超高壓預處理對西番蓮果皮抗氧化能力及對HepG2細胞氧化損傷保護作用的影響

孫朋真，曹建新，趙天瑞，程桂廣*

（昆明理工大學食品科學與工程學院，云南 昆明 650500）

紫色西番蓮（Passiflora edulisSims）屬西番蓮科，俗稱熱情果和雞蛋果，在我國云南、海南、臺灣等地區種植歷史悠久[1]。紫色西番蓮果皮（the peel ofPassiflora edulisSims，PEP）具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病等作用，這些作用歸因于生物活性化合物如酚類化合物、黃酮類化合物和多糖等[2-4]。然而，西番蓮果實多被用于果汁生產，PEP卻被當作工業廢料處理，造成極大的浪費。

酚類化合物以游離態、酯化態和不溶性結合態存在于植物中[5]。先前的研究表明，PEP富含可溶性酚類化合物（游離態酚類化合物：用不同溶劑通過超聲波輔助提取、超臨界流體萃取等傳統方法獲得的酚類物質）[6]，而忽略了酯化態和結合態（與某些大分子、細胞壁多糖或蛋白質結合）[7]，因此PEP中酚類物質的含量及其生物活性可能被低估。另外，多酚類物質是公認的抗氧化劑，在飲食中添加抗氧化劑以增強人體抗氧化機制是預防各種慢性疾病的重要手段[8]。因此，提高PEP的多酚提取率和生物活性具有重要意義。

近年來，超高壓預處理已成為提高某些化合物提取率和生物活性的有效手段[9]。超高壓（壓力范圍在100～600 MPa）預處理可用于提取水果、果汁等物料中的生物活性物質[10]。對植物材料施加壓力可以破壞其三維結構，破壞材料大分子間的氫鍵、離子鍵以及疏水鍵等非共價鍵，還可以破壞細胞膜中的鹽橋和疏水相互作用，提升滲透率，從而促進酚類等生物活性物質的釋放[11-12]。此外，超高壓已經成功地被應用到棕櫚果、龍眼果皮、茶多酚等活性成分的提取[9,13-14]，但是，目前鮮有關于超高壓預處理對PEP中游離態、酯化態和不溶性結合態多酚提取的研究。因此，本研究旨在探討超高壓預處理對PEP中不同形態酚類及其抗氧化能力和細胞保護作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色西番蓮果實于2018年從中國云南省昆明當地市場購買，并在中國科學院昆明植物研究所進行鑒定。將這些水果人工分成果肉和果皮，然后將果皮切成小塊，用冷凍干燥機凍干。

福林-酚試劑、2,2-二苯基-1-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氨-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ehtylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、噻唑藍（methylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、胰蛋白酶消化液 美國Sigma-Aldrich公司；HepG2細胞中國科學院昆明野生動物細胞庫；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素、鏈霉素、培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM） 美國Gibco公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒 北京四正柏生物科技有限公司；沒食子酸（gallic acid，GA）、蘆丁（rutin，R）（純度≥98%） 成都曼斯特生物科技有限公司；其他試劑是國產分析級純度。

1.2 儀器與設備

HHP-600型超高壓設備 包頭科發高壓科技有限責任公司；Hei-VAP型旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；Epoch 2微孔板分光光度計 美國伯騰公司。

1.3 方法

1.3.1 超高壓預處理及PEP游離態、酯化態和結合態多酚的提取

取上述冷凍干燥的PEP，將其研成粉末。稱取20 g PEP粉末（3 份）放入真空包裝密封，根據預實驗結果，確定最合適的超高壓條件：500 MPa下超高壓處理10 min，以水作為壓力傳遞介質，電壓380 V，溫度25 ℃，將此記為超高壓組。

