超高壓和巴氏殺菌對蛋清蛋白結構及起泡性能的影響

張根生，劉欣慈，岳曉霞，丁一丹，趙陳美慧，勾鳳琦，呂云雄,2,*

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.彌勒市朋普鎮人民政府，云南 彌勒 652300）

超高壓殺菌（ultra high pressure sterilization，UHPS）屬于非熱殺菌技術，通常采用水作為傳壓介質，在100～1 000 MPa的高壓下對密封食品進行處理[1]，通過破壞細胞膜和細胞壁[2]、干擾蛋白質穩態[3]、影響酶活性[4-5]、影響遺傳機制[6]和細胞形態[7]來殺滅食品中的有害微生物，具有對食品品質的關鍵成分破壞性較小[8]、不改變共價鍵等優點[9]。

蛋清含有88%（質量分數，下同）的水、11%的蛋白質、0.2%的脂肪和0.8%的灰分，其蛋白質組分是多種蛋白質組分的復合混合物，包括卵白蛋白（54%）、卵轉鐵蛋白（12%～13.6%）、卵類黏蛋白（11%）、卵黏蛋白（3.5%）、溶菌酶（3.4%～3.5%）和其他100多種蛋白質組分，它們都在決定蛋清的功能特性方面發揮重要的作用[10]。目前已有大量的研究證實了UHPS技術對蛋清等蛋制品有殺菌效果。楊瑞香[11]對蛋清UHPS條件及效果進行了研究，發現在高染菌情況下（大腸桿菌總數不低于107CFU/mL），300 MPa、7.5 min高壓處理可將大腸桿菌總數降低至符合GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》要求（大腸桿菌總數不高于102CFU/mL）。Tóth等[12]以蛋清為原料，研究了200～350 MPa壓力下微生物數量和蛋白質變性情況，發現此條件下微生物數量被控制在104CFU/mL以下，同時差示掃描量熱法分析結果表明處理后的蛋清蛋白未變性。然而不同學者針對超高壓對蛋白質的影響所得結論不同，Andrassy等[13]報道稱250～400 MPa的壓力會導致蛋清蛋白凝聚變性；Yamamoto[14]也發現300 MPa的壓力會導致蛋白質凝聚變性。而Frydenberg等[15]報道稱變性后的蛋白質經稀釋可能會促進未折疊蛋白質重新折疊成天然狀態。目前，在有效的UHPS條件下，蛋清蛋白質是否會變性尚未有統一的結論，國內對UHPS處理后蛋清蛋白質結構變化方面的研究也較少。

基于上述研究現狀，本實驗以市售鮮蛋制備得到的蛋清為原料，經超高壓和巴氏殺菌處理，室溫靜置48 h（殺菌后靜置24 h，磷酸鹽緩沖溶液或蒸餾水稀釋后再靜置24 h），通過圓二色光譜、紫外光譜、熒光光譜和動態光散射激光粒度儀等進行表征，研究不同壓力（200～300 MPa）和保壓時間（2.5～12.5 min）下，超高壓和巴氏殺菌對蛋清蛋白的構象、粒徑、表面電位、起泡特性的影響；同時基于楊瑞香[11]的研究結果（300 MPa保壓7.5 min），比較不同殺菌方法對蛋清蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮蛋 哈爾濱市北京華聯超市；無菌袋 常州優坦生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純） 天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ALPHA2-4 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；Chirascan圓二色光譜儀 英國應用光物理公司；Nano-ZS-90激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；F-7000熒光光譜儀 日立儀器（上海）有限公司；Spectrum Two傅里葉變換近紅外光譜儀、LAMBDA 365紫外光譜儀美國珀金埃爾默股份有限公司；HHP-L2-600-L超高壓食品處理機 上海詩斯自動化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清的制備

