鞏膜重塑和鞏膜干預在眼部疾病中的研究進展

王霄婧，仇 晨，錢韶紅

0引言

鞏膜是眼球中一種重要的支撐組織，其主要功能包括：(1)保護眼內結構，保持眼部組織的拉伸力和彈性，避免眼球損傷；(2)在波動的眼內壓和頻繁的眼球運動作用下，維持眼球的固定軸向尺寸，確保呈現穩定的視網膜圖像；(3)幫助調節睫狀肌的功能[1]。其在各種眼部疾病的發生、發展及治療中有重要作用。

近些年來，隨著科技發達進步，眼部疾病的檢出率顯著升高。而近視和青光眼是其中兩種嚴重危害視力，影響生活質量的眼部疾病。近年來有研究證實，近視及青光眼與鞏膜重塑密切相關，關于鞏膜重塑的研究主要集中在近視和青光眼領域，其中有許多關鍵信號分子及通路參與調控這一復雜的過程，相關藥物也已逐漸被發現和應用。本文將從鞏膜角度出發，闡述鞏膜重塑與眼部疾病相關的研究，并對鞏膜干預在眼部疾病治療中的可行性進行初步探討。

1鞏膜

眼球外壁由角膜和鞏膜構成，其中角膜占前面約1/6的部分，與之延續的后面約5/6為鞏膜。

1.1鞏膜的構成及生物成分鞏膜組織主要由成纖維細胞和細胞外基質(extracellular matrix, ECM)構成。鞏膜成纖維細胞主要位于膠原纖維之間，通常呈扁平的紡錘形，細胞內有扁平的核。其胞體具有較長的分支，可跨越較長的距離，但是相鄰鞏膜成纖維細胞之間幾乎少有接觸。鞏膜成纖維細胞可合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白多糖等多種ECM成分[2]。

鞏膜ECM由膠原纖維、蛋白聚糖與少量彈性纖維組成，介導細胞間的轉導信號，為細胞提供適宜的微環境，并且影響細胞的代謝、遷移、增殖和分化等[3]。

鞏膜中的膠原纖維占鞏膜干重的90%之多，其中包括約99%的Ⅰ型膠原纖維(type-Ⅰ collagen, COL1)，和少量Ⅲ型、Ⅵ型和Ⅴ型膠原纖維。鞏膜由外至內可分為3層：鞏膜上層、鞏膜實質層和鞏膜棕黑板層。鞏膜不同部位的膠原纖維種類和分布略有不同。鞏膜上層的膠原纖維較細，排列方向不規則；鞏膜實質層的膠原纖維排列較致密，表面相互平行，內面向各個方向發出分支并相互融合形成交錯；鞏膜棕黑板層膠原纖維則更細小。

蛋白聚糖在鞏膜干重中只占約0.7%～0.9%，但卻是鞏膜ECM中主要的水溶性成分。根據結構不同，蛋白聚糖可分為纖調蛋白聚糖(fibromodulin)、雙鏈蛋白聚糖(biglycan)和蛋白聚糖聚合物(aggrecan)。其中纖調蛋白聚糖約占總量的74%，雙鏈蛋白聚糖約占20%，蛋白聚糖聚合物約占6%。在鞏膜中，蛋白聚糖的作用是維持膠原纖維的排列，穩定膠原分子間的相互作用，賦予鞏膜水化性和柔軟性。有研究敲除實驗動物的蛋白聚糖基因后，發現鞏膜膠原纖維的數量和直徑發生變化，鞏膜變薄，眼軸增長[4]。這可說明蛋白聚糖對膠原纖維組裝和排列有著調節作用。

另外，在鞏膜中還存在少量彈性纖維，彈性纖維由彈性蛋白和微纖維組成。彈性蛋白是一種非水溶性無定形物質，其可能與膠原纖維共同作用，賦予眼球更好的回彈力，從而抵抗由于眼內壓力變化或眼球頻繁轉動引起的壓迫、牽拉和扭曲。

