非洲豬瘟病毒360-12L蛋白的原核表達及其多克隆抗體制備

蔣亞君，陳世鈺，鑫 婷，郭曉宇，王召陽，劉雪婷，崔 帥，王 洋，朱鴻飛，賈 紅

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；2.華南農業大學，廣州 510630)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的急性、熱性動物傳染病，是目前對家豬影響最大的疾病之一，具有高度傳染性和致死性。1921年，Montgomery將其鑒定為不同于經典豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的一種病毒[1]，在肯尼亞短暫流行后傳入南非和安哥拉，在撒哈拉以南非洲國家、馬達加斯加、撒丁島形成大流行[2]，自2007年以來，東歐國家及部分亞洲國家報道了大量ASF疫情[3]，2018年8月中國首次報道，隨后蒙古國、越南、日本、菲律賓、韓國、南非等均報道了相關疫情[4-5]。由于病毒本身復雜、基因多樣性、與宿主互作機制不明等原因[6]，目前仍缺乏特異性治療方法和有效的商業疫苗，主要通過早期檢測、嚴格的生物安全措施、撲殺感染動物等方法進行防控,對全球養豬業造成巨大經濟損失。

ASFV是具有囊膜的雙鏈DNA病毒，是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的成員[7]。根據毒株不同，病毒基因組長度為170～194 kb，可編碼眾多蛋白[8]。 ASFV Georgia 2007/1株多基因家族(MGF)360家族有15個成員，分布于基因組的兩端，攜帶MGF多個拷貝的ASFV毒株基因組更大，毒力更強[9]。在穩定的細胞系中培養，基因組左側的MGF360及其他病毒基因部分缺失，可導致毒力下降[10]。其中，12L基因位于基因組左側末端的重復區域，可通過阻斷importinα和NF-κB的信號通路，抑制IFN-Ⅰ的產生，可能是ASFV逃避宿主先天免疫的新策略[11]，但其免疫調控機制仍需進一步研究。基于此，本研究擬構建12L基因的原核表達系統，優化其誘導表達溫度，純化獲得重組蛋白，并制備鼠源多克隆抗體，以期為后續該蛋白的進一步生物學功能研究、血清學診斷方法的建立提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28a(+)載體、pEGFP-N1載體、HEK 293T細胞均由北京畜牧獸醫研究所獸醫公共衛生安全與管理創新團隊保存；BamHⅠ和XhoⅠ限制性內切酶均購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；2×RapidTaqMax Master Mix、大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α感受態細胞均購自南京諾唯贊生物技術有限公司；DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司；蛋白質分子質量標準(26616)購自Thermo公司；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG、Alexa Flour 594-Conjugated Goat anti-Mouse IgG(H+L)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、Western blotting發光液均購自天根生化科技(北京)有限公司；考馬斯亮藍購自BBI公司；Ni Bestarose FF、DEAE Bestarose FF、BXK26/100層析柱、BXK16/20層析柱均購自博格隆公司；Omega質粒提取試劑盒、Omega膠回收試劑盒均購自寶林可(北京)生物科技有限公司；碳酸纖維素膜(NC膜)購自寶生物工程(大連)有限公司；SDS-PAGE預制膠及其緩沖液均購自南京金斯瑞生物科技股份有限公司。6周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 引物設計與合成

根據GenBank ASFV參考序列(登錄號：NC_044959.2)合成MGF 360-12L基因，合成基因全長1 053 bp；根據參考序列用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并在上、下游引物中分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點及其保護性堿基，引物序列為：上游引物ASFV-12L-F：5′-CGCGGATCCATGTT-GCCTTCCCTGCAA-3′；下游引物ASFV-12L-R：5′-CCGCTCGAGTCATCTTAAATCATAGG-3′，下劃線處分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，目的基因及引物均送由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。

1.3 重組質粒的構建

以合成的pCMV-3×Flag-12L為模板，利用設計的引物擴增目的片段。PCR擴增體系50 μL:2×RapidTaqMaster Mix 25 μL，引物ASFV-12L F/R各2 μL，陽性質粒模板 1 μL，ddH2O 20 μL；PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共35個循環；72 ℃延伸8 min。將 pET-28a(+)載體和pEGFP-N1質粒分別雙酶切，回收的目的基因DNA片段分別與線性化的pET-28a(+)質粒、pEGFP-N1質粒過夜連接，將連接產物分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α感受態細胞，涂布于LB固體平板(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃過夜培養，挑取單克隆接種于LB液體培養基(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃、200 r/min振蕩培養，并由北京擎科新業生物技術有限公司測序，將測序結果正確的重組菌命名為pET-28a-12L/BL21和pEGFP-N1-12L/DH5α，提取的重組質粒進行雙酶切鑒定。