鮮蛋洗凈，打蛋去殼取蛋清，挑除蛋清中殘留系帶，使用攪拌器攪打均勻，裝入無菌袋（100 mL/袋），封口待用。

1.3.2 樣品的制備

將蛋清放入60 ℃水浴箱中處理3.5 min[16]，得到巴氏殺菌蛋清。使用超高壓食品處理機，將蛋清分別在200、250 MPa和300 MPa壓力下保壓2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 min，得到UHPS蛋清。分別取50 mL巴氏殺菌蛋清、鮮蛋清、UHPS蛋清于室溫靜置24 h，-80 ℃預凍48 h后冷凍干燥得到蛋清凍干粉備用。

1.3.3 圓二色光譜測定

參照Ding Lixian等[17]的方法并作適當修改進行圓二色光譜測定。用磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2、10 mmol/L）將蛋清凍干粉配制成0.2 mg/mL蛋清溶液，靜置24 h后使用具有0.1 cm光程的石英比色皿，光譜分辨率為0.5 nm，掃描速率為100 nm/min，響應時間為0.25 s，帶寬為1 nm，在25 ℃下分析190～250 nm波長范圍的圓二色光譜信號。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜分析

參考曾劍華等[18]的方法，將1 mg蛋清凍干粉與溴化鉀粉末混合磨粉并壓制成片，進行傅里葉變換紅外光譜全波段掃描，設定參數為掃描次數32 次，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。采用Peakfit軟件對蛋白酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）進行二階導數、去卷積和高斯曲線擬合，根據峰面積計算二級結構相對含量。

1.3.5 紫外光譜測定

參照汪吳晶等[19]的方法并作適當修改進行紫外光譜測定。用磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2、10 mmol/L）將蛋清凍干粉配制成0.1 mg/mL蛋白溶液，靜置24 h后使用光程為1 cm的石英比色皿在25 ℃進行波長范圍為240～400 nm的紫外光譜掃描。

1.3.6 熒光光譜測定

用磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2、10 mmol/L）將蛋清凍干粉配制成0.2 mg/mL蛋白溶液，靜置24 h后使用光程為1 cm的石英比色皿進行掃描。掃描條件：激發波長為290 nm，發射波長范圍為300～460 nm。激發和發射狹縫寬度為2.5 nm，掃描速率為1 200 nm/min。

1.3.7 蛋清粒徑和多分散系數的測定

用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2、10 mmol/L）將蛋清凍干粉配制成1 mg/mL蛋白溶液，靜置24 h后12 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm水系醋酸纖維素濾膜。通過Nano-ZS-90激光粒度儀測定蛋清粒徑和多分散系數（polydispersity index，PdI），測定溫度為25 ℃、平衡時間為120 s、分散相折射率為1.471、分散劑折射率為1.330。

1.3.8 蛋清表面電位測定

用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2、10 mmol/L）將蛋清凍干粉配制成1 mg/mL蛋白溶液，靜置24 h后通過Nano-ZS-90激光粒度儀測定蛋清表面電位，測定條件：溫度25 ℃、平衡時間120 s、分散相折射率1.471和分散劑折射率1.330。

1.3.9 蛋清起泡性和泡沫穩定性測定

用蒸餾水配制100 mL質量濃度為5 mg/mL的蛋清液，用攪拌器以2 500 r/min的轉速攪打1 min，記錄攪打結束時和結束10 min后泡沫體積，按式（1）和式（2）分別計算起泡性和泡沫穩定性。

式中：V為蛋清液體積/mL；V0為攪打結束時泡沫體積/mL；V1為攪打結束10 min后泡沫體積/mL。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS和Origin 2018軟件分別對數據進行處理、繪圖。顯著性分析采用Duncan’s法，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 UHPS對蛋清二級結構的影響

