1-甲基環丙烯處理對采后紫背天葵抗氧化系統的影響

張 飛，石 潔，謝意通，姜 麗*

（南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

紫背天葵（Gynura bicolorDC.），也稱紅鳳菜、觀音菜、血皮菜等，富含花青素、類黃酮、維生素、氨基酸和多種微量元素等物質[1]，具有抗氧化、抗炎癥、抗癌癥[2-3]等活性。紫背天葵是一種集營養保健價值和特殊風味為一體的高檔蔬菜，多用于鮮食[4]。但是采后紫背天葵容易出現感官品質和營養價值下降的問題，因此適當的采后保鮮技術對紫背天葵而言非常重要。

目前國內外應用到采后紫背天葵的保鮮方法主要有應用氣調[4]、植酸[5]、1-甲基環丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）[6]、一氧化氮[7]和短波紫外線[8]等處理。1-MCP是一種無毒、無明顯氣味、穩定性好且作用濃度低的保鮮劑，在蔬菜和水果的保鮮中運用廣泛，研究顯示1-MCP處理對桃果實[9]、小青菜[10]、白菜[11]、羽衣甘藍[12]等具有顯著的保鮮效果。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是植物新陳代謝的重要產物，包括超氧陰離子、過氧化氫（H2O2）、單線態氧、羥自由基等[13]。正常環境下，植物細胞中ROS含量較低并維持著動態平衡；當植物衰老或受到脅迫時，ROS會大量積累并對生物分子如蛋白質、脂質等造成氧化損傷[14]。植物的抗氧化系統是維持ROS穩態水平的關鍵，主要分為兩類，一類是非酶類抗氧化物質，包括多酚、花青素、生育酚、抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）等；另一類是抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（superoxidase，SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）和過氧化物酶（peroxidase，POD）等[15]。姜麗[4]研究發現1-MCP處理能顯著抑制冷藏期間紫背天葵的腐爛，延緩了花青素、葉綠素和總酚等物質含量的下降，并且能夠提高抗氧化酶的活性；另外，Jiang Li等[6]結合蛋白組學技術發現1-MCP處理能夠提高SOD和POD的蛋白質豐度；Xu Xin等[16]進一步對Cu/Zn SOD基因進行克隆分析，發現1-MCP能顯著提高Cu/Zn SOD基因的相對表達量。但是1-MCP對于紫背天葵抗氧化系統的影響并非只在酶活力水平或單個酶的蛋白質和基因表達水平的調控，目前1-MCP對于抗氧化系統的影響還缺乏一個系統和完善的認知，同時1-MCP對抗氧化酶在轉錄水平的調控還不清楚。本實驗旨在同時從抗氧化物質、抗氧化酶活性及其基因表達并結合兩者相關性分析的角度來揭示1-MCP對采后紫背天葵的抗氧化系統的調控機理，為后續進一步研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫背天葵采自蘇州潤匯農業有限公司，無機械損傷和病蟲害。

DL 2000 DNA Marker (3427A)、RNA prep Pure Plant Kit (RR9769)、PrimeScript? RT Master Mix (RR047A)、SYBR?Premix Ex Taq? (RR420A)試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；1-MCP粉末（純度4.3%） 咸陽西秦生物科技有限公司；羥胺、過氧化氫 國藥集團化學試劑有限公司；對氨基苯磺酸、α-萘胺、愈創木酚、核黃素、氮藍四唑 北京索萊寶科技有限公司；氧化型谷胱甘肽（oxidizedg lutathione，GSSG）；還原型輔酶II、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮 上海瑞永生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CheckMate 3頂空分析儀 丹麥PBI Dansensor公司；NanoDrop 2000微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；ABI Quantstudio 5實時熒光定量分析儀、ABI 2720型熱循環儀 美國Applied Biosystems公司；DYY-10C電泳儀 北京市六一儀器廠；Alpha-1860A紫外-可見分光光度計 上海譜元有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；TGL16M臺式高速冷凍離心機 長沙維爾康湘鷹離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將紫背天葵隨機分為兩組，將1.5 kg紫背天葵正向朝上整齊立在泡沫箱（55 L）底部，1-MCP處理組使用10 μL/L 1-MCP于（20±2）℃條件下密閉熏蒸6 h，具體操作為：稱取28.5 mg 1-MCP粉末（純度4.3%）于離心管中，加入30 mL蒸餾水后迅速放入泡沫箱中（置于紫背天葵上方）進行密閉熏蒸。對照組用同體積的蒸餾水作相同處理。每組處理設置3 個平行。熏蒸完畢后分裝于食品保鮮袋（每袋500 g），在（20±2）℃、相對濕度80%～90%條件下貯藏7 d。分別于0、1、3、5、7 d取樣并測定指標，每次隨機抽取3 袋，取實驗材料葉片的葉尖至1/3葉脈較少處，切碎并混合均勻，用液氮速凍處理后置于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 感官品質評分