鞏膜的生物成分并非一成不變。在眼球的發育過程中，鞏膜的結構和生物成分會隨著眼內壓和眼球運動而發生著動態改變。

1.2鞏膜生物力學早期有關鞏膜生物力學的研究并不多，而近年來隨著檢測方法的多元化，鞏膜生物力學在眼部疾病中的作用逐漸被學者重視。

有研究對人近視眼鞏膜進行力學測試，發現近視鞏膜厚度變薄、承載能力減低、可擴展性增加、蠕變率增大，因此易發生變形[5]。另外有研究對青光眼患者鞏膜進行膨脹試驗(inflation testing)，測量鞏膜受壓情況下的位移，發現與正常眼相比，青光眼視盤周圍鞏膜切向應變和徑向應變發生改變[6]。在動物的高眼壓模型中，研究也發現視乳頭旁區鞏膜及篩板的硬度和厚度較正常眼明顯增加[7]。因此，在眼部疾病的發生發展過程中，鞏膜生物力學確實發生了改變，而學者們推測這一改變源于鞏膜生物成分的變化。膠原纖維是一種黏彈性體，具有滯后性和蠕變性，較小的應變就可引起較高的應力，且鞏膜不同部位的厚度、黏彈性和蠕變特性不同，這可能與鞏膜不同部位膠原纖維排列方式不同有關。蛋白聚糖側鏈上的糖胺聚糖帶有大量負電荷，能吸引如鈉離子這樣的正電荷，這些陽離子可結合大量水分子，使糖胺聚糖吸水膨脹，從而維持鞏膜黏彈特性，并賦予鞏膜抗壓能力[2]。因此，鞏膜生物力學與鞏膜生物成分密切相關。在近視及青光眼等多種眼部疾病中，鞏膜生物力學變化可能是由于鞏膜膠原纖維、蛋白聚糖所帶電荷以及彈性纖維的形態、含量和排布發生變化所致。

綜上所述，鞏膜的生物力學與眼部疾病密切相關，且與鞏膜生物成分密不可分。

2鞏膜生物成分在眼部疾病中的變化

2.1膠原纖維在眼部疾病中的變化膠原纖維是鞏膜ECM的主要組成部分，其在不同的眼部疾病中變化不同。

在近視眼中，大量文獻證實了鞏膜膠原纖維的含量和排布都發生了改變。在含量上，研究已經在動物實驗中證實，近視鞏膜中COL1的表達不斷降低[8]；在排布上，McBrien等[9]發現隨著近視發生發展，決定了鞏膜膠原成熟度和抗拉能力的較大直徑膠原纖維數量減少，而較小直徑的膠原纖維數量增加。可見膠原纖維在結構、含量和排布上的改變與近視的發生發展密切相關。

而在青光眼領域，早在1989年Zeimer等[10]就發現，與正常人相比，青光眼視乳頭區周圍鞏膜硬度增加。Girard等[11]在患有單純性視神經萎縮的猴鞏膜中發現了大量膠原纖維的重組和新合成。這提示視神經損傷可能與鞏膜膠原纖維改變相關。

綜上所述，膠原纖維作為鞏膜的主要生物成分之一，其含量和排布的改變與眼部疾病的發生發展密切相關。

2.2蛋白聚糖在眼部疾病中的變化蛋白聚糖作為鞏膜中主要的水溶性成分，其含量在眼部疾病中也發生改變。

早在1983年就有研究發現，與正常眼相比，高度近視眼鞏膜的蛋白聚糖生化標志物含量明顯減少[12]。肖卉[13]進一步發現，通過形覺剝奪及透鏡誘導的近視豚鼠后極部鞏膜各類蛋白聚糖的表達均顯著降低，且應用阿托品治療后，豚鼠后極部鞏膜各類蛋白聚糖表達顯著上調。而與近視相反，有研究發現青光眼患者鞏膜中亮蛋白聚糖基因的mRNA水平顯著增高[14]。

2.3彈性纖維在近視眼鞏膜中的變化彈性纖維作為鞏膜中維持彈性和抗壓性的主要成分，在青光眼中的作用尤為重要。

有研究在電鏡下對比了正常人和青光眼患者鞏膜中的彈性蛋白形態，發現正常人視乳頭旁鞏膜中的彈性蛋白是直線型的，并與膠原纖維緊密結合，在早期青光眼鞏膜中彈性蛋白沒有發生明顯變化，而晚期彈性蛋白呈彎曲型，與膠原纖維結合減少，并且這種現象在視神經損害嚴重的區域更明顯[15]。

3眼部疾病中參與鞏膜重塑調控的關鍵分子及相關通路

近年來隨著鞏膜生物力學和鞏膜重塑在眼部疾病中漸漸被重視，越來越多的關鍵分子和相關通路也被發現參與了眼部疾病中鞏膜重塑的過程。其中包括組織基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)、整合素(integrin)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、生長因子、環腺苷—磷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)、賴氨酰氧化酶(Lysyl oxidase, LOX)、視黃酸(retinoic acid，RA)等。

