超聲預處理對大豆分離蛋白-兒茶素非共價/共價復合物結構及功能的影響

代世成，連子騰，馬林智，佟曉紅，田 甜，亓偉杰，彭潮勇，范宇航，王 歡,2,*，江連洲,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司，黑龍江 佳木斯 154000）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是一種重要的植物蛋白，由于營養價值高、生產成本低、具有優良的生物相容性以及加工特性，廣泛應用于食品工業、農業、生物技術等領域[1]，一直以來是學者們的研究熱點。由于多酚類物質如茶多酚、花青素、槲皮素等小分子多酚具有較強的抗炎、抗菌以及抗氧化性，可以清除人體自由基，減輕炎癥反應，從而起到預防心血管疾病的作用[2]。因此，近年來大量研究人員研究蛋白質與多酚相互作用及其復合物的功能性質。兩者之間的相互作用對食品的生產和營養價值起著重要作用，主要分為非共價（可逆）和共價（不可逆）相互作用[3]，其中非共價相互作用主要是蛋白質上的氫原子受體和多酚的酚羥基結合形成氫鍵，蛋白質上的某些氨基酸基團或殘基也會和酚羥基或者苯環結合形成離子鍵、疏水作用、范德華力等。而共價相互作用主要是多酚可以在堿性或者氧化酶存在的條件下，氧化生成醌類物質，與蛋白發生親核加成反應形成共價復合物（親核基團包括氨基、巰基、或者某些氨基酸殘基）[4]。

兒茶素是一類屬于黃酮類的多酚類化合物，是茶多酚的主要成分，可以通過預防各種疾病來改善人體健康。Jia Zhenbao等[5]研究發現乳清蛋白通過與兒茶素共價交聯，可以引起蛋白質二級和三級結構發生變化，并增強蛋白的起泡性。Chen Gang等[6]發現茶多酚與大豆蛋白通過非共價相互作用可以提高大豆蛋白的溶解度。Zhou Siduo等[3]通過向SPI中添加表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）制備出SPI-EGCG非共價/共價復合物，發現EGCG可以改變SPI的二級結構，生成的共價復合物比非共價復合物更穩定。

超聲是一種較強的物理處理方法，能改變蛋白質分子結構，破壞蛋白質分子內鍵，對其溶解性有一定影響[7]。另一方面，超聲處理在食品中可用于輔助提取、滅菌、乳化、結晶、干燥等，主要是利用超聲波的空化作用、機械效應及熱效應對食品的結構和功能產生影響[8]。Jambrak等[9]通過高強度超聲處理乳清蛋白降低蛋白的分子質量，增加其溶解度。Li Yihe等[10]發現超聲可以改變蛋白的二級結構，提高菜籽蛋白的功能性質，這種變化在堿性條件下尤為明顯。

目前研究多集中于超聲改性蛋白以及多酚非共價/共價改性蛋白，但超聲與多酚聯合改性蛋白卻少有報道。因此，本實驗為探究超聲聯合多酚改性對蛋白結構及功能的影響，SPI經超聲處理后，在pH 3、7、9、12的條件下制備了SPI-兒茶素非共價/共價復合物，比較其溶解性、起泡性和抗氧化性等功能性質，并通過熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜和分子對接技術解析SPI-兒茶素的相互作用及對結構的影響，以期為超聲聯合酸/堿處理在蛋白改性領域以及大豆蛋白-多酚復合物作為功能性食品成分的應用提供研究依據和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕 哈爾濱益海嘉里糧油食品工業有限公司；兒茶素（綠茶，純度＞98%）、考馬斯亮藍G250、牛血清白蛋白 上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine，DPPH）、2,2’-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、磷酸鹽緩沖液（干粉） 北京索萊寶科技有限公司；5×上樣緩沖液、電泳液（Tris-Gly）、彩色預染標準分子質量蛋白（10～170 kDa）、Plus PAGE預制膠（Tris-Gly，預制膠質量分數4%～20%，10 孔） 上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AL204型分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C型實驗室pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；F-6000熒光分光光度計 日本Hitachi公司；TU-1800 紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Allegra64R臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼公司；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

根據Li Yang等[11]的方法。將脫脂豆粉與去離子水按照1∶10（m/V）比例混合后，調節pH值為8.0攪拌，9 000×g離心30 min，取上清液并調節pH值為4.5。靜置2 h后6 000×g離心20 min得到蛋白沉淀，用去離子水洗滌至溶液pH值為7.0，凍干得到SPI粉末，使用杜馬斯定氮儀測定蛋白質量分數為（92.26±0.36）%。