未超高壓組和超高壓預處理組的果皮粉游離態、酯化態和不溶性結合態多酚的提取參考Zhang Chengting等[15]的方法。首先用石油醚以料液比1∶10混合脫脂處理未超高壓組和超高壓預處理組果皮粉5 min，重復3 次。脫脂樣品在空氣中干燥后，兩組樣品（10 g）用體積分數70%甲醇溶液（1∶10，m/V）100 mL在25～30 ℃下超聲提取30 min，抽濾后，濾渣按照上述料液比和超聲條件重復提取兩次。收集3 次濾液，用旋轉蒸發儀濃縮至黏稠狀，用D101大孔樹脂富集，用水洗脫除糖后，再用95%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液并濃縮[16]，濾渣保留用于結合態多酚的收集。濃縮后液體用6 mol/L HCl溶液調至pH 2.0，然后用乙酸乙酯萃取5 次，收集上層萃取液，采用旋轉蒸發儀真空濃縮后，所得浸膏采用真空冷凍干燥機凍干得到游離態多酚。萃余相（水相）先用4 mol/L NaOH溶液以體積比1∶10水解4 h，然后將pH值調至2.0，接著按照游離態多酚的提取方法進行萃取、收集、濃縮、凍干，從而得到酯化態多酚。對于結合態多酚的提取，首先用4 mol/L NaOH以體積比1∶10水解濾渣4 h，將pH值調至2后過濾，然后按照提取游離多酚的方法進行萃取、收集、濃縮、凍干得到結合態多酚。

1.3.2 PEP不同形態多酚和黃酮含量的測定

精準稱取各提取物5 mg（3 份），配制成質量濃度1 mg/mL的溶液，采用福林-酚法[17]對PEP超高壓前后的游離態、酯化態和結合態多酚含量進行測定，結果用每克多酚提取物含沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）（mg GAE/g提取物）表示，提取率用每克PEP含沒食子酸當量（mg GAE/g PEP）表示。參考劉南波等[18]的方法測定PEP超高壓前后的游離態、酯化態和不溶性結合態黃酮含量，結果用每克多酚提取物含蘆丁當量（rutin equivalent，RE）（mg RE/g提取物）表示，提取率用每克PEP含蘆丁當量（mg RE/g PEP）表示。

1.3.3 PEP不同形態多酚抗氧化活性測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力測定

參考Thaipong等[19]的方法通過DPPH自由基清除實驗對PEP超高壓前后的游離態、酯化態和結合態多酚的抗氧化活性進行測定，DPPH自由基清除能力按公式（1）計算。

式中：A1為空白組的吸光度；A2為樣品組的吸光度。

計算PEP超高壓前后不同形態多酚DPPH自由基清除能力的半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）（DPPH自由基清除能力達到50%時的多酚質量濃度）。

1.3.3.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參照沙玉歡等[20]的方法測定超高壓前后PEP的3 種多酚的ABTS陽離子自由基清除能力， ABTS陽離子自由基清除能力按公式（2）計算。

式中：A1為空白組的吸光度；A2為樣品組的吸光度。

計算PEP超高壓前后不同形態多酚ABTS陽離子自由基清除能力的IC50（ABTS陽離子自由基清除能力達到50%的多酚質量濃度）。

1.3.3.3 鐵離子還原能力測定

鐵離子還原能力（ferric-reducing antioxidant power capacity，FRAP）測定在李新原等[10]的方法上稍作修改，用FeSO4當量（μmol Fe2+/g提取物）表示各種形態多酚的FRAP。

1.3.4 HepG2細胞氧化損傷模型的建立

1.3.4.1 細胞培養及樣品細胞毒性測定

用含有10% FBS和1%抗生素（青霉素和鏈霉素混合物）的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2的條件下培養HepG2細胞。通過MTT法[9]檢測PEP不同形態多酚對HepG2細胞的毒性，以此確定合適濃度進行后續實驗。

1.3.4.2 HepG2細胞活性氧含量的測定

采用Yang Meilian等[21]的方法稍作修改，測定H2O2誘導的HepG2細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平。將HepG2細胞以1×105細胞/孔密度接種2 mL于6 孔培養板中，培養24 h，然后樣品組加入含PEP超高壓處理前后的游離態、酯化態和不溶性結合態多酚（終質量濃度100 μg/mL）的培養基，陽性對照組加入含質量濃度10 μg/mL VC的培養基，空白組和模型組更換DMEM培養基。24 h后，去除培養基，各組（不含空白組）加入0.7 mmol/L H2O2孵育6 h，收集細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液沖洗2 次，37 ℃黑暗中用10 mmol/L DCFHDA孵育20 min。孵育結束后，用無FBS的預冷培養基沖洗細胞兩次，然后立即用流式細胞儀檢測每組的熒光信號，并計算細胞內ROS的含量。

