粉紅單端孢 TrPLD基因家族鑒定及其在侵染甜瓜過程中的表達

柳漆利，張倩倩，薛華麗，畢 陽，宗元元，彭 慧

(1.甘肅農業大學 理學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070)

粉紅單端孢 (Trichotheciumroseum)是導致蘋果、甜瓜、番茄、杏、芒果等水果采后腐爛的主要病原菌，在侵染果實過程中，除造成嚴重的經濟損失外，還會產生單端孢霉烯族類毒素[1-6]。這類毒素具有致癌、致畸、致突變等作用，嚴重威脅人類健康[7]。因此，如何減輕粉紅單端孢對果蔬的侵染、削弱其代謝產生真菌毒素的能力，是目前生產中亟待解決的關鍵問題。

已有研究表明，磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)在病原真菌致病過程中具有重要的作用[8-9]。根據水解磷脂中磷酸二酯鍵位點的不同，磷脂酶可分為磷脂酶A(PLA)、B(PLB)、C(PLC) 和D(PLD)。PLD主要功能是水解宿主膜磷脂結構中磷酸二酯鍵產生磷脂酸(PA)和膽堿陽離子自由基團，其活性決定了磷脂的水解強度[10-13]。PLD參與真菌多種細胞功能，在禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中[14]，敲除FgPLD1導致菌落生長抑制，對小麥的致病力顯著降低。FgPLD2和FgPLD3的缺失對菌絲生長和致病性無顯著影響。在內生真菌(Epichlo?festucae)中[15]，EfPLDB對菌絲生長，菌落形態、囊泡融合和毒力具有調節作用，而EfPLDA對菌絲生長和毒力無顯著影響。在煙曲霉(Aspergillusfumigatus)[16]中，AfPLD敲除后降低了對人肺細胞A549和小鼠的侵染力，但對菌落形態、菌絲生長及其生物膜的形成均無顯著影響。在構巢曲霉(Aspergillusnidulans)[17]中，也鑒定出3種PLD亞型，AnPLDA缺失突變體(ΔPLDA)生長形態無顯著變化，但鈣依賴性PLD顯著降低磷脂酰乙醇胺含量。在淡紫擬青霉(Purpureocilliumlilacinum)[18]中，PLD基因缺失顯著降低了對根結線蟲的致病性，但對菌絲生長、孢子萌發和分生孢子形態無顯著影響。由此可見，PLD的功能因病原菌而異，同時，同一病原真菌的不同PLD家族基因，在病原菌菌絲生長、產孢和致病性等方面也存在顯著差異。

在禾谷鐮刀菌和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[19]中只有缺失包含PX (phox)結構域的PLD基因突變株的生長和產毒受到抑制，而沒有PX結構域的PLD基因的缺失對菌株生長和致病性無顯著影響；淡紫擬青霉的PLD結構中無PX結構域，導致PlPLD的缺失對菌絲生長、分生孢子形成和孢子萌發均無明顯影響[18]。由此表明，PLD的結構對其功能的發揮具有顯著的影響。因此，解析病原真菌PLD基因及其編碼蛋白的結構，對研究其生物學功能和致病性具有重要的作用。

目前，在植物和哺乳動物中，對不同PLD亞型的作用及其在細胞過程中的不同功能的研究已經取得了很大進展，但關于植物病原真菌粉紅單端孢中PLD的作用未見報道。為了進一步探究粉紅單端孢中TrPLD家族基因及其編碼蛋白的功能，本研究通過RT-qPCR技術研究了TrPLD在粉紅單端孢侵染甜瓜果實過程中的表達特性，并利用生物信息學的方法對其編碼蛋白的理化性質、結構特征及系統進化等方面進行預測分析，以期為全面揭示這4種蛋白的結構和功能的研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

粉紅單端孢(菌株號：Tr-1)由甘肅農業大學食品科學與工程學院采后實驗室提供，分離自具有典型粉霉病病害癥狀的甜瓜果實的病部組織，經分離純化、形態學和分子生物學技術鑒定后，保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上備用。

供試瑪瑙厚皮甜瓜(CucumismelonL.cv.malao)于2021年7月采收于甘肅省民勤縣金谷源農業科技有限公司，選取大小均勻、無機械損傷的甜瓜果實，單果套發泡網袋后裝入瓦楞紙包裝箱，于當天運抵實驗室貯藏(溫度22～25 ℃，相對濕度55%～60%)。

