軟棗獼猴桃多糖提取以及生物活性的研究進展

丁心悅，時東方，辛樹權，李福森，倪秀珍

(長春師范大學，吉林 長春 130032)

軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta(Sieb.et Zucc) Planch.ex Miq.)為獼猴桃科、獼猴桃屬多年生落葉藤本植物，也叫“軟棗子”“奇異莓”[1]。鮮果可食用，營養價值高，除富含維生素C外，還含有黃酮、多糖、生物堿、皂苷等多種活性成分[2-3]。獼猴桃屬植物是天然植物多糖的豐富來源，其中軟棗獼猴桃的多糖含量較高，是中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)的4倍[4]。研究表明，軟棗獼猴桃具有明顯的免疫調節、抗氧化、降血脂、降血糖、抗菌消炎等作用，其藥理作用與其中所含的黃酮類、多糖等成分密切相關[5-7]。

多糖在食品、醫藥、科研、生物可降解包裝材料等新產品的開發中發揮著重要作用，開發用于功能食品或制藥的植物多糖已成為近年來的研究重點[8]。多糖以糖復合物廣泛存在于自然界中，依照其主要來源分為真菌多糖、動物多糖和植物多糖三大類[9]。植物多糖存在于所有植物中，是植物中的一種能量儲存形式，作為能量供應者和支持植物的結構物質。它們在植物的根、莖、葉、種子和果實中含量豐富，例如淀粉、纖維素、果膠和其他功能性多糖等[10]。植物多糖提取相對簡單，天然植物來源的植物多糖因對正常的細胞無毒副作用且具有抗炎、保濕等功效，被廣泛應用于制藥、食品、保健品、化妝品等領域[11]。多糖是許多臨床藥物中的重要活性成分，由于具有保護細胞膜、清除自由基和抗衰老等強大的抗氧化特性，是生物醫學研究領域的熱點。本文闡述了近年來軟棗獼猴桃多糖的提取、結構以及生物活性等方面的研究進展，以期為軟棗獼猴桃多糖在功能性食品以及藥物等領域的開發利用提供理論依據。

1 軟棗獼猴桃多糖提取方法

一些多糖可以直接從谷類、薯類等植物中獲得。然而，大多數非淀粉多糖需要用水，溫和堿或酸溶液提取[12]，也可利用加熱，微波和超聲處理等輔助方法用于提高多糖的提取效率[13]，再通過透析、乙醇沉淀、鹽沉淀或直接冷凍干燥從水溶液中回收多糖。軟棗獼猴桃常用的多糖提取方法有：水提醇沉法、微波提取法和超聲波提取法等。

1.1 水提醇沉法

水提醇沉法是提取多糖最傳統和最常用的方法，多糖是高極性的多羥基化合物[14]，因此，以高極性蒸餾水為溶劑提取植物多糖是常用的方法。在使用水提醇沉法提取多糖時應計算好料液比、提取的時間、提取的次數以及溫度等。杜凡星等[15]利用料液比1∶15 g·mL-1，70℃水浴，過濾，旋轉蒸發，加入一定量無水乙醇來提取多糖，5 000 r·min-1離心20 min，干燥，稱重，稀釋至100 mL，用苯酚-硫酸法測定多糖的含量。得出水浴醇沉時間為4 h時，多糖提取率為9.29%，無水乙醇用量為樣品體積的4倍。李昕昕等[16]研究軟棗獼猴桃多糖的提取時發現，軟棗獼猴桃多糖的最佳提取工藝參數為料液比1∶25，提取溫度90℃，提取時間3 h，提取溶液pH值為6.5～7.0。此條件下軟棗獼猴桃粗多糖得率為45.62%。但該技術既耗時又費力，而且易降解多糖的結構并導致多糖活性降低。

1.2 微波提取法

微波提取，又稱微波萃取，利用高頻電磁波穿透細胞，從而破壞細胞使細胞內物質迅速釋放出來，微波提取同超聲波提取一樣能在低溫下快速而高效地提取多糖[17]。微波輔助萃取與常規方法相比，具有縮短提取時間、節省提取溶劑以及提高多糖提取率等優點[18]。杜凡星等[15]按料液比1∶30 g·mL-1加入蒸餾水，將樣品放入微波爐中，微波功率400 W，微波時間15 min加熱，過濾，旋轉蒸發，用一定量無水乙醇萃取，5 000 r·min-1離心20 min，干燥、稱重、定容至 100 mL。多糖含量采用苯酚-硫酸法測定，提取率為4.35%。 常清泉等[19]在微波時間40 min，微波輸出功率315 W，料液比為59 g·mL-1的條件下，從長白山產軟棗獼猴桃莖中提取多糖，多糖提取率為2.85%。彭雪等[20]利用微波法提取軟棗獼猴桃干粉中多糖的研究結果表明，最優的提取工藝為：提取功率300 W，提取時間120 s,料液比1∶27 g·mL-1。然而，該技術在實際操作中需要更高的測試設備，并且難以用于大規模生產[21]。