1.4 12L重組蛋白的誘導表達及可溶性分析

將重組菌pET-28a-12L/BL21培養至D600 nm值為0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG；分別于37和16 ℃進行誘導表達，每2 h取樣一次，收集菌體，煮沸裂解，10% SDS-PAGE分析不同溫度下重組菌的表達情況，取表達量較高的樣品組，超聲破碎，4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清及沉淀，SDS-PAGE對表達產物進行可溶性分析。

1.5 12L重組蛋白的純化

根據1.4操作方法對重組菌pET-28a-12L/BL21進行誘導表達，37 ℃ 6 h后以8 000 ×g離心10 min收集菌體，超聲破碎后離心收集沉淀，包涵體經變性、復性過程[12]，復性蛋白經Ni柱親和層析進行純化；采用梯度洗脫方式，先用平衡緩沖液(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl+300 mmol/L NaCl+30 mmol/L咪唑)平衡柱子；再用洗滌緩沖液(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl+500 mmol/L NaCl+60 mmol/L 咪唑)洗脫雜蛋白；最后用洗脫緩沖液(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl+300 mmol/L 咪唑)洗脫目的蛋白,將純化后的蛋白命名為12L重組蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，SDS-PAGE鑒定其純度。

1.6 鼠抗12L重組蛋白多克隆抗體制備及12L重組蛋白鑒定

取50 μg 12L重組蛋白與等量弗氏完全佐劑混勻、乳化，采用腹部多點皮下注射方式免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，對照組注射等體積的PBS，在首次免疫后2、4周時，將蛋白與等量弗氏不完全佐劑混勻乳化后加強免疫，三免后1周采血，收集血清。

取純化的12L重組蛋白進行Wertern blotting鑒定，10% SDS-PAGE后轉膜(NC膜)，經5%脫脂乳37 ℃封閉1 h后，加入稀釋的小鼠血清(1∶1 000稀釋)為一抗，辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗，鑒定蛋白反應原性。

1.7 12L重組蛋白多克隆抗體效價檢測

采用方陣滴定法將純化的12L重組蛋白倍比稀釋后包被酶標板，4 ℃過夜孵育；PBST洗板(5 min/次，3次)后加入5%脫脂乳(PBS配制)于37 ℃封閉2 h；PBST再次洗滌3次，加入倍比稀釋的免疫后小鼠血清為一抗，37 ℃ 孵育1 h，PBST洗滌3次；以加入辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌后，加入TMB顯色 20 min，用2 mmol/L HCl終止反應后讀取D450 nm值。根據方陣結果篩選最佳包被濃度和反應條件，建立12L重組蛋白抗體間接ELISA方法，采用該方法測定免疫小鼠多克隆抗體的效價。

1.8 12L重組蛋白多克隆抗體的間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定

將HEK 293T細胞鋪于24孔板，待細胞長至匯合度為70%～80%時，將pEGFP-N1-12L、pEGFP-N1分別轉染至HEK 293T細胞(1 μg/mL質粒DNA)，48 h后于熒光顯微鏡中觀察。棄去上清，用PBS洗滌3次后，用預冷的無水乙醇固定30 min，PBS洗滌3次，加入0.1% Triton X-100 室溫靜置10 min，PBS清洗3次，1% BSA溶液封閉，以12L重組蛋白免疫的小鼠血清和PBS免疫的小鼠血清(1∶100稀釋)為一抗，Alexa Flour 594-Conjugated Goat anti-Mouse IgG(H+L)(1∶50稀釋)為二抗，37 ℃避光孵育 1 h；PBS洗滌5次后于熒光顯微鏡下觀察熒光。