1.3.4.3 細胞凋亡率的測定

根據凋亡試劑盒說明書檢測細胞凋亡率，分析PEP不同形態多酚對H2O2誘導細胞凋亡的保護作用。

1.4 數據處理與統計分析

實驗數據測量重復3 次，所有數據均以平均值±標準差表示。用SPSS 17.0和Origin 8.5軟件對實驗數據進行處理，采用單因素方差分析和Duncan法確定差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 超高壓預處理對PEP中不同形態多酚提取率的影響

未超高壓組的游離態、酯化態和結合態多酚的提取率分別為（3.25±0.49）、（0.61±0.02）、（0.21±0.03）mg GAE/g PEP。如表1所示，經超高壓預處理后，游離態、酯化態和結合態多酚的提取率均顯著增加（P＜0.05），分別為（6.90±0.13）、（0.80±0.07）、（0.28±0.02）mg GAE/g PEP（P＜0.05）。對于PEP而言，不同形態多酚的提取率由高到低依次為游離態多酚＞酯化態多酚＞結合態多酚。超高壓預處理后不同形態黃酮的提取率也都顯著增加，尤其是酯化態和結合態黃酮的提取率，分別提升了4.63 倍和3.80 倍。可能是因為超高壓更大程度上改變了PEP的細胞壁結構，破壞了多酚、黃酮類物質與蛋白質、多糖等生物大分子的結合，使多酚、黃酮類化合物最大限度釋放出來，尤其是酯化態和結合態多酚、黃酮類化合物，從而提高其提取率[10,22]。

表1 超高壓預處理對PEP中不同形態多酚提取率的影響Table 1 Extraction rates of free, esterified, and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated peel of P.edulis

2.2 超高壓處理對PEP提取物中多酚和黃酮含量的影響

如圖1所示，就提取物而言，未超高壓組的PEP的3 種形態多酚中，游離態多酚和黃酮含量最高，分別為（78.52±1.14）mg GAE/g提取物和（51.65±1.06）mg RE/g提取物，其次是結合態多酚和黃酮，酯化態多酚和黃酮含量最少，分別為（53.77±0.71）mg GAE/g提取物和（6.67±0.71）mg RE/g提取物。之前的報道發現紫色馬鈴薯皮[23]和紅辣椒[24]中也主要含有游離態多酚，而花生皮中酯化態多酚含量更高[25]，棠梨果皮中結合態多酚最多[7]。超高壓預處理后顯著提高了游離態多酚和黃酮含量，分別為（174.30±0.80）mg GAE/g提取物和（101.25±2.01）mg RE/g提取物，較未超高壓組提高了1.22 倍和0.96 倍。之前有研究報道超高壓預處理可以提高游離態多酚含量[9]。與游離態多酚不同的是，超高壓預處理后，酯化態多酚含量降低，但酯化態黃酮含量升高，結合態多酚含量降低，而結合態黃酮含量無顯著變化（P＞0.05）。這可能是未超高壓的PEP中部分多酚和黃酮類化合物與其他大分子結合，導致正常條件下提取困難，超高壓預處理破壞了PEP中多酚和黃酮類物質與生物大分子間化學鍵的連接，從而顯著提高了游離態多酚、游離態和酯化態黃酮類物質含量[9]。

圖1 未超高壓和超高壓處理的紫色西番蓮果皮提取物的游離態、酯化態和結合態多酚和黃酮的含量Fig.1 Phenol and flavonoid contents of free, esterified, and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated peel of P.edulis