1.3.2 大豆分離蛋白超聲預處理條件的確定

1.3.2.1 超聲功率的確定

將SPI按照1∶100（m/V）比例溶于磷酸鹽緩沖液（pH 7.4、10 mmol/L，后同）中進行超聲處理，將超聲探頭插入距離溶液底部1 cm處，在冰浴（0 ℃）下超聲，總超聲時間為10 min（處理5 s，間隔5 s），功率分別為100、200、300、400、500 W。參照Zhang Yezhong等[12]的方法，將SPI稀釋50 倍（蛋白質量濃度為0.02 mg/mL），用F-6000熒光分光光度計進行熒光光譜的測定，參數設定：λEx為280 nm，λEm為300～500 nm，增長間隔為1 nm，掃描速率為600 nm/min。選擇光譜熒光強度峰值最大的處理功率作為超聲預處理功率。

1.3.2.2 超聲時間的確定

將SPI按照1∶100（m/V）比例溶于磷酸鹽緩沖液中進行超聲處理，在1.3.2.1節優化后的超聲功率下處理（處理5 s、間隔5 s），時間為2、5、10、15、20 min。測定樣品的熒光光譜，方法同1.3.2.1節，確定最佳超聲預處理時間。

1.3.3 SPI-兒茶素復合物的制備

SPI-兒茶素非共價/共價復合物的制備方法參考文獻[4]。

非共價復合物的制備：將SPI按照1∶100（m/V）比例溶解于磷酸鹽緩沖液中，按照1.3.2節的方法進行超聲預處理，超聲處理過的蛋白記為USPI，未超聲處理的蛋白記為NUSPI，以NUSPI和USPI為對照組，分別量取100 mL不同溶液調節pH值至3.0和7.0，加入適量兒茶素粉末室溫下避光攪拌24 h，制得不同pH值下的USPI、NUSPI與兒茶素復合物，分別記為pH3NUSPI-C、pH3USPI-C、pH7NUSPI-C、pH7USPI-C。

共價復合物的制備：將SPI按照1∶100（m/V）比例溶解于磷酸鹽緩沖液中，按照1.3.2節的方法進行超聲預處理，分別量取100 mL USPI、NUSPI溶液調節pH值至9.0、12.0，加入適量兒茶素粉末室溫下避光攪拌24 h，制得不同pH值下的USPI、NUSPI與兒茶素的復合物，分別記為pH9NUSPI-C、pH9USPI-C、pH12NUSPI-C、pH12USPI-C。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜分析

參考文獻[13]的測定參數，用IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀對樣品在波數范圍4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1條件下測定紅外光譜。光譜圖利用Peakfit 4.2.0軟件進行處理，利用積分面積計算各二級結構的相對含量[14]。

1.3.5 熒光光譜分析

所有樣品稀釋50 倍，用F-6000熒光分光光度計進行熒光光譜的測定，方法同1.3.2.1節。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定

根據Laemmli等[15]的方法稍作修改，利用SDS-PAGE測定樣品的分子質量，分析SPI和兒茶素的結合情況。使用BeyoGel? Plus PAGE預制膠（Tris-Gly，預制膠質量分數4%～20%，10 孔），將SPI及SPI-兒茶素復合物與上樣緩沖液混勻煮沸5 min，冷卻至室溫后上樣，采用彩色預染蛋白標準分子質量標準蛋白作為標準蛋白，上樣質量濃度為2 mg/mL，上樣量為10 μL。電泳過程中維持100 V恒壓1 h直至指示條帶遷移至底，電泳結束后用BeyoBlueTM考馬斯亮藍超快染色液對凝膠進行染色，隨后脫色并拍照觀察。

1.3.7 蛋白質溶解度測定

參考Shimada等[16]的方法稍作修改，將樣品溶液在10 000×g條件下離心20 min，取上清液稀釋，采用Lowry法測定樣品中可溶蛋白質含量，采用凱氏定氮法測定樣品總蛋白含量。用牛血清白蛋白為標準品繪制標準曲線，按式（1）計算蛋白質溶解度。

1.3.8 濁度測定

參考Martini等[17]的方法，室溫下，將所有樣品稀釋2 倍（蛋白質量濃度為5 mg/mL）后用TU-1800 紫外-可見分光光度計在600 nm波長處測定吸光度。