參考李雙芳等[17]方法略加修改對紫背天葵感官品質進行評定。從外觀、質地、形態和紫背天葵特有的氣味4 個方面進行綜合評定，每項滿分25 分，合計100 分，具體評分標準見表1。結果基于10 名評定員的感官評分計算平均值得出。

表1 紫背天葵感官品質評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of G.bicolor

1.3.3 呼吸強度測定

將300 g的紫背天葵樣品放入玻璃密封罐，室溫放置2 h后使用O2/CO2氣體分析儀測定呼吸強度。單位為mg CO2/（kg·h）（本實驗結果均以鮮質量計）。

1.3.4 超氧陰離子生成速率和H2O2含量測定

超氧陰離子生成速率、H2O2含量測定參照文獻[9]，單位分別為nmol/（min·g）和mmol/g。

1.3.5 AsA和GSH含量測定

AsA含量和GSH含量測定參照文獻[10]，單位均為mg/kg。

1.3.6 抗氧化酶活力測定

準確稱量0.5 g樣品，加入5 mL 50 mmol/L、pH 7.8的磷酸緩沖液（含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸和質量分數2%聚乙烯吡咯烷酮，后同）并勻漿，低溫振蕩提取10 min，于4 ℃條件下10 000×g離心20 min，上清液用于SOD和GR活力測定。APX和CAT粗酶液的提取使用5 mL 50 mmol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液，POD粗酶液的提取使用5 mL 50 mmol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液，緩沖溶液均包含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸和2% PVP，且其他提取步驟同SOD和GR活力測定。SOD、CAT和POD活力測定均參照文獻[4]；APX和GR活力測定參照Fukuoka等[18]方法。SOD活力以體系每分鐘抑制氮藍四唑光化還原的50%所需要的酶量為一個酶活力單位（U），單位為U/g。分別定義每分鐘A240nm、A290nm、A340nm、A460nm變化0.01為CAT、APX、GR、POD的一個酶活力單位（U），單位均為U/g。

1.3.7 RNA提取、cDNA合成和實時熒光定量聚合酶鏈式反應

參考RNA prep Pure Plant Kit說明書提取RNA。使用微量分光光度計測定RNA濃度，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。使用PrimeScript? RT Master Mix合成cDNA。根據三代加二代全長轉錄組學測序結果獲得的基因序列，使用Oligo 7.0和Primer premier 5軟件設計特異性引物（表2），并按照SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒說明書配制體系并進行實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應，運行程序為：94 ℃、30 s；95 ℃、5 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30s，40 個循環。以Actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表2 內參基因和目的基因的引物序列Table 2 Primer sequences used for reference and target gene amplification

1.4 數據處理和分析

實驗結果以平均值±標準差表示，采用Excel 2019和SPSS 19.0軟件對實驗數據進行統計分析和相關性分析，采用Duncan多重比較法檢驗數據的差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 18.0軟件和Visio 2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 1-MCP對紫背天葵感官品質的影響

感官評價是紫背天葵品質指標中最直觀的項目，在貯藏第1天，兩組紫背天葵間無顯著差異，新鮮度很高，葉片平整飽滿，色澤鮮艷有光澤感，帶有特殊香味。貯藏1 d后，紫背天葵的感官品質均迅速下降，葉片出現褐變、卷曲甚至黃化腐爛等現象，但1-MCP處理顯著延緩了紫背天葵感官品質的下降（P＜0.05）（圖1）。