UHPS和巴氏殺菌處理得到的蛋清蛋白，其圓二色光譜變化如圖1所示，加壓處理后蛋清蛋白的二級結構明顯發生改變，且隨著壓力的增加而增加。圓二色光譜在208 nm和222 nm區域顯示出的負峰是α-螺旋蛋白的特征峰[20]，這些區域譜線的振幅均有較大幅度的增加，即α-螺旋圓二色性信號強度增加。表明UHPS處理后α-螺旋的比例有所增加，這與Zhang Zhong等[21]的研究結果一致。就保壓時間對蛋清蛋白結構影響而言，圓二色光譜信號強度隨保壓時間的延長變化較小，表明二級結構的改變受保壓時間影響較小。與之相比，巴氏殺菌的圓二色性信號強度與未處理蛋清更接近，表明巴氏殺菌可能對蛋清蛋白的影響更小。

圖1 殺菌處理對蛋清圓二色光譜的影響Fig.1 Effect of sterilization treatment on CD spectrum of egg white protein

表2 250 MPa對蛋清二級結構含量的影響Table 2 Effect of UHP sterilization at 250 MPa on secondary structure contents of egg white protein

表3 300 MPa對蛋清二級結構含量的影響Table 3 Effect of UHP sterilization at 300 MPa on secondary structure contents of egg white protein

如表1～3所示，蛋清蛋白二級結構中α-螺旋和無規卷曲相對含量隨壓力增加和保壓時間的延長而明顯增加，這與圓二色光譜的結果一致。在二級結構中，α-螺旋肽段主鏈上每個氨基酸殘基的N—H基團與順序螺旋結構第4個氨基酸殘基上的C＝O基團形成氫鍵，代表的是一種有序結構[22]。通常來說，UHHP會破壞氫鍵，而壓力處理卻增加了這種有序結構的數量，Zhang Zhong等[21]也報道了壓力會誘導α-螺旋含量增加的結論，但未就此作出相關闡述，該原因有待進一步研究論證。無規卷曲相對含量的增加表明UHPS處理后形成了更松散的二級結構[23]。壓力的增加和保壓時間的延長也明顯降低了β-折疊和β-轉角相對含量，He Xiaoye等[24]的研究也發現高壓會降低β-折疊含量。與巴氏殺菌相比，UHHP處理對蛋清蛋白各種二級結構相對含量的影響更大，這也與圓二色光譜的結果一致。

表1 200 MPa對蛋清二級結構相對含量的影響Table 1 Effect of UHP sterilization at 200 MPa on secondary structure contents of egg white protein

綜上，UHHP處理對蛋清蛋白二級結構造成了不可逆的破壞（這種破壞在靜置48 h后仍能被檢測到），并且與巴氏殺菌相比，這種破壞程度更劇烈。

2.2 UHPS對蛋清三級結構的影響

如圖2所示，通過熒光光譜可以看出蛋清蛋白質三級結構易受壓力和熱（巴氏殺菌）處理影響。在同一壓力下，隨著保壓時間的延長，熒光強度先增加后降低，在200 MPa和250 MPa保壓12.5 min，300 MPa保壓10 min和12.5 min時熒光強度明顯降低，這可能是壓力誘導基團過度暴露，發生熒光猝滅所致[25]。已有研究證明賴氨酸、組氨酸和半胱氨酸殘基具有猝滅色氨酸殘基熒光的能力，UHPS處理可以使這些殘基更接近色氨酸殘基[26]，Chen Gang等[27]也認為蛋白質熒光強度的變化與氨基酸殘基在色氨酸周圍的運動有關。較高壓力誘導蛋白質聚集，將熒光基團重新包埋，并且在同一時間下壓力越大，結構破壞程度越嚴重。這與圓二色光譜和傅里葉變換紅外光譜觀察到的短時變性結果不同，可能是因為二級結構的壓敏性更強。楊瑞香[11]的研究結果表明在300 MPa、7.5 min時，可將高染菌（大腸桿菌總數不低于107CFU/mL）蛋清中的微生物殺滅至符合GB 4789.3—2016要求。與巴氏殺菌蛋清相比，300 MPa保壓7.5 min的蛋清蛋白熒光強度接近未處理蛋清，對三級結構造成的破壞程度較巴氏殺菌更低?？偟膩碚f，熒光光譜表明UHPS處理對蛋清蛋白的三級結構造成了破壞，與巴氏殺菌相比，300 MPa保壓7.5 min的影響較小。