1.3.9 起泡性及泡沫穩定性測定

參照Aewsiri等[18]的方法。樣品用高速均質機以12 000 r/min均質2 min，將泡沫全部倒入量筒中，并記錄初始泡沫體積以及在室溫下靜止15 min后的泡沫體積，分別按式（2）、（3）計算起泡性和泡沫穩定性。

式中：V是均質前溶液體積/mL；V0是均質后的起始泡沫體積/mL；V1是均質后靜止15 min的泡沫體積/mL。

1.3.10 抗氧化性測定

根據Gong Ying等[19]的方法測定樣品的DPPH自由基清除能力。2 mL樣品（蛋白質量濃度為0.05 mg/mL）加入2 mL DPPH溶液（吸光度為0.7～1.0），混勻，空白組用等體積去離子水替代樣品溶液，避光反應30 min，用TU-1800紫外-可見分光光度計在517 nm波長處測定吸光度，按式（4）計算DPPH自由基清除率。

式中：A1為實驗組；A0為空白組。

根據Zhou Siduo等[3]的方法測定樣品的ABTS陽離子自由基清除能力。0.5 mL樣品（5 mg/mL）加入2 mL ABTS溶液（吸光度為0.70±0.02），混勻，空白組用等體積去離子水替代樣品溶液，避光反應6 min，用TU-1800紫外-可見分光光度計測定734 nm波長處吸光度，按式（5）計算ABTS陽離子自由基清除率。

式中：A1為實驗組；A0為空白組。

1.3.11 分子對接

參考Wang Qiming等[20]的方法稍作修改。11S蛋白、7S蛋白的晶體結構取自蛋白質數據庫PDB（Protien Date Bank）（11S蛋白編碼為2D5F；7S蛋白編碼為3AUP）。通過ChemBio Draw U1tra 14.0、Chem 3D、Pymol軟件進行前處理，采用AutoDock Tools-1.5.6軟件進行分子對接，通過Pymol軟件對分子對接結果進行處理。

1.4 數據處理與分析

以上實驗重復3 次，結果采用平均值±標準差表示，利用SPSS 26軟件進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗進行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。采用Origin 2019b 32bit軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 超聲對SPI結構的影響

由于蛋白質和多酚結合過程實質是蛋白的側鏈基團（如色氨酸）和多酚小分子的官能團（如酚羥基）發生非共價/共價結合，可以通過熒光分光光度計測定色氨酸的數量來確定SPI內部結構的打開程度以及SPI與兒茶素的結合程度[21]。本征熒光光譜在激發波長為280 nm處可以反映蛋白質內部色氨酸的熒光強度變化，大量色氨酸存在于SPI的內部疏水區域，當熒光強度上升，說明蛋白內部暴露的色氨酸基團增多[22]。如圖1A所示，當固定超聲時間5 min，經過不同功率超聲處理后，SPI的熒光強度明顯增強，其中超聲功率為500 W處理的熒光強度提升最大。如圖1B所示，當固定超聲功率為500 W，經過不同時間超聲處理，發現5 min的條件下熒光強度提升最大，說明在500 W、5 min的超聲處理條件下SPI結構打開程度最為明顯，色氨酸基團暴露最多[22]。同時也說明超聲處理可以促進蛋白內部疏水區域的打開。

圖1 不同超聲功率（A）、不同超聲時間（B）的SPI熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of SPI treated at different ultrasonic powers (A) and for different periods of time (B)

2.2 pH值對蛋白質-兒茶素復合物二級結構的影響

傅里葉變換紅外光譜被廣泛用來表征蛋白質的二級結構[23]，圖2為超聲預處理的SPI在不同pH值下與兒茶素形成復合物的傅里葉變換紅外光譜圖。經過不同條件處理后，其酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）發生較為明顯的改變，其變化主要歸因于C＝O拉伸振動、N—H的彎曲和C-H的拉伸振動，酰胺I帶吸收峰向低頻方向移動，可能是蛋白質經超聲處理后分子內締合形成氫鍵所致[24]。樣品傅里葉變換紅外光譜擬合的二級結構相對含量如表1所示，與NUSPI相比，超聲后的蛋白α-螺旋和β-折疊相對含量顯著減少，β-轉角和無規卷曲相對含量顯著增加（P＜0.05），說明超聲導致SPI的結構變得更加松散且無序。伴隨著兒茶素的加入以及pH值的改變，得到的復合物中也觀察到了相似的趨勢，大量的α-螺旋和β-折疊轉化為β-轉角和無規卷曲，尤其是在pH 12和超聲處理的條件下最為顯著（P＜0.05），其中，pH12USPI-C樣品的β-轉角相對含量增加至40.20%，無規卷曲相對含量增加至28.61%，該處理使SPI結構變得更加松散和舒展，從而使蛋白肽鏈內部的疏水基團和極性基團暴露于表面，增大了SPI與兒茶素的相互作用程度[22]。