圖1 1-MCP對紫背天葵感官品質的影響Fig.1 Effect of 1-MCP treatment on the sensory quality of G.bicolor

2.2 1-MCP處理對紫背天葵呼吸強度的影響

紫背天葵的呼吸強度在貯藏第1天迅速下降，之后隨貯藏時間的延長緩慢下降（圖2），1-MCP處理組的呼吸強度在第1天后一直顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖2 采后1-MCP處理對紫背天葵呼吸強度的影響Fig.2 Effect of 1-MCP treatment on the respiration intensity of G.bicolor

2.3 1-MCP處理對紫背天葵超氧陰離子生成速率和H2O2含量的影響

紫背天葵的超氧陰離子生成速率隨貯藏時間的延長逐漸增加（圖3A）。對照組的H2O2含量呈持續上升的趨勢，而1-MCP處理組的H2O2含量在第1天迅速達到峰值后開始下降直到貯藏期結束（圖3B）。與對照組相比，1-MCP處理顯著提高了第1天的超氧陰離子生成速率和H2O2含量，在第3天后反而顯著降低了超氧陰離子生成速率和H2O2的積累（P＜0.05）。本實驗說明1-MCP提高了貯藏前期的ROS水平，造成了氧化應激，但降低了后期ROS的積累，從而減少ROS對細胞的氧化損傷。

圖3 采后1-MCP處理對紫背天葵葉片超氧陰離子生成速率（A）和H2O2含量（B）的影響Fig.3 Effect of 1-MCP treatment on superoxide anion production rate (A) and H2O2 content (B) in G.bicolor leaves

2.4 1-MCP處理對紫背天葵AsA和GSH含量的影響

對照組紫背天葵的AsA含量隨貯藏時間的延長逐漸下降，1-MCP處理組在第1天AsA含量迅速下降隨后上升（圖4A）。除第1天外，1-MCP處理AsA含量始終高于對照組。紫背天葵的GSH含量在貯藏期間先上升后緩慢下降（圖4B），1-MCP處理組和對照組分別在第3天和第5天達到峰值，1-MCP處理顯著提高了前3 d的GSH含量（P＜0.05）。本實驗說明1-MCP能夠較好地保持AsA和GSH含量，有利于維持紫背天葵的高還原能力和抗氧化能力。

圖4 采后1-MCP處理對紫背天葵葉片AsA（A）、GSH含量（B）的影響Fig.4 Effect of 1-MCP treatment on the contents of ascorbic acid (A)and glutathione (B) in G.bicolor leaves

2.5 1-MCP處理對紫背天葵SOD活力及其基因表達的影響

紫背天葵的SOD活力在第1天迅速上升并達到最大值，隨后下降直到貯藏期結束，與對照組相比，1-MCP處理顯著抑制了第3天后的SOD活力的下降（P＜0.05）（圖5A）。與SOD活力不同，1-MCP處理提高了紫背天葵貯藏前期GbSOD的表達水平，而在后期顯著下調了該基因的表達水平（P＜0.05）（圖5B）。本實驗證明，1-MCP處理提高了紫背天葵的SOD活力和貯藏前期的GbSOD的相對表達量，有利于ROS的清除并維持其動態平衡。

圖5 采后1-MCP處理對紫背天葵葉片SOD活力（A）和GbSOD相對表達量（B）的影響Fig.5 Effect of 1-MCP treatment on SOD activity (A) and the relative expression of GbSOD (B) in G.bicolor leaves

2.6 1-MCP處理對紫背天葵APX和CAT活力及其基因表達的影響

貯藏期間紫背天葵APX和CAT活力及其基因相對表達量變化趨勢如圖6所示，1-MCP處理組的APX活力（圖6A）和GbAPX1相對表達量（圖6C）在貯藏期間總體呈先上升后下降的趨勢，而對照組呈波動下降的趨勢。APX活力和GbAPX1相對表達量顯著相關（r＝0.75，P＜0.05）。與對照組相比，1-MCP處理顯著提高了貯藏前期的APX活力和GbAPX表達量（P＜0.05），分別在第1天和第3天提高了54.7%和66.4%的APX活力以及43.5%和98.11%的GbAPX1相對表達量，但在貯藏后期對兩者均無顯著影響。