3.1MMPs及TIMPs MMPs最早由Gross和Lapiere于1962年發現，是一類高度保守的酶，對組織ECM中各種蛋白成分有廣泛降解作用。目前已發現MMPs至少包括28個成員，根據結構特性和底物特異性可大致分為：膠原酶(collagenases)、明膠酶(gelatinases)、溶血素(stromelysins)、基質溶素(matrilysins)、膜型MMPs(membrane-type-MMPs)和其他MMPs。MMPs在血管生成、細胞凋亡和組織修復中發揮作用。因此MMPs在各種疾病的發生發展過程中起重要作用，如血管疾病、骨科疾病、腎臟疾病、腫瘤、神經系統疾病和2型糖尿病等。其中MMP2與眼部疾病的關系最為密切。

MMP2屬于明膠酶，定位于16號染色體，是包含13個外顯子和9個內含子的DNA片段。在各種組織中，MMP2可調節ECM蛋白的合成與降解，影響細胞間的信息傳遞，參與調節細胞的增殖、遷移、分化、黏附、損傷修復及組織重塑。而在鞏膜中，MMP2可降解鞏膜ECM中含量最多的Ⅰ型膠原，使眼球在受到相同眼壓的情況下易于變形[16]。

早在1995年，就已經有研究發現，近視動物模型眼鞏膜中的MMP2活性增加[17]。Zhao等[18]進一步發現MMP2的表達增加先于形覺剝奪導致的近視形成，且敲除MMP2基因有助于抑制近視的形成。

因此，MMP2參與了近視鞏膜重塑的調節，而其作用的具體上下游蛋白及相關通路正在逐漸被發現。Chen等[19]通過對正常豚鼠玻璃體腔內注射 Shh信號通路激動劑誘導近視，導致鞏膜MMP2表達上調；而向近視豚鼠玻璃體腔內注射Shh信號通路抑制劑可使鞏膜組織中MMP2表達下調，可以延緩近視發展；Liu等[20]發現近視動物鞏膜中MMP2、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1, IGF1)以及信號轉導和轉錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的表達均隨近視程度加深而增加。這些研究提示Shh信號通路和IGF1/STAT3信號通路可能參與調控近視鞏膜中MMP2的表達。

隨著對MMPs的深入研究，學者們發現了一類MMPs的內源特異性抑制劑——TIMPs，與MMPs共同參與調控鞏膜鞏膜重塑。Liu等[21]發現形覺剝奪誘導近視5d后TIMP2表達降低，且利用明膠酶活性平板法和酶譜法在體外實驗中發現TIMP2對MMP2的激活和活性均有抑制作用。

綜上所述，MMP2和TIMP2的共同作用對鞏膜重塑起著重要調節作用，其相互作用的機制對于了解眼部疾病的發病機制及開發新的治療方法十分重要。

3.2整合素整合素是一種細胞黏附分子，參與多種生命活動。在鞏膜中，整合素是成纖維細胞的一種表面受體，其胞內結構較短，但可通過α-輔肌動蛋白、踝蛋白和黏著斑蛋白與細胞骨架相連，從而調控細胞與ECM之間的多種信號通路。

本試驗將粗骨料分為兩個級配(5 mm～20 mm和20 mm～30 mm)，等比例混合。混凝土配合比嚴格按照規范《水工混凝土試驗規程》[12](SL 352—2006)設計，配合比見表1。

整合素由α和β兩種亞基構成，不同的α、β鏈決定了整合素與ECM中蛋白的結合特異性。而在人鞏膜成纖維細胞中主要存在的是整合素α1、α2和β1亞單位。Metlapally等[22]發現整合素α1β1主要與基底膜中的Ⅳ型和ⅩⅢ型膠原結合，而整合素α2β1主要與鞏膜中的Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原結合。因此可以推測，整合素α2β1與鞏膜重塑關系最為密切。

有研究發現，在形覺剝奪誘導的豚鼠近視模型中，后極部鞏膜的整合素β1亞基表達減少，并通過級聯效應引起鞏膜重塑，眼軸延長[23]。王園[24]發現形覺剝奪性近視豚鼠后極部鞏膜整合素α1、α2亞基表達減少，反之去遮蓋后表達上調。

綜上所述，整合素與整合素鏈接激酶相互作用，協同參與了眼部疾病中的鞏膜重塑。

3.3HIF-1α 在生理條件下，鞏膜不斷接受光線刺激而發生光氧化作用，形成氧自由基，與此同時細胞內存在抗氧化物質如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等可及時清除氧自由基，維持鞏膜氧自由基的生成與降解處于動態平衡狀態[25]；在病理狀態下，鞏膜氧自由基生成過多或抗氧化能力不足，則可引發脂質過氧化反應，產生代謝物丙二醛(malondialdehyde, MDA)，引起細胞和組織損傷[26]。而HIF-1α則是維持鞏膜氧穩態的重要調節因子之一。

