1型鵝星狀病毒ORF2蛋白原核表達及其多克隆抗體的制備與鑒定

劉 莉，顧玲玲，張 碩，謝 軍，朱善元，王安平

(1.江蘇農牧科技職業學院,江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，泰州 225300；2.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，連云港 222005)

近年來，中國鵝場暴發了一種主要引起4～20日齡雛鵝痛風癥狀的傳染病，其主要特征為跛行或癱瘓，剖檢可見內臟和關節有大量尿酸鹽沉積，死亡率高達50%，給中國養鵝業造成了重大的經濟損失。

星狀病毒(Astrovirus,AstV)為單股正鏈、無囊膜的RNA病毒,于1975年首次發現于患腸胃炎的嬰兒糞便中[1]。透射電子顯微鏡觀察可見其表面具有特征性星狀結構，因此被命名為星狀病毒[2]。首個GAstV FLX株全基因組序列報道于2017年[3]，FLX株基因組全長為7 299 nt，其基因組結構與星狀病毒屬其他成員相似，由3個不同的重疊開放閱讀框(ORF1a、ORF1b和ORF2)組成。其中，ORF1a 和ORF1b編碼非結構蛋白[4]，ORF2編碼病毒衣殼蛋白(Cap蛋白)，是基因組中的高變區域，與病毒粒子形成及抗體產生相關[5]。此后，陸續報道了多株GAstV全基因組序列，如GD[6]、SDPY[7]、HN1G[8]、SD01[9]、GsFJ02[10]和HN01[11]等。遺傳進化分析表明，所有已知序列的GAstVs均屬于2個不同的系統進化分支，因此，有學者建議將FLX類毒株命名為GAstV-1，將SD01類毒株命名為GAstV-2，又稱之為新型GAstV[10]。

已有多篇文獻報道用GAstV-2進行雛鵝回歸試驗可復制出鵝痛風，證明GAstV-2是鵝痛風的病原[6-8]。江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室課題組前期研究證明，用GAstV-1 TZ03接種健康雛鵝，可引起與臨床癥狀相似的鵝痛風，說明GAstV-1也是鵝痛風的病原之一[12]。張玉杰等[13]報道，GAstV-1與GAstV-2混合感染能致雛鵝發生典型痛風癥狀，且比單獨感染導致的死亡率更高。因此，為了做好鵝痛風的防控，需對GAstV-1與GAstV-2做好診斷和檢測工作。

目前尚無用于GAstV檢測的商品化試劑盒，張玉霞等[14]建立了GAstV-2 LAMP快速檢測方法，Yuan等[15]建立了GAstV-2實時熒光定量PCR方法，呂炫等[16]利用大腸桿菌系統表達了GAstV-2衣殼蛋白，且制備了高效價多克隆抗體。而針對GAstV-1診斷檢測方法的研究鮮有報道。本研究在前期分離鑒定的GAstV-1的基礎上，利用大腸桿菌表達系統表達GAstV-1衣殼蛋白ORF2，并制備其多克隆抗體，以期為GAstV-1血清學檢測方法的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌種與細胞

GAstV-1 TZ03毒株(全基因組序列GenBank登錄號：MW353015)由江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室分離鑒定并保存；pET-30a(+)由江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室保存；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態細胞均購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶及預染蛋白質分子質量標準均購自Thermo公司；DNA膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；質粒抽提試劑盒、His標簽蛋白純化試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、HRP標記的抗His標簽鼠單克隆抗體及DAB顯色試劑盒均購自康為世紀有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；HRP標記的羊抗兔IgG、FITC標記的羊抗兔IgG均購自KPL公司。

1.3 ORF2基因密碼子優化及合成

在不改變ORF2基因核苷酸序列的前提下，對其核苷酸序列進行優化，將大腸桿菌稀有密碼子改變為大腸桿菌偏嗜性密碼子，同時在該基因兩端引入BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位點。優化后的基因序列由上海英濰捷基生物技術有限公司合成，并克隆于pGEM-T質粒載體中。

1.4 重組質粒pET-ORF2的構建及鑒定

將含有優化基因ORF2的質粒和原核表達載體pET-30a(+)分別用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后，分別回收ORF2基因片段和pET-30a(+)載體，兩者經T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化大腸桿菌 DH5α感受態細胞，37 ℃培養14 h。隨機挑取單菌落，接種于含卡那青霉素(50 μg/mL)的LB液體培養基擴增培養，提取質粒后用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的菌株送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.5 重組菌誘導表達