2 結 果

2.1 12L基因重組質粒的構建及鑒定

以合成的質粒為模板，擴增到約1 053 bp的目的片段(圖1)，經膠回收、酶切、連接、轉化后，構建重組質粒，構建好的重組質粒pET-28a-12L和重組質粒pEGFP-N1-12L進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，結果顯示，獲得大小分別約為5 000 bp的載體條帶和1 053 bp的目的條帶(圖2A、2B)。陽性質粒測序顯示，與ASFV參考株Georgia 2007/1的12L基因100%同源，表明重組質粒pET-28a-12L和pEGFP-N1-12L構建正確。

2.2 12L重組蛋白的誘導表達及可溶性分析

測序正確的重組菌pET-28a-12L/BL21經IPTG誘導，SDS-PAGE鑒定，結果顯示，37 ℃誘導 6 h后表達量較高，表達產物在54.7 ku處出現目標條帶(圖3)，與預期大小相符，表明重組蛋白誘導表達成功。

①A，16 ℃誘導重組蛋白的表達；B，37 ℃誘導重組蛋白的表達。②M，Thermo26616預染Marker；1，pET-28a/BL21；2，未誘導的pET-28a-12L/BL21；3～10，分別為誘導2、4、6、8、10、12、14和16 h樣品①A,Expression of recombinant protein at 16 ℃;B,Expression of recombinant protein at 37 ℃.②M,Thermo26616 pre-dyed Marker;1,pET-28a/BL21 empty vector;2,pET-28a-12L/BL21 without induction;3-10,Samples collected at 2,4,6,8,10,12,14 and 16 h after induction,respectively圖3 不同溫度條件下12L重組蛋白誘導表達情況Fig.3 Expression of recombinant protein 12L at different temperature conditions

2.3 12L重組蛋白的純化及鑒定結果

將誘導后的pET-28a-12L/BL21破碎上清及沉淀分別進行SDS-PAGE，對表達產物進行可溶性分析。結果顯示，該蛋白在沉淀中出現，顯示其為包涵體表達(圖4A)。將表達的包涵體變性、復性后再進行Ni柱親和層析純化和SDS-PAGE鑒定，由圖4B可知，在54.7 ku處出現目標條帶，且較單一，表明12L重組蛋白純化效果較好，純度較高。BCA測定12L重組蛋白濃度為1.71 mg/mL。 Western blotting檢測顯示，在54.7 ku處出現目標條帶(圖5),表明12L重組蛋白反應原性較好。

1,pET-28a-12L/BL21 37 ℃誘導6 h；2，pET-28a-12L/BL21 37 ℃誘導6 h破碎后沉淀；3，pET-28a-12L/BL21 37 ℃誘導6 h破碎后上清；M，Thermo26616預染Marker；4，純化的12L重組蛋白1,Lysate of pET-28a-12L/BL21 after induced at 37 ℃ for 6 h;2,Supernatant of induced pET-28a-12L/BL21 at 37 ℃ for 6 h;3,Precipitation of induced pET-28a-12L/BL21 at 37 ℃ for 6 h;M,Thermo26616 pre-dyed Marker;4,Purified recombinant protein 12L圖4 12L重組蛋白的表達(A)及純化鑒定(B)Fig.4 Expression (A) and purification identification (B) of recombinant protein 12L

圖5 12L重組蛋白Western blotting鑒定Fig.5 Detection of recombinant protein 12L by Western blotting

2.4 重組蛋白多克隆抗體效價檢測結果

利用建立的間接ELISA方法對制備的12L重組蛋白的鼠源多克隆抗體進行效價測定，通過方陣測定法，將純化的12L重組蛋白倍比稀釋后包被酶標板，結果顯示，12L重組蛋白的最佳包被濃度為2.5 μg/mL，制備的多克隆抗體稀釋度為1∶512 000時，其陽性血清和陰性血清仍具有顯著差異，陽性血清D450 nm值大于陰性血清D450 nm值2倍以上(圖6)，表明其效價較高。

圖6 12L重組蛋白鼠源多克隆抗體的ELISA效價測定Fig.6 ELISA titer determination of mouse polyclonal antibody against recombinant protein 12L