1.2 試驗方法

1.2.1 TrPLD基因測序結果 本實驗室通過廣州基迪奧生物科技有限公司對粉紅單端孢進行全基因組測序，通過基因注釋及保守結構域分析篩選出4個TrPLD基因。

1.2.2 TrPLD基因及其編碼蛋白的生物信息學分析 采用MEGA 7軟件用鄰接法(Neighbor-joining)構建TrPLD基因家族系統進化樹；利用在線工具GSDS(http：//gsds.gao-lab.org/)進行基因結構分析；通過ORF finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)平臺預測獲取基因的開放閱讀框；利用在線生物信息學數據庫 ExPASy-ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/)進行蛋白質的基本理化性質分析；利用SMART網站(http：//smart.embl-heidelberg.de/)進行保守結構域分析；利用TMHMM Serverv.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、SignalP 4.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)及ProtScale(https：//web.expasy.org/protscale/)預測蛋白的跨膜區域、信號肽和親疏水性；分別利用SOPMA(NPS@ SOPMA secondary structure prediction results (ibcp.fr))和SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)對蛋白質二級結構和三級結構進行預測；通過Softberry數據庫 (http://linux1.softberry.com/)預測蛋白的亞細胞定位；在線利用NetPhos 3.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析工具預測磷酸化位點。

1.2.3 模擬甜瓜體內粉紅單端孢接種 挑選大小和成熟度均勻、無明顯病蟲害和機械傷的甜瓜果實，用自來水沖洗后自然晾干，1%次氯酸鈉對果實表面進行消毒，晾干后，用榨汁機進行榨汁、滅菌備用。在100 mL PDB 培養基中加入100 μL 1.0×106cfu/mL的粉紅單端孢孢子懸浮液，在28 ℃，150 r/min的搖床中培養3 d后，向對照組加入20 mL 的PDB培養基，向處理組中加入20 mL滅菌的甜瓜汁，繼續培養，然后在第2，4，6，8 小時取樣，液氮冷凍，-80 ℃貯藏待用，試驗包括3次生物學重復。

1.2.4 總RNA的提取 分別取第2，4，6，8小時處理組和對照組的菌絲，液氮冷凍后迅速研磨，將研磨好的樣品用總RNA試劑(TRNzol Universal，天根生化科技有限公司，北京)提取，整個操作過程在4 ℃條件下進行，具體操作參考使用說明書。提取的總RNA采用超微量分光光度計檢測其純度，然后置于-80 ℃保存待用。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 將上述提取的總RNA使用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit Ver 2試劑盒(金牌逆轉錄試劑盒TSK302M，北京擎科新業生物技術有限公司)進行基因組gDNA消除以及反轉錄合成cDNA。使用 Primer 3.0 軟件設計引物，用于RT-qPCR(表1)。RT-qPCR反應體系(20 μL)： 10 μL Extaq Ⅱ，0.8 μL 引物F(10 μmol/L)，0.8 μL 引物 R(10 μmol/L)，0.4 μL Rox Ⅱ，6 μL ddH2O，2 μL cDNA。PCR反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃ 34 s， 40個循環。以TRACTIN為內參基因，采用2-ΔΔCt算法進行基因相對表達量分析，每組數據重復3次。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 The primers used for Real-time quantitative

1.2.6 數據處理 試驗數據采用Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0(SPSS Inc，美國)數據處理軟件進行分析，用Origin 8.0(Northampton，MA，美國)繪制圖表，用Duncan′s法進行差異顯著性分析和標準偏差計算。

2 結果與分析

2.1 基因組測序

通過對全基因組測序注釋結果進行查找和篩選，初步確定了6個PLD基因，并對其進行保守結構域分析，發現只有4個PLD基因具有特征保守結構域，因此確定粉紅單端孢中只有4個PLD同源基因。

2.2 基因結構及蛋白理化性質分析

基因結構及序列信息分析表明，TrPLD1基因全長為3 237 bp，包含7個內含子和8個外顯子，其CDS區長度為2 694 bp，共編碼897個氨基酸；TrPLD2基因全長為2 796 bp，包含3個內含子和4個外顯子，其CDS區長度為2 577 bp，共編碼 858個氨基酸；TrPLD3基因全長為5 563 bp，僅包含1個外顯子，其CDS區長度為5 511 bp，共編碼1 836個氨基酸；TrPLD4基因全長為5 634 bp，包含2個內含子和3個外顯子，其CDS區長度5 550 bp，共編碼1 849個氨基酸(圖1)。通過 ORF finder平臺預測結果表明，TrPLD1共有14個開放閱讀框(ORF)，最長的ORF長度為1 476 nt，位于正義鏈，讀碼框為1；TrPLD2共有18個ORF，最長的ORF長度為1 944 nt，位于正義鏈，讀碼框為2；TrPLD3共有43個ORF，最長的ORF長度為5 049 nt，位于正義鏈，讀碼框為3；TrPLD4共有30個ORF，最長的ORF長度為3 204 nt，位于正義鏈，讀碼框為1。

