SMILE來源的角膜基質透鏡研究進展

劉雪珂，李 霞，劉 毅

0引言

自2011年以來，飛秒激光小切口角膜基質透鏡取出術(small incision lenticule extraction,SMILE)得到了廣泛的開展[1]。SMILE是利用飛秒激光精準聚焦定位的立體切割技術，在角膜基質層內進行兩次不同深度的掃描，切割出具有一定大小和厚度的片狀角膜組織，這片被取出的角膜組織即角膜基質透鏡。由于角膜基質透鏡來源于活體，取材方便，近年來一些學者開始探索和利用它們。隨著研究的深入，角膜基質透鏡得到廣泛的應用，本文就角膜基質透鏡的結構特點、保存方法及其在眼科中的應用進行綜述。

1角膜基質透鏡的特點

角膜基質透鏡是角膜基質層中央區的前層組織，由有序排列的膠原纖維構成，其間無血管及淋巴組織，其正常的解剖結構和生理功能對維持角膜透明度及生物具有重要意義。根據預計矯正的屈光度數的不同，角膜基質透鏡中央厚、周邊薄，直徑6.0～6.5mm，厚度60～130μm。Yin等[2]描述了SMILE過程中提取的新鮮角膜基質透鏡組織學和形態學特征，在光學顯微鏡下，角膜基質透鏡橫切面邊緣可見部分毛刺和膠原纖維斷裂，腫脹的角膜基質纖維呈不規則分布。在電子顯微鏡下，可看到用飛秒激光消融的透鏡表面并不完全光滑，前表面稍比后表面光滑，表面可見膠原纖維壞死、溶解，可見使用飛秒激光切割的角膜基質透鏡的表面質量并不是最佳的。Bandeira等[3]發現角膜基質透鏡中神經突密度與其厚度呈負相關，而角膜基質中軸突總長度與厚度的關系不明顯。興奮性鈣反應試驗是評估角膜基質透鏡中神經突的功能，經4℃和液氮保存后興奮性鈣反應明顯減少，這可能是由于冷凍和解凍期間的低溫效應影響神經突的活性，導致細胞內鈣運動停止，因此進一步研究冷凍保存條件(包括冷凍保存介質的類型、冷凍和解凍時間，以及逐步的溫度變化)可能會提供關于保存神經突活性的信息。透射電鏡下可見施萬細胞(Schwann cells,SCs)與神經突關系密切。在SCs和興奮性鈣反應的存在下，這些殘留的神經突可以保留最低的功能，這可能是角膜基質透鏡植入的潛在優勢，可能會影響植入后的神經再支配。

2角膜基質透鏡保存方法

從SMILE術中取出的新鮮角膜基質透鏡最大程度保留了原有的組織和結構，但因受時間、地點的限制，可能不能立即投入使用，我們可以先將其儲存起來，以便以后需要時重新取出。不同的保存方法對角膜基質透鏡的厚度、透明度、機械性能等改變也是不同的，因此無論是將角膜基質透鏡用于基礎實驗還是臨床研究，選擇合理的儲存方式顯得尤為重要。

在SMILE開展之前，一些學者已經對角膜的保存進行研究[4]。Mohamed-Noriega等[5]對保存在Optisol培養基的人體角膜行飛秒激光角膜基質透鏡切除術，將提取的角膜基質透鏡分為新鮮組和冷凍保存組，結果發現兩組均可看到死亡的細胞，但冷凍保存組中有足夠的活性角膜基質細胞，可以在保存1mo后分離和增殖。這種冷凍保存方式除了膠原纖維密度降低外，仍保持了角膜基質細胞的活性和整體膠原結構的完整性。Ganesh等[6]對Mohamed-Noriega等[5]的技術進行了改進，即用人組織培養液代替牛血清白蛋白，這是為了消除人畜共患病傳播和牛血清引起不良反應的風險。