將測序正確的重組質粒pET-ORF2及載體質粒pET-30a(+)分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，挑取單菌落接種于含卡那青霉素(50 μg/mL)的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養12 h，次日按1∶100的比例轉接至相同培養基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養，當菌液D600 nm值達0.6～1.0時，加入 IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，37 ℃誘導3～5 h，離心收集菌體，溶于適量PBS中，超聲波裂解菌體，取裂解后的菌液12 000 r/min離心10 min，將上清和沉淀分別與5×Loading Buffer混勻，煮沸5 min，進行SDS-PAGE分析。同時轉印至PVDF膜上，5% BSA 4 ℃封閉過夜，用HRP標記的抗His標簽單克隆抗體(1∶1 000稀釋)于37 ℃孵育2 h，DAB顯色試劑盒進行顯色觀察。

1.6 重組蛋白純化

按上述1.5的方法重新誘導菌液100 mL，4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，溶于適量PBS，超聲波裂解菌體，按照His標簽蛋白純化試劑盒說明書進行純化，以200 mmol/L咪唑緩沖液進行洗脫，將洗脫液進行SDS-PAGE鑒定。利用BCA蛋白定量試劑盒對純化后的重組蛋白濃度進行定量。

1.7 多克隆抗體制備

參照劉雪婷等[17]制備多克隆抗體血清，將上述純化的重組蛋白ORF2與弗氏完全佐劑等體積混勻，充分乳化。以背部皮下多點注射免疫新西蘭大白兔，每只家兔免疫的蛋白量為400 μg。首免2和4周后，以相同量的重組蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化，分別進行二免和三免。三免后第14天采血，分離血清，-20 ℃保存備用。

1.8 多克隆抗體鑒定

1.8.1 多克隆抗體效價測定 將純化后的重組蛋白稀釋至濃度為2 μg/mL，100 μL/孔包被96孔酶標板，4 ℃作用過夜。PBST洗滌5次，3 min/次，每孔加入200 μL含有5%脫脂乳的PBST封閉液，37 ℃封閉2 h。PBST洗滌后，每孔加入用封閉液倍比稀釋的待檢血清200 μL，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌后，加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌后，TMB避光顯色30 min，加入2 mol/L H2SO4終止反應，在酶標儀上讀取D450 nm值。同時設立免疫前兔血清作為陰性對照。

1.8.2 間接免疫熒光試驗(IFA)檢測 參考文獻制備鵝胚腎細胞(GEK)[11]，將GAstV-1 TZ03毒株以100 TCID50感染GEK細胞，48 h后棄去上清，PBS洗滌2次，用-20 ℃預冷的甲醇固定20 min，PBS洗滌3遍后加入5% BSA室溫封閉1 h。以制備的兔源多克隆抗體血清為一抗(1∶200)，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌5次，以FITC標記的羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)為二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3遍后置于熒光倒置顯微鏡下進行觀察。同時以未接種病毒的GEK細胞作為陰性對照。

2 結 果

2.1 重組質粒pET-ORF2鑒定

將酶切回收的目的基因ORF2與載體pET-30a(+)連接，轉化大腸桿菌 DH5α感受態細胞，經PCR篩選獲得重組子，提取質粒經BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定，產生大小約為5 400和2 140 bp的2條條帶(圖1)，與預期大小一致，表明ORF2基因已成功克隆入載體pET-30a(+)中。測序結果完全正確。

圖1 重組質粒pET-ORF2雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET-ORF2 by double enzyme digestion

2.2 重組蛋白ORF2的誘導表達及SDS-PAGE分析

將測序正確的重組質粒pET-ORF2及載體質粒pET-30a(+)分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，經IPTG誘導，重組蛋白獲得較高水平表達，SDS-PAGE分析結果顯示，在約70 ku處出現一條明顯的蛋白條帶，與預期的6His-ORF2融合蛋白大小一致，且以包涵體形式存在(圖2)。

M,蛋白質分子質量標準；1,pET-30a(+)誘導菌裂解上清；2,pET-ORF2誘導菌裂解上清；3,pET-30a(+)誘導菌裂解沉淀；4,pET-ORF2誘導菌裂解沉淀M,Protein Marker;1,Supernatant of lysed pET-30a(+) after inducement;2,Supernatant of lysed pET-ORF2 after inducement;3,Precipitation of lysed pET-30a(+) after inducement;5,Precipitation of lysed pET-ORF2 after inducement圖2 重組蛋白ORF2的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein ORF2

2.3 重組蛋白ORF2純化

對純化后的重組蛋白ORF2進行SDS-PAGE鑒定，結果顯示，在約70 ku處出現特異性條帶，與重組蛋白的理論值相符，且條帶較單一(圖3)，說明重組蛋白獲得成功純化。利用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，蛋白濃度為1.02 mg/mL。