1.3 超聲波提取法

超聲波輔助提取是利用超聲波的機械效應、空化效應和熱效應，縮短提取時間，降低提取溫度等[22-24]，使物料中的有效成分快速溶解的提取方法。超聲輔助萃取在不改變聚合物化學結構的情況下是有效的，與常規方法相比具有縮短提取時間、降低提取溫度以及提高多糖提取率等優點[23-25]。王美月等[26]采用正交試驗利用超聲提取工藝對軟棗獼猴桃的多糖進行提取，得出料液比1∶15 g·mL-1，超聲溫度50℃，超聲時間50 min，超聲功率90 W時為最佳提取工藝，利用此方法得出多糖的提取率為2.05%。常清泉等[19]對長白山產軟棗獼猴桃葉多糖超聲提取工藝為超聲時間40 min，料液比為40 g·mL-1，超聲提取功率為900 W，在此條件下葉多糖得率為 4.50%。紀旭光[27]利用超聲工藝對軟棗獼猴桃果實提取多糖的條件是超聲時間70 min，超聲功率350 W，料液比為1∶35 g·mL-1，但該方法的產熱效應不強[28-30]。

2 軟棗獼猴桃多糖的分離純化方法

多糖經早期提取后，除去雜質、色素、小分子等物質，得到粗多糖，而這些粗多糖實際上是許多分子量和結構不同的多糖的混合物。常用的多糖分離純化方法包括有機溶劑除雜法、除蛋白法以及離子交換法等。

2.1 有機溶劑除雜法

因多糖難溶于有機溶劑，故可用乙醇或丙酮反復沉淀、洗滌，除去醇溶物。宣麗[31]采用正交試驗優化乙醇除雜工藝，最終得出乙醇濃度80%，料液比1∶2 g·mL-1，溫度20℃，時間60 min為最優條件。在此條件下，樣品中還原糖的提取率可達到8.00%，而多糖的損失率僅為0.04%，在幾乎不損失多糖的前提下最大程度除去色素、還原糖等雜質。薛剛等[32]利用有機溶劑除雜工藝對野生獼猴桃的多糖進行純化得到含量為13.35%的多糖產品。牛強[33]利用三氯乙酸法對軟棗獼猴桃枝條多糖進行除雜處理，研究表明，三氯乙酸濃度10%時為除雜的最佳濃度。

2.2 除蛋白法

由于蛋白質與多糖相似，同屬于強極性生物大分子，故多糖提取液中普遍含有蛋白質，而去除蛋白干擾是多糖精制的重中之重。Savage 法作為經典去蛋白法，因其條件溫和，處理后多糖的連接鍵不易斷裂，多糖性質不變而被廣泛應用，不足之處就是需多次重復才可去盡蛋白，耗時長且多糖樣品易損失。目前，多數研究旨在找出既能提高蛋白的脫除率，又能保證多糖損失小的辦法。劉長江等[34]利用 Savage 法對粗多糖進行脫蛋白后用DEAE-sephadex A-50、Sephadex G-75 和 Sephadex G-100 凝膠柱純化，得到單一組分后將原料凍干就可得到純軟棗獼猴桃多糖。劉長江等[35]利用8種樹脂對軟棗獼猴桃多糖水溶液進行脫蛋白試驗研究，得出在利用靜態吸附工藝條件下，NKA-9樹脂脫蛋白率達到了87.2%。

2.3 離子交換法

離子交換法是最常用的脫色法，通過離子交換柱色譜不僅可以脫色，而且可以根據多糖的離子強度不同對其進行分離[36]。杜凡星等[15]使用DEAE-52纖維素陰離子交換柱色譜分離純化軟棗獼猴桃中的粗多糖。用蒸餾水和0.1、0.2、0.3 mol·L-1NaCl洗脫后的得率分別為16.1%、7.2%、4.5%和2.3%。劉長江等[2]的研究表明，軟棗獼猴桃粗多糖經DEAE-52纖維素離子交換色譜法預分離后得到軟棗獼猴桃四種多糖組分，經凝膠柱層析進一步分離，就可以完成軟棗獼猴桃多糖的純化。吳瑾瑾等[37]利用陰離子樹脂交換法對獼猴桃根多糖進行純化，其純度可達到85%以上。

3 軟棗獼猴桃多糖生物活性研究

由于抗生素的耐藥性增加以及合成抗氧化劑的毒性增強，人們越來越關注天然生物活性化合物的開發利用。許多研究表明，植物多糖在免疫調節[38-39]、抗病毒[40-41]、抗癌[42]、抗凝血[43]、降脂降血糖[44-45]、抗氧化[46]等方面發揮著重要作用。同樣，對軟棗獼猴桃多糖活性的實驗研究表明，其具有抗氧化、抗菌消炎、降脂降血糖、調節免疫等作用。