雖然已開發的冷凍保存方法可保存角膜基質透鏡，但因技術復雜和成本較高，限制了應用。早在1954年，Mcnair等[7]首次報道了用95%的甘油在真空下保持角膜脫水狀態。范軍華等[8]對傳統甘油保存方法進行改良，通過電鏡觀察到這種方法保存的角膜結構完整。另外無水氯化鈣法同甘油一樣也屬于干燥脫水法，通過臨床觀察發現在角膜透明度方面，無水氯化鈣法優于甘油保存法[9]，透射電鏡和組織切片可見經無水氯化鈣保存后的角膜組織結構與新鮮的無明顯差異，角膜基質層膠原纖維排列均勻[10]。

為了探究溫度和輔助脫水劑對長期保存在甘油中的人角膜組織的作用，Tripathi等[11]發現與-20℃或4℃相比，甘油保存的人角膜組織在-80℃具有更好的無菌性、厚度、光學透明度、機械強度和超微結構特征，且抗原性小。Romano等[12]將刮除上皮和內皮的角膜基質放入硅膠中，在室溫下保存2wk后復水，結果發現人體角膜基質可在脫水狀態下保存2wk，脫水和復水過程對基質的厚度、透明度和生物力學性能沒有明顯的影響。

Liu等[13]發現保存于磷酸鹽緩沖溶液、DMEM、Optisol GS和100%無水甘油的角膜基質透鏡均能保持其透明度和完整的結構，同時具有較低的免疫原性。Liang等[14]比較了99%無水甘油、變色硅膠和Optisol培養基的保存效果，發現經這三種方法保存后水腫程度和膠原纖維密度隨著時間的推移逐漸惡化，無水甘油中較為明顯。在角膜透明度方面，Optisol組最好，硅膠組次之。在Optisol組中細胞活性和膠原纖維結構的完整性在保存前后保持不變。Xia等[15]進行了類似的研究，兩者[14-15]除保存時間不同外，均發現甘油保存的角膜基質透鏡比其他組有更嚴重的水腫和更低的膠原纖維密度。Shang等[16]研究發現-78℃無水甘油保存不僅可以達到0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)降低抗原的效果，而且可以避免其對正常膠原纖維結構和角膜基質的光學和力學性能的破壞，是獲得高質量移植物較為理想的方法。

甘油是一種無味、無色的黏性液體，具有優異的脫水和抗菌性能，并且可以維持角膜的結構，其用途已得到廣泛證實。硅膠是一種非活性防腐保存技術，通過去除角膜組織中的水分，防止細胞酶失活，抑制組織細胞自溶，從而保持組織細胞的完整性。無水氯化鈣是一種吸水性很強的干燥劑，能迅速吸收角膜中的水分，完整地保存具有一定活性的角膜組織，是眼庫長期保存角膜的方法之一。Optisol是目前國際上最常用的中期保存液，可安全有效保存角膜組織。但Optisol成本高，與Optisol相比，甘油大大降低了成本，而且甘油可以很明顯地降低角膜組織中的細胞密度和抗原性，最大限度地減少免疫排斥反應，加上操作簡單易行，在我國許多基層醫院仍為實用性較強的保存方法。

3角膜基質透鏡的應用

3.1矯正遠視及散光已有報道證實使用SMILE來源的自體或同種異體角膜基質透鏡植入術均可以矯正遠視[17-18]。雖然發現同種異體角膜基質透鏡植入術出現過少數排斥反應，但其手術的可預測性和穩定性優于傳統的準分子激光原位角膜磨鑲術(laserinsitukeratomileusis, LASIK)，為中高度遠視患者提供了一個更安全、有效的手術方式。Liu等[19]第一次對SMILE、LASIK、自體角膜基質透鏡植入術三種遠視矯正方式進行比較評估，發現在低度遠視治療中，角膜基質透鏡植入術在高階像差方面有良好的發展趨勢。