圖3 純化重組蛋白ORF2的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein ORF2

2.4 重組蛋白ORF2的Western blotting鑒定

用HRP標記的抗His標簽鼠單克隆抗體對表達的重組蛋白進行Western blotting鑒定，結果顯示，在分子質量約70 ku處出現了特異性條帶(圖4)，與預期條帶大小一致，表明表達的重組蛋白具備良好的反應原性。

M,蛋白質分子質量標準；1,pET-ORF2誘導菌裂解沉淀；4,pET-30a(+)誘導菌裂解沉淀M,Protein Marker;1,Precipitation of lysed pET-ORF2 after inducement;2,Precipitation of lysed pET-30a(+) after inducement圖4 重組蛋白ORF2的Western blotting鑒定Fig.4 Identification of recombinant protein ORF2 by Western blotting

2.5 多克隆抗體效價測定

將純化的重組蛋白ORF2包被酶標板，利用間接ELISA方法測定多克隆抗體效價。結果顯示，制備的ORF2多克隆抗體效價最高達1∶128 000(圖5)。

圖5 多克隆抗體效價測定Fig.5 Titer determination of polyclonal antibody

2.6 多克隆抗體IFA鑒定

通過IFA對制備的兔源多克隆抗體血清進行鑒定，結果顯示，GAstV-1感染的GEK細胞中有大量特異性免疫熒光，而對照組未出現熒光(圖6)，說明制備的兔源多克隆抗體血清能與GAstV-1發生特異性結合。

A,感染GAstV-1的GEK細胞；B,未感染的GEK細胞A,GEK cells infected with GAstV-1;B,Uninfected GEK cells圖6 ORF2多克隆抗體IFA鑒定(200×)Fig.6 Identification of ORF2 polyclonal antibody by IFA (200×)

3 討 論

鵝痛風為近年來的新發病，死亡率高達50%，給養鵝業造成了巨大的經濟損失。分析其原因主要有：①鵝痛風病原較復雜，有GAstV-1和GAstV-2，2種GAstV不僅基因同源性不到60%，且兩者之間沒有交叉保護作用[13,18]；②目前尚無商品化的GAstV疫苗產品用于該病的防控；③目前為止，還沒有成熟的GAstV診斷檢測試劑，僅有的幾篇文獻是關于GAstV-2 PCR檢測方法的建立[14-16]，而關于GAstV-1檢測方法的研究還鮮見報道，因此，有必要積極開發其診斷制劑。

ORF2是星狀病毒的結構蛋白，不僅介導病毒與宿主的相互作用，還可刺激機體產生中和抗體[19-21]。本研究選擇原核表達載體，以前期分離的GAstV-1 TZ03株為基礎，表達GAstV-1結構蛋白ORF2。前期試驗中，以GAstV-1基因組為模板，高保真PCR方法擴增出ORF2基因，將其克隆入原核表達載體pET-30a(+)，在優化了不同條件之后，重組蛋白均沒有表達。重新利用其他原核表達載體如pET-28(+)、pET-32a(+)、pCold TF等，仍不表達。分析其原因，GAstV-1ORF2基因密碼子可能不是原核表達系統所偏愛的密碼子。因此，對ORF2基因進行了大腸桿菌偏愛性密碼子優化合成后，再克隆入原核表達載體pET-30a(+)，SDS-PAGE和Western blotting結果表明重組蛋白ORF2獲得了正確、高效的表達。蒲路莎等[22]利用原核表達載體pET-32a(+)，未經密碼子優化，成功表達了GAstV-2 HLJ01株ORF2基因；孫佳卉等[23]利用原核表達載體pET-30a(+)，同樣未經密碼子優化，成功表達了GAstV-2 CH16株ORF2基因。以上研究表明，雖然很多外源基因不需進行偏愛性密碼子優化也能在大腸桿菌中獲得高效表達，但GAstV-1ORF2基因密碼子不適合在原核表達系統中表達，需進行密碼子優化后才能在大腸桿菌中獲得較高水平表達，同時也說明GAstV-1與GAstV-2ORF2基因在密碼子的偏嗜性上差異較大。

4 結 論

本研究利用原核表達系統成功表達了GAstV-1結構蛋白ORF2，制備了高效價的兔抗ORF2蛋白多克隆抗體，且該抗體具有良好的反應性和特異性，能特異性識別GAstV-1，可用于臨床樣品GAstV-1的檢測及相關方法的建立。