紫背天葵的CAT活力（圖6B）和GbCAT相對表達量（圖6D）顯著相關（r＝0.82，P＜0.05），在貯藏期間均先上升后下降，并在第3天達到峰值。在貯藏期間，1-MCP組的CAT活力和GbCAT相對表達量高于對照組，但在第3天后差異才達到顯著水平（P＜0.05）。本實驗證明，1-MCP處理通過提高紫背天葵的GbAPX1和GbCAT的相對表達量，從而分別在貯藏前期和后期提高了APX和CAT的活力，維持了較高的抗氧化活性。

圖6 采后1-MCP處理對紫背天葵葉片APX（A）和CAT（B）活力、GbAPX1（C）和GbCAT（D）相對表達量的影響Fig.6 Effect of 1-MCP treatment on the activity of APX (A) and CAT (B), and the relative expression of GbAPX1 (C) and GbCAT (D) in G.bicolor leaves

2.7 1-MCP處理對紫背天葵GR活力及其基因表達的影響

對照組紫背天葵的GR活力在貯藏期間持續下降，而1-MCP組的持續上升直到第3天達到峰值后才下降（圖7A）。紫背天葵的GbGR相對表達量與GR活力顯著相關（r＝0.75，P＜0.05）（圖7B）。與對照組相比，1-MCP處理提高了紫背天葵貯藏期間的GR活力和GbGR相對表達量，尤其在第3天處理組的GR活力和GbGR相對表達量均為對照組的2 倍多。本實驗表明，1-MCP處理刺激了紫背天葵葉片的GbGR表達并提高了GR活力，從而提高紫背天葵的抗氧化能力。

圖7 采后1-MCP處理對紫背天葵葉片GR活力（A）和GbGR相對表達量（B）的影響Fig.7 Effect of 1-MCP treatment on GR activity (A) and the relative expression of GbGR (B) in G.bicolor leaves

2.8 1-MCP處理對紫背天葵POD活力及其基因表達的影響

紫背天葵的POD活力在貯藏期間呈先上升后下降的趨勢，與對照組相比，1-MCP處理顯著提高了紫背天葵第1天的POD活力，但在之后反而顯著降低了POD活力（P＜0.05）（圖8A）。此外，1-MCP處理也在第1天顯著上調了紫背天葵葉片的GbPOD42相對表達量（P＜0.05），隨后GbPOD42相對表達量迅速下調，3～7 d 1-MCP處理對其表達影響較小（圖8B）。本實驗證明，1-MCP處理在第1天迅速提高了POD活力和GbPOD42相對表達量，而在后期顯著降低了POD的活力（P＜0.05）。

圖8 采后1-MCP處理對紫背天葵葉片POD活力（A）和GbPOD42相對表達量（B）的影響Fig.8 Effect of 1-MCP treatment on peroxidase activity (A) and the relative expression of GbPOD42 (B) in G.bicolor leaves

3 討 論

在貯藏過程中，紫背天葵會出現褐變暗沉、葉片卷曲、失水萎焉、黃化和腐爛等現象，導致感官品質下降，本實驗中1-MCP能有效抑制紫背天葵感官品質的下降。呼吸強度是果蔬貯藏期間的重要指標。有氧呼吸代謝過程會產生ROS[19]，過高的呼吸強度會加速植物衰老。與1-MCP處理對韭菜[20]和茭白[19]的影響一樣，1-MCP處理能降低紫背天葵的呼吸強度，從而減少營養物質的消耗。低濃度的ROS可以作為信號分子激活植物的防御途徑，過多的ROS積累對細胞有毒性，會加速植物的衰老進程[13]。本實驗中1-MCP處理在前期提高了超氧陰離子的生成速率和H2O2的含量，從而提高了紫背天葵的抗氧化和抗壓能力，但在后期抑制了超氧陰離子和H2O2的積累以防止過高的ROS水平氧化細胞成分和破壞細胞結構，這與1-MCP處理小青菜的研究結果[9]一致。AsA和GSH是植物中的抗氧化劑，通過協同作用清除超氧陰離子和H2O2來保護不穩定的大分子免受攻擊[21]。本研究中1-MCP能保持采后紫背天葵AsA和GSH的含量，這對于清除ROS并維持細胞穩態水平至關重要。