在前期研究的基礎上，Zhang等[20]首次報道了使用SMILE聯合角膜基質透鏡植入術治療遠視合并散光的患者。該手術最關鍵的一步是保證術中中心對齊，術中用核黃素溶液進行等心定位。隨訪1a后所有角膜均保持透明，術中、術后未出現并發癥。凌玲等[21]提出一種角膜基質透鏡散光標記盤，用于透鏡的盛載檢查、標記和定型。該方法可有效矯正散光，部分患者術后仍存在散光，可能與角膜愈合的不確定性及散光軸向的手工定位及標記等因素有關，盡管如此，散光標記器還是為遠視伴散光患者提供了新的、有效的手術方式。

3.2角膜病角膜病是我國的第二大致盲眼病,目前角膜盲最難解決的瓶頸問題是角膜供體嚴重不足。面對日益增長的需求與角膜供體材料短缺之間的矛盾，尋找新的角膜材料來源是目前解決這一問題的重要手段。SMILE來源的角膜基質透鏡在一定條件下可以替代角膜植片，用于一些角膜相關疾病的治療。

3.2.1圓錐角膜Ganesh等[22]首次采用飛秒激光輔助角膜基質透鏡植入聯合加速膠原交聯術(collagen crosslinking,CXL)，研究其在進展性圓錐角膜(keratoconus,KC)和角膜塑形鏡不耐受患者中的扁平化效果、屈光狀態和安全性結果，術后所有患者均未出現排斥反應，裸眼遠視力、矯正遠視力和等效球鏡均改善，角膜厚度均增加，只有1眼角膜曲率未下降，可能因其是晚期KC。Doroodgar等[23]報道了一種治療晚期KC的新方法，即定制角膜基質透鏡植入術，將定制的復合型(項鏈型+120°戒指型)或項鏈形狀的透鏡植入晚期KC，術后6mo最佳矯正視力均提高，角膜總屈光度下降，角膜厚度增加。總之，角膜基質透鏡植入術是矯正KC患者的屈光度、增加角膜厚度、調節角膜曲率的一種可行的治療方案，但是否需要聯合CXL以及術后屈光結果的準確性和可預測性仍然需要進一步研究[24]。

3.2.2角膜穿孔Wu等[25]第一個成功將-80℃保存的角膜基質透鏡用于治療疑難、緊急角膜穿孔患者，該研究認為角膜基質透鏡可能是立即閉合角膜穿孔損傷的最佳選擇。Jiang等[26]也得出同樣結論。由于單個透鏡厚度較薄且韌性有限，不利于術中辨識和操作，幾個透鏡聯合移植操作困難且耗時，疊加對位不準確或比較松散時，有可能導致植片結構不穩定，延遲角膜上皮愈合。姚濤等[27]使用吲哚菁綠染色劑將基質透鏡染色后再置于-40℃保存，并將其用于治療角膜穿孔患者，術中應用纖維蛋白膠黏合多層角膜基質透鏡后，再用10-0尼龍線間斷縫合固定。所有患者術中操作順利，術后發現染色劑可被迅速代謝，對角膜上皮愈合無影響。所有患者均在1wk內完全上皮化，未出現移植物融解等并發癥。聯合應用纖維蛋白膠和吲哚菁綠染色，可方便手術操作，提高手術成功率。王曙亮等[28]的實驗研究中再次證明用纖維蛋白膠構建的角膜基質植片能安全、可靠且有效地修復前部受損角膜，為角膜穿孔的治療提供了新途徑。

3.2.3Mooren潰瘍和翼狀胬肉共存He等[29]報道了第一例使用角膜基質透鏡治療Mooren潰瘍與翼狀胬肉共存的病例。1例61歲女性患者在接受了近3mo的局部免疫抑制和抗感染治療后，眼部癥狀和體征并沒有明顯改善。在保守治療失敗后，使用低溫保存的SMILE來源的角膜基質透鏡行板層角移，并行翼狀胬肉切除聯合自體結膜移植術。該手術是為了維持角膜結構、防止疾病進展。手術的成功表明，如果保守治療失敗，聯合手術可能是治療Mooren潰瘍和翼狀胬肉共存的有效方法。