圖2 不同pH值的SPI及SPI-兒茶素復合物的傅里葉變換紅外光譜Fig.2 FTIR spectra of SPI and SPI-catechin complexes formed at different pHs

表1 不同pH值下超聲預處理的SPI及SPI-兒茶素復合物的二級結構相對含量Table 1 Secondary structures of SPI and SPI-catechin complexes pretreated by ultrasound at different pHs

2.3 pH值對蛋白質-兒茶素相互作用的影響

本實驗通過本征熒光光譜考察SPI內部色氨酸的熒光強度變化，來研究蛋白內部結構的變化以及蛋白和兒茶素的結合程度。當色氨酸在蛋白質內部沒有暴露出來時，熒光強度較低，熒光峰位會發生藍移，當蛋白質結構展開色氨酸暴露出來時，熒光強度增加并發生紅移[25]。如圖3所示，與NUSPI相比，超聲后的SPI熒光強度增加，可能是由于超聲產生的空化作用改變了蛋白質分子內部的極性微環境，使蛋白結構變得疏松，蛋白質內部的色氨酸暴露出來導致熒光強度增加[26]。隨著兒茶素的加入以及pH值的增加，復合物的熒光強度下降程度逐漸增大，與NUSPI-C組比較，USPI-C復合物的熒光強度下降更大，且共價結合作用下的熒光強度下降更為明顯，其中pH 12下的USPI-C復合物下降最明顯，與NUSPI相比熒光強度降低了89.16%，同時發生了明顯的紅移（5 nm），這可能是由于超聲處理過使SPI內部疏水區域打開，結構變得松散，兒茶素與蛋白在堿性條件下產生不可逆的共價作用大大降低了色氨酸含量，色氨酸的側鏈氨基（—NH2）與兒茶素的C發生共價交聯生成C—N共價鍵，使得部分色氨酸基團被掩蓋，改變了色氨酸附近的疏水環境，降低了熒光強度[27]。

圖3 不同pH值的SPI及SPI-兒茶素復合物的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of SPI and SPI-catechin complexes formed at different pHs

2.4 pH值對蛋白質-兒茶素復合物分子質量的影響

利用電泳圖可以觀察復合物的分子質量以及SPI結合兒茶素的程度，圖4為不同pH值下超聲預處理的SPI及SPI-兒茶素復合物的SDS-PAGE圖。

圖4 不同pH值的SPI及SPI-兒茶素復合物的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE images of SPI and SPI-catechin complexes formed at different pHs

如圖4所示，樣品1與樣品2沒有明顯差異，表明500 W超聲對SPI的亞基成分影響較小。樣品7～10的分離膠頂部有黑色條帶出現，說明有新的復合物生成，其中樣品8和樣品10（USPI-C）最頂部條帶較樣品7、9（NUSPI-C）顏色更深，可能是因為超聲后的SPI內部結構打開，結合位點增加，促進了與兒茶素結合，樣品10可能是因為SPI經過超聲和堿處理后結構打開程度更明顯，結合了更多的兒茶素，形成了更強的共價交聯，結果表明SPI與兒茶素發生共價交聯生成了共價復合物。樣品3和4可能是由于在pH 3下制備，可溶性蛋白質量濃度較低導致電泳條帶顏色較淺，樣品3～6并未形成新的條帶，表明在pH 3和pH 7條件下SPI和兒茶素未發生共價交聯，未改變蛋白質的四級結構[4]。