2.5 重組蛋白的IFA檢測結果

采用IFA檢測12L重組蛋白鼠源多克隆抗體的反應性，結果顯示，轉染48 h后pEGFP-N1-12L和pEGFP-N1轉染后的HEK 293T細胞中均可觀察到綠色熒光(圖7A、7B)，表明12L瞬時表達成功。將轉染細胞用無水乙醇固定后經IFA檢測，結果顯示，12L重組蛋白免疫小鼠血清可特異性識別HEK 293T細胞中表達的12L蛋白，出現特異性紅色熒光，而以未免疫小鼠血清為一抗的對照細胞無熒光(圖7C、7D)，表明所制備的鼠抗ASFV 12L多克隆抗體與真核表達的12L重組蛋白發生特異性反應，特異性較強。

圖7 融合蛋白瞬時表達及IFA鑒定結果(100×)Fig.7 Transient expression and IFA analysis of fusion protein (100×)

3 討 論

ASFV高度穩定，可通過感染豬、污染的豬肉產品和飼料等多種途徑傳播[13]，具有急性、熱性、高度傳染性的特點，對家豬的致死率可達100%[14]，對全球養豬業和國民經濟造成嚴重威脅。滅活苗不能提供保護，傳代培養的弱毒疫苗安全性不夠，因此，目前疫苗研究主要集中于開發靶向基因缺失或亞單位改良活病毒上[15]。其中，MGF家族是基因缺失疫苗中常用的靶點之一，研究顯示，在Benin 97/1和Georgia株中敲除MGF家族基因可提供同源保護[16-19]，但關于多基因家族和其他已知基因無序列相似性,關于其基因功能研究較少[17]。 ASFV 12L全長蛋白可顯著抑制IRF9和IFN-β刺激介導的ISRE啟動子活化，從而抑制IFN-β介導的免疫應答和抗病毒作用[20]，可能是ASFV免疫逃逸策略之一。

目前大腸桿菌表達系統廣泛應用于各類病原微生物蛋白的表達，是研究最為成熟的表達系統，易獲得大量的高純度蛋白及特異性高的抗體,該方法操作簡單、高效。目前ASFV多種蛋白如CP204[21]、p30[22]、B438L[23]和EP153R[24]等均構建了原核表達系統。原核表達蛋白可用于血清學檢測方法的建立，隨著ASF疫情發展，抗體檢測具有顯著優勢，可檢出核酸檢測中漏掉的樣本，為疫情提供更全面的監測[25]。目前ASFV原核表達蛋白如p72、EP364R和pA104R等[26-28]均已建立ELISA檢測方法。但關于ASFV 12L蛋白相關系統報道較少，因此,本研究選擇在原核表達系統中誘導表達12L蛋白，并制備其鼠源多克隆抗體，以期為之后血清學診斷方法開發及360-12L基因功能研究提供生物材料。

本研究合成ASFV Georgia 2007/1株的360-12L基因，將其連接至pET-28a(+)和pEGFP-N1 2個載體，成功構建了12L基因的原核表達系統和真核表達系統，對比其他文獻顯示，這類高分子質量和低水溶性蛋白在原核表達過程中易聚集生成包涵體[29]。有研究人員將ASFV K205R和B602L蛋白與類彈性蛋白多肽(ELP)融合表達獲得了可溶性表達，通過相變循環純化，簡單高效，且后期可切除ELP標簽，避免了與帶標簽的亞單位疫苗檢測的交叉反應[30-31]，值得參考。可能由于蛋白表達量較高，缺少充足的時間進行蛋白折疊，在本試驗中獲得的蛋白也為包涵體蛋白，本試驗通過降低誘導溫度仍未獲得可溶性表達產物，后期可嘗試其他載體和標簽方式構建表達系統。此次經變性復性后獲得的12L重組蛋白，經試驗證明具有良好的免疫原性，純度較高，反應原性較好，表明純化的重組蛋白具有一定的生物活性和應用潛力。同時，本試驗所制備的鼠源多克隆抗體效價>1∶512 000，且具有較高的特異性，可用于后續試驗。本研究構建的真核表達系統有助于進一步研究12L基因在病毒中的功能，可通過免疫共沉淀、酵母雙雜交等試驗篩選互作蛋白，進行蛋白生物學功能研究及病毒相關免疫保護性研究，進一步研究病毒復雜的致病機制。

4 結 論

本試驗利用原核表達系統成功表達12L重組蛋白，篩選其最佳誘導溫度并分析其在大腸桿菌中的表達情況，并制備了鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗體，為進一步研究12L蛋白結構、生物學功能、ASFV疫苗研制及診斷方法開發提供生物材料。