3.1 抗氧化活性

軟棗獼猴桃多糖具有抗氧化活性的作用。活性氧(ROS)如羥基自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)和超氧陰離子(O2-)在氧化代謝過程中不斷產生被認為是人類衰老的重要原因[47-48]。源自生物體的ROS過度積累可導致氧化應激，氧化應激被認為是免疫損傷、風濕性關節炎和動脈粥樣硬化等各種疾病的主要發病機制[49]。然而，越來越多的證據表明，合成抗氧化劑可導致肝損傷和致癌，而天然抗氧化化合物可以保護生物體免受侵害并延緩多種慢性疾病的發作，這引起了人們廣泛關注。DPPH自由基清除試驗是用于研究化合物抗氧化活性的最常用方法。WANG等[50]研究表明軟棗獼猴桃活性成分在DPPH上表現出強烈且與濃度相關的清除活性；劉旸旸[51]對軟棗獼猴桃生物堿體外抗氧化活性進行了研究,實驗結果表明,與Vc相比,軟棗獼猴桃生物堿清除DPPH自由基能力和抗脂質體過氧化能力好于Vc。軟棗獼猴桃生物堿對超氧陰離子自由基和羥基自由基有一定的清除作用,但明顯差于Vc。軟棗獼猴桃生物堿對Fe3+具有較好的還原作用,但還原能力稍差于Vc；劉長江等[2]通過研究軟棗獼猴桃清除自由基的能力來評估獼猴桃多糖的抗氧化活性。軟棗獼猴桃多糖具有很強的去除DPPH自由基和·R的能力，IC50值分別為0.497和0.547 mg·mL-1。在受試范圍內，軟棗獼猴桃的去除能力隨著多糖濃度的增加而增加，DPPH自由基和·R的最終去除率與VC相近。且軟棗獼猴桃多糖具有特定的去除·OH的能力，IC50值為 0.668 mg·mL-1。隨著多糖質量濃度的增加，它們的去除能力增加，但是與VC相比，·OH 的去除率存在一定的差距。軟棗獼猴桃多糖對O2-的去除率低，去除能力弱。由此可見，軟棗獼猴桃的多糖具有很強的抗氧化作用。

3.2 抗菌消炎

軟棗獼猴桃多糖具有抗菌消炎的作用。KIM等[52]以軟棗獼猴桃莖的提取物為研究對象，探究了對未加工細胞中脂多糖誘發的炎癥影響，實驗結果表明，軟棗獼猴桃莖的提取物通過抑制有絲分裂原激活的蛋白激酶磷酸化以及nf-kB的核轉運進而發揮抗炎作用；WANG等[50]研究了軟棗獼猴桃對革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌以及真菌生物的體外抗菌活性，結果表明，軟棗獼猴桃對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)具有顯著的抗菌活性，但對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的抗菌活性不明顯。鄭煜焱等[53]研究表明，野生軟棗獼猴桃多糖對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌等有抑制作用,并且隨著軟棗獼猴桃多糖濃度的增加，抑菌作用增強，最低抑菌濃度為10～25 mg·mL-1，對熱帶假絲酵母菌無抑菌作用。溫度和pH值對野生軟棗獼猴桃多糖的抑菌效果也有一定影響，溫度越高，抑菌效果越明顯，并且偏酸性的環境更有利于抑菌，pH在4～5范圍內，野生軟棗獼猴桃多糖抑菌效果較好。

3.3 降血糖血脂

軟棗獼猴桃多糖具有降血糖血脂的作用，研究表明與軟棗獼猴桃降血糖作用相關的主要活性成分是多酚和多糖類化合物[54]。劉延吉等[55]研究表明，軟棗獼猴桃多糖顯著降低糖尿病模型小鼠血清中總膽固醇和甘油三酯，顯著升高高密度脂蛋白，從而使體內血脂水平趨于正常水平，能夠防止糖尿病導致的脂類代謝紊亂，并對糖尿病的并發癥有防治作用。軟棗獼猴桃多糖能有效降低糖尿病小鼠血糖和血脂，提高糖尿病小鼠的糖耐量和肝糖原含量。軟棗獼猴桃多糖可能對胰島β細胞有一定的修復作用，為研究新的降血糖劑型和獲得新的純天然功能性食品提供了具體的理論依據。陳罡等[56]通過研究軟棗獼猴桃多糖對高脂食小鼠脂代謝的影響發現，軟棗獼猴桃多糖能顯著降低小鼠血清和肝臟中總膽固醇和甘油三酯的含量，提高肝臟中高密度脂蛋白膽固醇水平。肝臟組織病理觀察結果表明，軟棗獼猴桃多糖能夠明顯改善并緩解肝臟脂肪高血脂癥狀。小鼠糞便脂質水平測定結果表明，軟棗獼猴桃多糖能顯著提高高脂小鼠糞便中的總脂、膽固醇和甘油三酯含量，說明軟棗獼猴桃多糖能夠起到降低膽固醇水平的作用是通過促進膽固醇排泄途徑來實現的。