3.2.4角膜皮樣瘤李世洋等[30]采用SMILE術獲得的角膜基質透鏡作為板層角膜移植材料，并聯合羊膜移植治療角膜皮樣瘤，取得滿意效果。在前人的基礎上，蘇紅等[31]進一步嘗試在不使用羊膜移植的情況下，也取得了滿意的效果。為了美觀，Jacob等[32]切除病變組織后，用染料在預定的角膜緣染色，再使用纖維蛋白膠黏貼角膜基質透鏡和結膜，術后患者對外觀和屈光效果均較滿意。角膜染色被認為是一種安全有效的技術，但也報道過各種并發癥，如嚴重的毒性反應、角膜融化、肉芽腫性角膜炎、持續性上皮缺損等。Pant等[33]使用10-0尼龍縫線替代纖維蛋白膠最大限度地降低了移植物復發、角膜上皮糜爛和肉芽腫性角膜炎等風險，這些在使用纖維蛋白膠時常見。Wan等[34]也使用10-0尼龍縫線間斷縫合角膜基質透鏡，盡管這會增加手術時間，導致不規則散光，但它比纖維蛋白膠更加固定，隨訪期間所有患者的視力和散光均有改善的趨勢。

3.2.5準分子激光角膜原位磨鑲術后角膜擴張已有研究表明角膜基質透鏡用于治療LASIK術后角膜擴張癥是一種安全有效的手術方法。Li等[35]第一個從細胞水平表征LASIK術后角膜擴張的同種異體基質內透鏡植入后傷口愈合的過程。研究結果顯示，在受體角膜與植入基質透鏡的交界處，角膜基質細胞的密度和形態在初期減少和變形后又逐漸恢復，還發現供體的角膜基質透鏡神經纖維再生。

3.3角膜基質透鏡在青光眼小梁切除術中的應用Yin等[36]將來源于SMILE新鮮的角膜基質透鏡用氯化鈉和核酸酶脫細胞后，置于-80℃平衡鹽溶液中保存備用，對兔行小梁切除術，將脫細胞的角膜基質透鏡固定于結膜下間隙。術后觀察到脫細胞角膜基質透鏡可顯著增加濾過泡存在時間，降低眼壓，且無不良反應。組織病理學結果顯示脫細胞組結膜下間隙較大，結膜下纖維化較輕。本研究首次證實了脫細胞的角膜基質透鏡可預防兔眼小梁切除術術后結膜-鞏膜黏連和纖維化，這可能是小梁切除術中一種新的抗纖維化方法，但其安全性和有效性仍需進行更大樣本量和更長隨訪時間的研究。

4總結與展望

角膜基質透鏡具有生物相容性好、易操作、成本低等優點，在當前角膜組織供源遠遠供不應求的狀況下，選擇SMILE來源的角膜基質透鏡在某些情況下作為替代品也是一種不錯的選擇。雖然角膜基質透鏡在治療遠視、散光、角膜穿孔和圓錐角膜等眼科疾病中有著不錯的應用效果，但角膜基質透鏡矯正遠視及散光、圓錐角膜術后視力的可預測性仍有待提高，對于遠視合并散光患者術中角膜基質透鏡的定位是較為關鍵的步驟，目前仍有待進一步研究。角膜基質透鏡的表面質量也有待改善，一旦角膜基質透鏡具有更完美的表面質量，更多角膜材料將用于治療角膜疾病。角膜基質透鏡的保存方法各有其特點，選擇合適的保存方法才能更好地用于臨床。隨著我們深入的研究，角膜基質透鏡有望能夠在更多方面應用。