進行GFP定量檢測，Gerena-lópez等[23]通過流式細胞術對轉染的Molt-4T細胞系的EGFP表達進行了定量；茍吉慶等[24]利用熒光分光光度計對植物組織中的GFP表達水平進行定量分析，其結果與熒光顯微鏡觀察結果高度一致；張塏等[25]建立了一套通過定量檢測細胞熒光強度從而測定EGFP表達水平的方法，該方法簡單有效,且不依賴于大型儀器設備,具有較高的準確性與靈敏度，但上述方法均存在一定局限性，結果判定主觀性強，無法進行準確定量。制備抗GFP的特異性抗體可用于建立免疫學檢測方法，對GFP或GFP標記的融合蛋白進行定量或半定量檢測[26]。劉全等[27]以GFP兔抗血清為一抗,辣根過氧化物酶標記的羊抗兔血清為二抗,建立了GFP定量檢測的間接ELISA方法，該方法能正確反映藍氏賈第鞭毛蟲病毒(GLV)介導的GFP表達情況,可用于GFP定量方析。本研究在表達EGFP-His蛋白的基礎上制備了抗EGFP-His的單克隆抗體，可用于今后建立免疫學檢測方法，對GFP進行定性/定量檢測，為SWPV表達載體的相關研究奠定基礎。

4 結 論

本研究利用SWPV載體成功表達并純化了EGFP-His蛋白，大小為27 ku，為可溶性表達，可見光下呈現明顯綠色。采用雜交瘤技術制備了9株抗EGFP-His蛋白單克隆抗體，其中2株針對GFP的構象表位，其余7株針對GFP的線性表位。本研究制備的EGFP-His蛋白和9株抗EGFP-His單克隆抗體為后續建立GFP的免疫學檢測方法提供了必備材料。