2.3 超高壓預處理對PEP提取物不同形態多酚抗氧化活性的影響

2.3.1 超高壓預處理對PEP提取物不同形態多酚DPPH自由基清除能力的影響

如圖2所示，超高壓預處理前后，所有形態的多酚對DPPH自由基的清除能力與不同形態多酚含量呈劑量效應關系，其中相同劑量下，無論是否經過超高壓預處理，游離態多酚的DPPH自由基清除率都是3 種多酚中最強的。未超高壓游離態多酚IC50為（126.75±6.71）μg/mL，超高壓游離態多酚IC50為（71.25±6.65）μg/mL，與未超高壓處理組相比，超高壓預處理能顯著提高游離態多酚的DPPH自由基清除能力（P＜0.05）。

圖2 未超高壓和超高壓預處理的紫色西番蓮果皮提取物游離態、酯化態和結合態多酚的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of free, esterified and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated peel of P.edulis

2.3.2 超高壓預處理對PEP提取物不同形態多酚ABTS陽離子自由基清除能力的影響

由圖3可知，超高壓預處理前后的6 組提取物均表現出良好的ABTS陽離子自由基清除能力，且清除能力大小順序為超高壓游離態多酚＞未超高壓游離態多酚＞未超高壓結合態多酚＞未超高壓酯化態多酚＞超高壓酯化態多酚＞超高壓結合態多酚。未超高壓的PEP中，游離態多酚表現出最高的清除活性，其IC50為（176.35±4.56）μg/mL。經過超高壓處理后，不僅游離態多酚和游離態黃酮含量升高，其ABTS陽離子自由基清除能力也顯著升高（P＜0.05），IC50為（91.28±6.34）μg/mL，明顯低于未超高壓的游離態多酚。

圖3 未超高壓和超高壓預處理的紫色西番蓮果皮提取物游離態、酯化態和結合態多酚的ABTS陽離子自由基清除能力Fig.3 ABTS cation radical scavenging activity of free, esterified and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated peel of P.edulis

2.3.3 超高壓預處理對PEP提取物不同形態多酚鐵離子還原能力的影響

超高壓預處理前后，PEP 3 種形態多酚的FRAP如圖4所示，6 個組的FRAP均表現出與DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力相同的規律。超高壓預處理前后，相同質量濃度、同種形態多酚組的FRAP有顯著性差異（P＜0.05），與各組多酚含量表現出相同變化規律，各組FRAP可能與多酚類物質良好的抗氧化作用有關。另外，經過超高壓預處理的游離態多酚的FRAP最大，達到（970.26±22.85）μmol Fe2+/g提取物。

圖4 未超高壓和超高壓預處理的紫色西番蓮果皮提取物的游離態、酯化態和結合態多酚的FRAPFig.4 Ferric reducing antioxidant power (FRAP) of free, esterified and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated peel of P.edulis

2.4 超高壓預處理對PEP提取物不同形態多酚對HepG2細胞氧化損傷保護作用的影響

2.4.1 超高壓預處理PEP提取物不同形態多酚對HepG2細胞內ROS相對含量的影響

ROS是正常細胞代謝產生的內源性自由基之一[26]。ROS可以作為體內的信號傳遞物質，但如果ROS過量積累則將攻擊身體組織、器官和細胞，導致慢性疾病[27]。H2O2容易穿透細胞膜，是最常見的ROS產生源，因此本實驗采用H2O2誘導HepG2細胞構建氧化損傷模型[28]。MTT實驗結果表明樣品在100 μg/mL對該細胞無毒，故后續實驗采用此濃度。如圖5A所示，經H2O2處理的模型組熒光信號明顯向右偏移（P＜0.05），說明經過處理后模型組細胞產生了大量的ROS。將空白組ROS水平設為100%，由圖5B定量結果可知，H2O2處理后細胞產生的ROS相對含量高達（172.36±5.13）%，經過VC處理后，細胞產生的ROS相對含量為（101.43±2.31）%，顯著低于模型組（P＜0.05）。經過樣品處理后，未超高壓和超高壓預處理的PEP中3 種形態多酚處理組的細胞內ROS相對含量較模型組顯著降低（P＜0.05），尤其是酯化態多酚處理組中細胞內ROS相對含量（未超高壓組為（105.46±2.84）%、超高壓組為（101.74±3.46）%）與VC組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。超高壓預處理后，游離態多酚處理組細胞內ROS相對含量與未超高壓組相比沒有顯著性差異，而結合態多酚處理組細胞內ROS含量顯著升高（P＜0.05），可能是因為超高壓預處理PEP中結合態多酚顯著減少。有研究報道，棕櫚果超高壓預處理后多酚提取物對H2O2誘導HepG2細胞的氧化損傷所引起ROS含量增加的抑制作用均強于未超高壓組[9]，這與本實驗得到的結果不完全相同。然而棕櫚果中結合態多酚保護作用最優，使用質量濃度為120 μg/mL，高于本實驗所用質量濃度，但效果與本研究同條件下得到的結合態多酚接近，因此可推知PEP中各類形態多酚都有很好的細胞氧化損傷保護作用。