SOD作為植物防御體系的第一條線，能特異性地將超氧陰離子歧化為H2O2和O2。本實驗證明1-MCP能提高SOD酶的活性從而減少超氧陰離子對植物的毒害作用，這與香菜的研究結果[22]一致。1-MCP在貯藏前期提高但在后期下調了GbSOD的相對表達量，這與1-MCP對蘋果的Cu/Zn SOD基因的調控結果[23]一致。植物來源的SOD的表達與其生長發育階段有關，當植物處于逆境脅迫時內源激素與ROS共同調節SOD的表達[24]，本實驗中GbSOD相對表達量與H2O2含量顯著相關（r＝0.83，P＜0.05），說明1-MCP通過提高或降低H2O2含量來調控GbSOD的相對表達量。轉錄水平的上升或下降并不完全代表酶活性的上升或下降，酶活性不僅受轉錄水平調控，還與轉錄后加工、翻譯與翻譯后修飾密切相關[25-26]。硝基化和S-谷胱甘肽化是SOD酶的兩種翻譯后修飾方式，均能不同程度地抑制SOD活性，并且與細胞內ROS水平密切相關。其中，多氧硝酸鹽是硝基化修飾中的硝化劑，由超氧陰離子與一氧化氮反應生成；S-谷胱甘肽化修飾取決于細胞內ROS水平，由氧化和亞硝化應激誘導[27-28]。因此，推測本實驗中1-MCP在貯藏前期通過刺激GbSOD相對表達量提高SOD的合成，而在貯藏后期通過降低ROS水平從而減少SOD硝基化和S-谷胱甘肽化修飾，從而保持高于對照組的SOD活性水平。

APX和CAT負責進一步清除SOD的產物H2O2。1-MCP分別在貯藏前期和后期提高了紫背天葵葉片的APX和CAT活力，這可能是由于兩種酶是不同的H2O2清除酶類別，即APX可能負責精細調節ROS中間體的信號轉導，而CAT可能負責清除過量的ROS[29]。另外1-MCP對兩種酶活性的提高可能是因為刺激并上調了GbAPX和GbCAT的相對表達量。GR是AsA-GSH循環中重要的酶，負責將GSSG轉化為GSH[30]。本研究發現1-MCP可能通過刺激GbGR的表達，提高GR活性，從而合成了更多的GSH，這有助于在各種非生物脅迫下保持GSH/GSSG的高比例。POD能夠分解H2O2為H2O和O2。本研究表明，1-MCP處理能在第1天顯著刺激GbPOD42相對表達量并提高POD活性，這可能是受到了ROS迸發的誘導。但同時POD也能將多酚類物質氧化為醌類物質[31]，醌類物質反向歧化為鄰醌自由基，間接參與ROS的生成[32]。本研究表明，1-MCP處理后期降低了POD的活性，從而直接降低了酚類氧化的風險，同時間接地減少了ROS的積累。1-MCP對采后紫背天葵葉片抗氧化系統的影響如圖9所示。

圖9 1-MCP對采后紫背天葵葉片抗氧化系統影響的簡要模型Fig.9 Simple model for the effect of 1-MCP on the antioxidant system in G.bicolor leaves

綜上，本實驗利用10 μL/L 1-MCP處理紫背天葵，結果發現1-MCP提高了紫背天葵的感官品質，抑制了呼吸強度，減少了超氧陰離子和H2O2的積累，保持了AsA和GSH含量，同時在不同的貯藏時間總體上不同程度地上調抗氧化酶相關基因（GbSOD、GbAPX1、GbCAT、GbGR）的相對表達量并提高了SOD、APX、CAT、GR的活力，從而提高了抗氧化能力，延緩了采后紫背天葵衰老進程。