2.5 pH值對蛋白質-兒茶素復合物溶解度的影響

蛋白質的溶解性是蛋白質在食品應用中一個重要的功能特性，因為蛋白質溶解性差可能限制其他功能性質的發揮。蛋白質溶解度取決于某些內在因素（如蛋白質氨基酸組成以及序列）和外在因素（pH值、溫度、離子強度）[28]。如圖5所示，SPI經超聲處理后溶解度顯著增加（P＜0.05），可能是因為超聲使SPI發生裂解形成了更小的粒子，引起蛋白質的比表面積增加，促進了蛋白質與水之間的相互作用，引起蛋白質溶解度增大[8]。而SPI與兒茶素在不同pH值下形成的復合物溶解度差異較大，pH 3時可能由于溶液體系的pH值距離SPI的等電點較近，導致部分蛋白沉淀降低了溶解度[28]。pH 7時溶解度較未處理SPI有所增加，可能是由于兒茶素引入的—OH基團與水分子形成氫鍵增強了復合物的水合作用。而在pH 9和pH 12條件下，添加兒茶素顯著降低了SPI的溶解度（P＜0.05），可能是由于在堿性條件下，兒茶素氧化為茶黃素類物質（醌類物質），與SPI側鏈形成C-N鍵形成了網狀結構，從而形成了顆粒較大不溶性的復合物，其分子質量也有所增加[29]，SDS-PAGE圖進一步證實了這一結論。這與Prigent等[30]的發現相似，當pH≥8.0時，綠原酸發生氧化，形成醌類物質，該化合物的存在會導致溶菌酶的溶解度降低。如圖5所示，對于同一pH值下的復合物而言，超聲預處理會增加其溶解性，可能是因為超聲處理過的SPI結構打開程度更大，結合更多兒茶素的同時，也引入了大量的親水基團（羥基和羧基），因此溶解度增大[31]。

圖5 不同pH值的SPI及SPI-兒茶素復合物的溶解度Fig.5 Solubility of SPI and SPI-catechin complexes formed at different pHs

2.6 pH值對蛋白質-兒茶素復合物濁度的影響

濁度分析是一種直觀反映蛋白質-兒茶素之間相互作用的方法，濁度的增加可歸因于復雜聚集體的數量和尺寸的增加[32]。如圖6所示，引入兒茶素后，pH 3、7、9下形成的復合物濁度較SPI顯著增大（P＜0.05），說明溶液內形成了較大顆粒的物質。溶液在pH 3和pH 7下形成非共價復合物，pH 3的復合物濁度比pH 7高，可能是因為距離SPI等電點較近導致蛋白沉淀。在pH 9和pH 12下形成共價復合物，而pH 12的復合物濁度顯著低于pH 9（P＜0.05），可能是由于pH 12距離SPI等電點較遠。pH 9的復合物濁度較高可能是因為在堿性條件下SPI與兒茶素共價交聯形成了粒度較大的網狀復合物[33]。而超聲預處理顯然提高了溶液濁度，可能是因為SPI經過超聲后內部結構打開，結合了更多的兒茶素形成了更大分子質量的聚集物[34]，SDS-PAGE結果也證實了這一點。

圖6 不同pH值的SPI及SPI-兒茶素復合物的濁度Fig.6 Turbidity of SPI and SPI-catechin complexes formed at different pHs

2.7 pH值對蛋白質-兒茶素復合物起泡特性的影響

起泡特性對于許多食品的質量至關重要，比如牛奶、冰淇淋、鮮奶油、蛋糕和面包等[29]。如圖7所示，隨著兒茶素的添加以及pH值的增大，SPI的起泡性和泡沫穩定性顯著增強（P＜0.05），蛋白質-兒茶素復合物表現出更高的固有黏度，產生了更穩定的泡沫，可能是因為兒茶素的加入降低了SPI界面的表面壓力，使蛋白結構展開與其發生相互作用，令界面薄膜變得更加穩定[35]。堿性條件下兒茶素的添加對于蛋白起泡性比酸性強，這可能是由于共價交聯結構可以有效地提高蛋白在氣/液表面的展開，形成更多泡沫網絡結構，通過抑制蛋白聚集和歧化增強了泡沫的形成，因此起泡性更好。而堿性條件下SPI與兒茶素通過共價鍵結合形成的具有網狀結構的共價復合物更加穩定，因此泡沫穩定性更好[4]。通過SPI超聲處理后形成的蛋白質-兒茶素復合物明顯比未處理蛋白形成的復合物起泡性和泡沫穩定性更好，可能是因為SPI超聲后溶解得更多，結合了更多的兒茶素，從而有利于發揮其起泡性能。Xiong Ting等[36]研究發現與未處理的豌豆分離蛋白相比，超聲處理后的豌豆分離蛋白產生的氣泡尺寸更小、更均勻，且起泡性優于未處理的蛋白。

圖7 不同pH值的SPI及SPI-兒茶素復合物的起泡特性（A）及泡沫穩定性（B）Fig.7 Foaming ability (A) and foam stability (B) of SPI and SPI-catechin complexes formed at different pHs