圖2 殺菌處理對蛋清熒光光譜的影響Fig.2 Effect of sterilization treatment on fluorescence spectrum of egg white protein

在250～265 nm范圍內的吸收峰對應苯丙氨酸殘基，在265～280 nm范圍內的吸收峰對應酪氨酸-色氨酸電子相互作用，在285 nm以上的吸收峰被認為是由色氨酸引起[28]。如圖3所示，在200 MPa下紫外吸收強度隨保壓時間延長而增加，在250～300 nm處的吸收峰強度逐漸增大，表明隨著200 MPa保壓時間的延長，酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基暴露量不斷增加。250 MPa處理下紫外吸收峰強度隨保壓時間延長呈先明顯增加后趨于平緩的趨勢，這可能是由于在處理10 min和12.5 min時，3 種氨基酸殘基已充分暴露，吸收峰不隨時間延長而擴大。而300 MPa下，吸收峰之所以在12.5 min呈現出了降低的趨勢，可能是因為長時高壓誘導蛋白質形成聚集體，將已暴露的基團重新包埋，導致吸收峰強度降低。通過紫外光譜分析發現，壓力的增加和保壓時間的延長，導致蛋白三級結構變性，這與圖2熒光光譜的分析結果一致。與巴氏殺菌相比，300 MPa保壓7.5 min后，蛋白紫外吸收度和未處理蛋清更接近，即該壓力下對蛋清影響更小。值得注意的是，巴氏殺菌對三級結構造成的結構破壞在紫外光譜中的變化并不明顯，這表明熱誘導變性后吸光度變化小，而熒光性變化大，即熱誘導和壓力誘導的變性機制不同。綜上所述，UHPS處理對蛋清蛋白三級結構造成了破壞，與巴氏殺菌相比，300 MPa保壓7.5 min的影響更小。

圖3 殺菌處理對蛋清紫外光譜的影響Fig.3 Effect of sterilization treatment on UV spectrum of egg white protein

2.3 UHPS對蛋清粒徑的影響

粒徑反映溶液體系小顆粒物質的平均大小，PdI反映粒度的分布情況，PdI越小，小顆粒物質分布越均勻。如圖4所示，未處理的蛋清平均粒徑為225.5 nm，PdI為0.642。粒徑隨保壓時間的延長呈先增加后下降的趨勢。在UHPS處理后，小分子聚集形成蛋白質聚集體[29]，所以粒徑隨保壓時間延長和壓力增加而增大。然而在時間超過7.5 min后，3 種壓力條件下的蛋清粒徑突然降低，這可能是由于壓力誘導聚集體不斷增大，泄壓時壓力瞬間釋放導致粒徑較大的聚集體被破壞、蛋白質顆粒被粉碎，從而減小了粒徑。Wang Chunyan等[30]也發現了相似的現象，即壓力增大，使蛋白鏈被破壞，蛋白質粒徑隨壓力增加而降低。也正是因為這一原因，隨著壓力增加，較大的聚集體被破壞，產生了小顆粒物質均勻分布的現象，使PdI逐漸降低，與巴氏殺菌對比可以看出，300 MPa、7.5 min條件下，UHPS對蛋清粒徑的影響和巴氏殺菌處理近似，但UHPS處理后的PdI更低，小分子物質粒徑更均勻。

圖4 殺菌處理對蛋清粒徑的影響Fig.4 Effect of sterilization treatment on particle size of egg white protein