圖5 未超高壓和超高壓預處理的紫色西番蓮果皮提取物游離態、酯化態和結合態多酚對H2O2引起的細胞內ROS生成的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of free, esterified and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated P.edulis peel on H2O2-induced formation of intracellular ROS in HepG2 cells

2.4.2 超高壓預處理PEP提取物不同形態多酚對HepG2細胞凋亡水平的影響

細胞凋亡本來是機體正常運轉的一種生理現象，然而氧化損傷等原因會造成細胞不正常凋亡[21]。由圖6可知，與空白組相比，H2O2處理顯著增加了模型組HepG2細胞的凋亡率（P＜0.05）。經過VC處理，細胞凋亡率較模型組顯著降低（P＜0.05）。經過樣品處理后，不同形態多酚的細胞凋亡率較模型組均顯著下降（P＜0.05），其中未超高壓處理的酯化態和結合態多酚的細胞凋亡率與陽性對照組沒有顯著性差異（P＞0.05）。超高壓預處理后的PEP提取物中酯化態和結合態多酚的細胞凋亡率較未超高壓組顯著增高（P＜0.05），可能是因為超高壓預處理后總酚含量有所下降。整體來看，PEP中游離態、酯化態和結合態多酚均能對氧化損傷引起的細胞凋亡起到良好的保護作用。

圖6 未超高壓和超高壓預處理的紫色西番蓮果皮提取物的游離態、酯化態和結合態多酚對H2O2造成的HepG2細胞凋亡的保護作用Fig.6 Cytoprotective effect of free, esterified and insoluble bound phenolic fractions from non-treated and UHP-treated P.edulis peel on H2O2-induced HepG2 cells

3 結 論

本實驗以PEP為原料，研究超高壓預處理對其游離態、酯化態和結合態多酚抗氧化能力和細胞保護能力的影響。結果表明，超高壓預處理顯著提高了PEP中3 種形態多酚的提取率，同時顯著提高了PEP中游離、酯化和結合態多酚和黃酮含量。對于不同提取物而言，游離態多酚和黃酮含量及其體外抗氧化活性顯著升高，然而結合態和酯化態多酚含量及體外抗氧化能力降低。對于3 種不同形態多酚，超高壓處理后游離態多酚和黃酮含量最高，并顯示出最強的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力以及最高的FRAP，各類多酚的抗氧化能力與其含量呈正相關，與之前的報道結果[24,29]相似。未超高壓和超高壓預處理的PEP中3 種提取物均表現出很好的細胞保護作用，可以有效地降低H2O2誘導HepG2細胞產生ROS的含量和H2O2誘導HepG2細胞的凋亡率，其中酯化態多酚的效果最好。可能是因為西番蓮果皮提取物中酯化態酚類物質具備更好的自由基清除能力，已有研究人員發現，花生皮中酯化態酚類化合物具有最強的抗氧化能力，其主要成分為兒茶素和表兒茶素等黃酮類成分[25]，西番蓮果皮經超高壓預處理后，黃酮類物質顯著升高，但主要成分有待進一步考證。綜上，超高壓預處理可顯著提高PEP的游離態多酚含量和抗氧化能力，能更高效地增加其在功能食品和營養食品工業中的應用和經濟價值。