2.8 pH值對蛋白質-兒茶素復合物抗氧化性的影響

本實驗通過測定DPPH自由基清除能力和ABTS陽離子自由基清除能力來探究超聲預處理對不同pH值下SPI-兒茶素復合物抗氧化能力的影響。由圖8可知，DPPH自由基清除率與ABTS陽離子自由基清除率結果趨勢基本一致，與NUSPI樣品相比，隨著pH值的增加以及SPI超聲預處理，形成的復合物抗氧化能力逐漸增強，在pH 12時提升最顯著（P＜0.05），pH12USPI-C樣品的DPPH自由基清除率提高至NUSPI樣品的5.5 倍，ABTS陽離子自由基清除率提高至NUSPI樣品的4.8 倍，可能是由于超聲預處理使SPI內部結構打開，暴露更多的疏水基團與兒茶素結合，兒茶素引入了大量的氫離子，與DPPH生成DPPH·H，以及ABTS經氧化后生成大量的陽離子自由基，增強了抗氧化能力[4]。pH 3時抗氧化性較差，可能由于pH 3距離SPI等電點較近，復合物部分沉淀未能發揮其抗氧化性能。而在pH值為7、9、12的條件下，可能由于堿性條件下共價結合的兒茶素數量多于非共價結合，因此共價復合物的抗氧化能力更強[4]。

圖8 不同pH值的SPI及SPI-兒茶素復合物的DPPH自由基清除率（A）及ABTS陽離子自由基清除率（B）Fig.8 DPPH radical (A) and ABTS radical cation scavenging rates (B)of SPI and SPI-catechin complexes formed at different pHs

2.9 分子對接分析結果

根據沉積系數，SPI可分為4 個成分：2S、7S、11S、15S蛋白，其中7S和11S蛋白是SPI的主要成分最多，共占SPI的70%左右[37]。兒茶素的氧化產物是茶黃素（圖9），因此通過這兩個蛋白和兒茶素與茶黃素模擬分子對接考察氫鍵及疏水作用對于溶液體系的影響。如圖10所示兒茶素主要通過氫鍵與7S蛋白的Gly88、Gln354、Gln77、Met353與Glu358相互作用。兒茶素主要通過氫鍵與11S蛋白的Glu172、Gly202與Pro160相互作用。茶黃素主要通過氫鍵與7S蛋白的Gln104、Phe145、Ser144與Asn350相互作用，茶黃素主要通過氫鍵與11S蛋白的Gly207、Val162與Glu200相互作用。蛋白質分子中的幾個疏水氨基酸殘基為蛋白質-兒茶素復合物提供了重要的疏水相互作用，而疏水相互作用在蛋白質-兒茶素復合物的形成中起著關鍵作用[38]。通過對表2中各氨基酸的疏水參數計算比較發現，非共價復合物的總疏水性較共價復合物更強，說明在非共價復合體系中形成氫鍵以及疏水作用的能力更強，促進了復合物親水能力，可以通過提高蛋白溶解度來增強其他理化性質及生物活性，進一步驗證了非共價復合物的主要作用力為氫鍵和疏水相互作用。

表2 各氨基酸的分類、疏水參數以及復合物疏水性Table 2 Hydrophobic parameters of complexes and their abilities to form hydrogen bonds with water

圖9 兒茶素（A）與茶黃素（B）的三維立體結構Fig.9 Three-dimensional structures of catechin (A) and theaflavin (B)

圖10 蛋白質-兒茶素分子對接Fig.10 Molecular docking of protein with polyphenols

3 結 論

本實驗探究了蛋白超聲預處理下pH值對SPI-兒茶素非共價/共價復合物結構和功能的影響，在超聲時間為5 min，功率為500 W的優化條件下，SPI與兒茶素通過非共價/共價結合得到復合物。通過傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜和SDS-PAGE結果發現，SPI經超聲預處理后在pH 12的條件下與兒茶素的相互作用最強，SPI的α-螺旋和β-折疊含量顯著降低，β-轉角和無規卷曲含量顯著增加，同時二者交聯形成了高分子質量的共價聚合物。另外，SPI經超聲處理后，在pH 12下，SPI-兒茶素復合物的起泡性、泡沫穩定性、抗氧化能力明顯強于pH 3、7、9下的復合物。分子對接結果表明非共價結合比共價結合更容易生成氫鍵和疏水相互作用。以上實驗結果可為蛋白質-兒茶素復合物在功能性食品成分和蛋白超聲改性領域的應用提供理論指導。