在動物模型上有研究發現，近視鞏膜存在缺氧現象，其中包括一系列缺氧信號通路的激活[27]。訾迎新等[25]發現形覺剝奪性近視豚鼠鞏膜中HIF-1α表達及MDA含量明顯升高，而SOD活力明顯降低。Zhao 等[28]進一步發現在小鼠鞏膜中，上調HIF-1α可導致近視，而下調則導致遠視。另外有研究通過給近視豚鼠每天球周注射過氧化物酶體增殖物激活受體γ拮抗劑或激動劑進行對比，證實了過氧化物酶體增殖物激活受體γ通過調節HIF-1α，進而影響鞏膜膠原水平[29]。

綜上所述，HIF-1α參與眼部疾病中的鞏膜重塑，然而其具體作用的上下游分子及信號通路及仍有待進一步研究。

3.4生長因子

3.4.1轉化生長因子-β 轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)包括TGF-α和 TGF-β兩種類型。TGF-α主要由表皮細胞、腦細胞和巨噬細胞產生，誘導上皮發育；而TGF-β則參與調節細胞的生長、分化、凋亡及免疫。目前普遍認為在鞏膜中起主要作用的是TGF-β(包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)。

陳麗娟等[30]發現在TGF-β1作用下，人胚胎眼鞏膜中COL1的表達增高，Smad泛素化調節因子2(Smurf2)的表達先增高后下降，因此推測TGF-β1可能通過調控Smurf2的表達從而誘導COL1的合成。另外一些研究在動物模型中發現近視鞏膜中Smad3和COL1的表達都下降，且兩者變化趨勢高度一致[31]。兩種結果都表明，TGF-β-Smad-COL1信號途徑參與調控近視發展中的鞏膜重塑過程。Li等[32]發現激活Wnt3/β-catenin信號通路可以減輕TGF-β1對COL1表達的影響，因此推測TGF-β1的作用受Wnt3/β-catenin信號通路影響。另外一些研究發現轉錄活性蛋白1(Sp1)是TGF-β1的下游信號轉錄因子，且TGF-β1-Sp1-COL1 信號通路在近視鞏膜重塑中發揮重要作用[33-34]。Xie等[35]發現當作用于鞏膜的機械應力增高時， TGF-β1表達升高，并影響鞏膜成纖維細胞的膠原代謝。

除了TGF-β1，TGF-β2也參與了近視鞏膜重塑的過程。有臨床研究發現近視患者鞏膜TGF-β2基因的表達與正常人有顯著性差異[36]。在動物模型上也有研究發現的近視鞏膜前部脫落細胞中TGF-β2的表達增高[37]。而最新的研究發現，近視鞏膜TGF-β2的表達變化受Lumican基因突變調控[38]。

3.4.2堿性成纖維細胞生長因子成纖維細胞生長因子是一種多肽，主要由下丘腦和垂體分泌，可分為酸性和堿性兩種類型。在人體中，堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor, bFGF)較多存在于基底膜和血管的內皮下ECM中，在鞏膜、視網膜以及脈絡膜中也存在少量bFGF。Rohrer等[39]發現在眼球生長發育的過程中，bFGF能通過抑制TGF的表達從而抑制近視發生。但Tian等[40]則認為bFGF是通過上調COL1和整合素的表達從而抑制近視發生。

3.5cAMP cAMP是一種廣泛存在于各種組織細胞內的第二信使，可調控細胞的生長、凋亡、增殖、分化等，因此參與多種生命活動和生理功能。在體內，cAMP由腺苷酸環化酶催化合成，并由磷酸二酯酶催化降解為5’-AMP而失活。在鞏膜中，有研究通過磷酸二酯酶抑制劑升高正常豚鼠鞏膜cAMP水平，導致鞏膜膠原纖維直徑變細，最終誘導形成近視[41]。而注射腺苷酸環化酶激活劑使鞏膜cAMP水平升高同樣可導致鞏膜中COL1的含量顯著下降，誘導近視形成[42]。

綜上所述，在鞏膜中cAMP可能參與調控膠原纖維的形成和分解，而其具體機制仍有待進一步研究。

3.6LOX LOX是一種含銅的胺氧化酶，在體內通過賴氨酸殘基氧化成醛，進而啟動膠原蛋白和彈性蛋白的共價交聯，促進膠原蛋白組裝成膠原纖維。因此，LOX在鞏膜中是一種重要的ECM酶類。Yuan等[43]發現形覺剝奪性近視豚鼠鞏膜中LOX表達明顯降低，且調節LOX的表達可改變鞏膜膠原纖維的直徑。因此推測，LOX可能與鞏膜重塑密切相關。