2.4 UHPS對蛋清表面電位的影響

蛋白質由于表面基團的電離而帶有表面電荷，這些電荷表現為蛋白分子的表面電位，表面電位的差異反映了帶電基團暴露水平的不同[31]。如圖5所示，200 MPa和250 MPa下隨時間延長，表面電位逐漸增加，這是由于長時高壓導致蛋白質展開，暴露出帶電基團，從而增強分子間的靜電排斥力，破壞現有的蛋白質聚集體，抑制進一步的聚集，電位增加的趨勢表明靜電排斥力增強，蛋清的物理穩定性更好[32]。然而在300 MPa下，隨時間延長表面電位出現了先增加后降低的情況，可能是由于較高壓力和較長保壓時間下，蛋白質形成聚集體，將已暴露出的基團重新包埋，進而降低了電位[24]。這與圖4平均粒徑變化結果一致。與巴氏殺菌和未處理蛋清對比可以看出，300 MPa、7.5 min處理后的蛋清表面電位更高，體系更穩定，更有利于后期蛋清貯藏。

圖5 殺菌處理對蛋清表面電位的影響Fig.5 Effect of sterilization treatment on zeta potential of egg white protein

2.5 UHPS對蛋清起泡性和泡沫穩定性的影響

起泡性主要與蛋白質在空氣-水界面形成膜的能力有關。因此起泡性和泡沫穩定性由靜電和疏水相互作用以及二硫鍵穩定性決定[33]。圓二色光譜、傅里葉變換紅外光譜、紫外光譜和熒光光譜已經證實了壓力會破壞蛋白質二、三級結構，導致蛋白質分子更適合吸附空氣-水界面的氣泡。如圖6所示，未處理的蛋清起泡性為107%，泡沫穩定性為68%。經200 MPa處理后，蛋清起泡性和泡沫穩定性隨時間延長而增加；在250 MPa下，起泡性和泡沫穩定性先逐漸增加，而保壓10 min后由于小分子物質大量聚集體，變化趨于平緩；300 MPa處理下，7.5 min前，隨時間延長而起泡性和泡沫穩定性增加，小分子物質大量聚集將疏水基團重新包埋，降低了蛋白分子的表面疏水性及在水相-氣相界面的穩定趨勢，不利于氣泡生成和保持，所以起泡性和泡沫穩定性呈下降趨勢。和未處理的蛋清相比，巴氏殺菌后起泡性降低、泡沫穩定性增強，與Gharbi等[34]的研究結果一致。可能是由于熱誘導和壓力誘導的蛋白變性機制不同，巴氏殺菌破壞了蛋白質的主要結構（以共價鍵連接的氨基酸序列）[35]，蛋白質變性凝結、溶解度降低，導致起泡性降低，同時巴氏殺菌促進了疏水基團的暴露，所以其泡沫穩定性得以提升。與之相比，300 MPa、7.5 min處理起泡性得以提升，泡沫穩定性接近。這一壓力條件對于起泡性和泡沫穩定性的提升效果優于巴氏殺菌。

圖6 殺菌處理對蛋清起泡性和泡沫穩定性的影響Fig.6 Effect of sterilization treatment on foaming capacity and foam stability of egg white protein

3 結 論

本實驗結果表明，超高壓和巴氏殺菌均對蛋清蛋白的二級、三級結構造成了不可逆的破壞。隨著壓力的增加，α-螺旋和無規卷曲相對含量增大，β-折疊和β-轉角相對含量降低；超高壓處理后熒光強度低于鮮蛋，且熒光強度隨壓力的增加和保壓時間的延長，先增加后降低；高壓處理促使酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基暴露，但隨著保壓時間的延長，暴露的氨基酸殘基又會被重新包埋。300 MPa保壓7.5 min對二級結構的影響較巴氏殺菌更大，對三級結構的影響較巴氏殺菌更??；壓力會誘導蛋清聚集，200 MPa和250 MPa下，隨著壓力的增加和保壓時間的延長，蛋清粒徑先增大后減小，且分布均勻，起泡性及泡沫穩定性逐漸增大，300 MPa保壓7.5 min的粒徑與巴氏殺菌接近，體系更均勻，表面電位更高，更有利于貯存；隨著壓力的增加和保壓時間的延長，300 MPa保壓7.5 min的起泡性能較巴氏殺菌更好。