3.4 免疫調節

軟棗獼猴桃多糖具有免疫調節的作用。脾臟作為人體最主要的免疫器官，含有大量的免疫 T 細胞和 B 細胞，能產生與免疫調節有關的活性物質，是研究免疫系統的一個極其重要的組織[57-58]，脾臟指數能夠反映免疫程度的高低。侯芳玉等[59]研究表明，軟棗獼猴桃莖多糖(AASP)對小鼠免疫功能有顯著促進作用，是一種有效的免疫調節劑。軟棗獼猴桃莖多糖在體內和體外均能增加ConA和LPS對T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖作用，其中多糖含量100 mg·kg-1時作用最為顯著，在體外AASP具有促進有絲分裂的作用。AASP還促進小鼠淋巴因子的產生，因此，AASP可能在抗腫瘤免疫中發揮特定作用。此外，AASP可以促進B細胞對SRBC抗體的初級反應，增強巨噬細胞的吞噬能力。劉怡菲[60]研究軟棗獼猴桃多糖對小鼠免疫系統的影響，其結果表明，軟棗獼猴桃多糖對小鼠進行灌胃處理時對小鼠外周血總T細胞、輔助T細胞比例有短暫的促進作用，對小鼠外周血中B細胞和毒性T細胞比例有抑制作用，對小鼠外周血中NK細胞的比例有一個延遲且瞬時的促進效應。宣麗[31]通過體內實驗研究了軟棗獼猴桃多糖AAP-3經過DEAE-52纖維素柱層析后用0.1 mol·L-1洗脫后得到的組分即AAP-3b的免疫活性，結果表明，軟棗獼猴桃多糖AAP-3b高劑量組可以促進大鼠的生長，并顯著提高大鼠的脾臟指數; AAP-3b中劑量組和高劑量組可以顯著提高大鼠的胸腺指數、吞噬指數和ConA誘導的大鼠脾淋巴細胞轉化指數。確證了軟棗獼猴桃多糖可以通過促進免疫器官生長、增強細胞免疫功能、增強單核巨噬細胞吞噬能力等方式來提高機體的免疫力，具有一定的免疫活性。

3.5 抗腫瘤、抗糖化等作用

軟棗獼猴桃多糖具有抗腫瘤、抗糖化以及防止紫外線照射的作用。利用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)觀察A459細胞的DNA損傷，經過48 h或72 h后A549細胞表現出典型的凋亡特征。細胞核和細胞質中存在致密的黃綠色染色形成細胞膜囊泡，裂解的細胞核以及凋亡體。故證實了軟棗獼猴桃中的活性成分誘導A549腫瘤細胞凋亡的能力，從而具有抗腫瘤活性。侯芳玉等[61]研究表明軟棗獼猴桃莖多糖可顯著提高鼠傷寒桿菌感染的小鼠生存率，抑制小鼠實體瘤的增殖，其機理可能與能增強機體的免疫功能有關。

軟棗獼猴桃多糖對蛋白質羰基的產生和熒光糖基化中期產物的形成有抑制作用。ZHU等[62]對軟棗獼猴桃多糖進行了體外抗糖化研究，實驗結果表明，軟棗獼猴桃多糖對糖基化早期產物、糖基化中期產物、糖基化終期產物都有抑制作用，對丙酮醛沒有清除能力。

李昕昕等[63]研究表明，軟棗獼猴桃的多糖含量與能夠承受紫外線照射的酵母菌數量成正比，由此說明軟棗獼猴桃多糖能夠幫助酵母菌阻擋紫外線的照射。

4 討論與展望

不同的提取方式不僅使多糖提取率不同，也會對多糖的組成、結構以及理化性質產生一定的影響。提取方法的選擇取決于實驗材料的特性，不同提取方式各有優劣，在實際操作中可根據實際情況將不同方法有機結合以達到高效高產并且雜質含量低的目的。

對于軟棗獼猴桃多糖的提取、分離純化，研究人員進行了相關的實驗研究，但從軟棗獼猴桃內提取純化出的多糖種類還較少。通過查閱文獻發現，軟棗獼猴桃多糖具有一定的抗氧化、抗菌消炎、降脂降血糖、免疫調節等作用，未來軟棗獼猴桃多糖可作為一種新型的天然抗氧化劑、新型藥物或功能性食品來使用。