3.7RA RA是一種全反式維甲酸，在體內參與調節細胞分化增殖和程序性死亡，因此在胚胎發育、組織分化、腫瘤細胞生長等多種生物過程中起重要作用。在眼內，RA在醇脫氫酶的作用下轉化為視黃醛，與視網膜上的視蛋白結合構成視紫紅質，從而引起視覺形成；視紫紅質又在光的作用下分解成視黃醛與視蛋白，視黃醛又在視黃醛脫氫酶的作用下可再生成RA，進而形成一個視循環。

很早就有研究發現分離的視網膜色素上皮細胞能夠在培養條件下影響鞏膜細胞的生長[44]。而近年來的研究發現RA可以通過刺激視網膜TGF-β的分泌，從而延緩近視眼鞏膜重塑[45]。這提示視網膜和鞏膜之間存在傳遞信號的因子，而RA可能就是其中之一。

綜上所述，RA是參與視網膜-鞏膜信號傳遞的重要因子之一，很有可能參與了各種眼部疾病中的鞏膜重塑過程。

4鞏膜干預在眼部疾病治療中的可能性

眼部疾病發生發展過程中，上述的關鍵分子和信號通路通過復雜的機制調控鞏膜生物成分的改變，繼而影響鞏膜生物力學。

雖然目前鞏膜生物學干預未在眼部疾病治療中廣泛運用和普及，但已有大量研究在動物模型中證實這些關鍵分子可作為鞏膜干預的潛在靶點，在治療眼部疾病方面具有一定的療效。結膜下注射抗膽堿藥物哌侖西平可以通過調節鞏膜MMP2和TIMP2的平衡改善近視豚鼠的預后[46]；有研究通過球周注射抗氧化藥物紅景天苷(Salidroside)和芒柄花素(Formononetin)抑制HIF-1α，從而減緩小鼠近視發展；外源性球周注射bFGF通過增加鞏膜COL1、整合素α2和整合素β1的表達，抑制近視形成[26, 39]。天然生物交聯劑京尼平(Genipin)能通過鞏膜交聯，抑制豚鼠近視眼鞏膜MMP2水平，促進COL1的表達，從而改善近視[47-48]，另外京尼平具有良好的有效性和安全性，可以避免現有已被臨床批準的核黃素-紫外線a膠原交聯方法對視網膜的毒性作用，因而可被用于治療青光眼[49]；

最新研究發現了一些與近視中鞏膜重塑相關的基因。如基因PDE4B 被證實可能通過PDE4B/cAMP信號通路調節鞏膜COL1的含量，從而控制近視發展[50]；基因lumican過表達可以通過調節TIMP2、MMP2，從而導致近視[51]。越來越多的研究從基因角度，證明了鞏膜生物學與近視的關系，這意味著鞏膜基因治療預防眼部疾病成為可能。

目前，大量研究已經證明通過干預鞏膜的特定分子信號通路增加鞏膜硬度，可對延緩近視有明確的療效。然而在其他眼部疾病治療方面，鞏膜干預的治療前景仍在研究中。例如在青光眼的發生發展中，鞏膜硬度增加是一種危險因素還是保護因素仍有待進一步探討。有學者認為隨著年齡增長，鞏膜中膠原交聯增加、鞏膜變硬，且青光眼發病率隨年齡增長而增加，因此鞏膜硬度增加是一種危險因素。而另一些學者認為變硬的鞏膜可限制眼內壓作用下的鞏膜管擴張，減少視乳頭位移，因此鞏膜硬度增加可以保護視神經免受于機械性損傷，是一種保護因素。而最新的研究發現，通過建立大鼠慢性高眼壓模型模擬青光眼的發生發展，在短期和長期高眼壓作用下，鞏膜生物成分的改變并不是單一的趨勢，而是呈現復雜的動態變化[52]。因此，如何根據青光眼不同時期、眼內壓的不同水平以及不同個體對青光眼視神經損害的不同易感性，來制定不同的鞏膜干預方法，仍有待進一步研究。

5小結

綜上所述，鞏膜重塑是一種復雜的生物過程，與眼部疾病的發生發展密切相關。探索鞏膜重塑的機制可能為鞏膜干預在今后眼部疾病治療方面提供新靶點和新思路。