利用在線生物信息學數據庫ExPASy-ProtParam對TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4的理化性質進行預測分析，結果顯示，TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4的分子質量分別是102.62，99.29，206.85，206.23 ku。分子式分別是C4482H6850N1328O1401S27、C4400H6756N1254O1317S31、C9048H14184N2654O2793S63和C9158H14322N2660O2696S44。理論等電點分別是5.38，5.71，6.23和6.24，屬于酸性蛋白。TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4的正電荷氨基酸殘基數分別為119，108，238和203，負電荷氨基酸殘基數分別為157，141，259和226，負電荷氨基酸殘基數均大于正電荷氨基酸殘基數，表明這4種蛋白整體均帶負電。TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4的總平均親水性均小于0，盡管穩定性系數有所差異，但均大于40，脂肪系數均小于100，表明TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4這4種蛋白均屬于親水性不穩定蛋白。

圖1 TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4基因結構Fig.1 Genetic structures of TrPLD1，TrPLD2，TrPLD3 and TrPLD4

2.3 保守結構域分析

通過SMART網站在線分析TrPLD 4種氨基酸序列的結構域，并繪制蛋白結構域，結果顯示，TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4 等4個序列都包含磷脂酰轉移酶活性必需的2個HKD保守結構域。分析還發現，TrPLD3中有能與N端磷酸肌醇結合的PX和PH結構域，但其他3個TrPLD中不存在該結構域(圖2)。對每個結構域進一步分析發現，HKD結構域均含有27個保守氨基酸，PX和PH結構域分別含有219，132個保守氨基酸。

PX.PX結構域；PH.PH結構域；PLDc.包含HKD活性位點。PX.Phox homology domain;PH. Pleckstrin homology domain;PLDc domain contains the HKD motif forming the active site.

2.4 系統進化樹分析

在粉紅單端孢全基因組測序結果中，通過結構域分析篩選得到4個PLD基因，TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4。通過MEGA 7軟件對TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4氨基酸序列構建系統進化樹(圖3)，結果表明，TrPLD1與炭疽菌(Colletotrichumaenigma)基因位于同一分支，親緣關系最近，同源性為63.89%；TrPLD2與淡紫擬青霉(Purpureocilliumlilacinum)基因聚于同一分支，同源性高達74.57%；TrPLD3和TrPLD4分別與禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)基因聚于同一分支，親緣關系最近，同源性分別為65.38%和55.45%。

2.5 跨膜結構域、信號肽和親/疏水性分析

利用TMHMM Serverv.2.0預測TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4蛋白的跨膜區域，結果顯示，TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4蛋白均無跨膜區，屬于非跨膜蛋白(圖4-A～D)。利用SignalP 4.1 Server 預測TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4信號肽的可能性，其值分別為0.001 6，0.000 5，0.004 7和0.001 2，因此，這4種蛋白均無信號肽，屬于非分泌蛋白(圖4-E～H)。利用ProtScale預測TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4蛋白的親疏水性(圖4-I～L)，(其中負值表示親水，正值表示疏水)，結果顯示，4種蛋白序列均存在明確的親疏水區域，且親水區域明顯高于疏水區域。其中，TrPLD1基因編碼蛋白氨基酸序列第471位氨基酸疏水性最強(1.967)，第834位氨基酸為親水性最強(-3.656)。TrPLD2基因編碼蛋白氨基酸序列第462位氨基酸疏水性最強(2.733)，第327，328位氨基酸為親水性最強(均為-3.611)，TrPLD3基因編碼蛋白氨基酸序列第409位氨基酸疏水性最強(2.544)，第232位氨基酸為親水性最強(-3.644)，TrPLD4基因編碼蛋白氨基酸序列第118位氨基酸疏水性最強(2.378)，第409位氨基酸為親水性最強(-2.967)。因此，初步推測TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4這4種蛋白均為親水性蛋白。

圖3 TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of TrPLD1，TrPLD2，TrPLD3 and TrPLD4

圖4 TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4蛋白的跨膜結構域(A～D)、信號肽(E～H)和親疏水性(I～L)預測Fig.4 Prediction of transmembrane domains(A—D)，signal peptides(E—H)，and hydrophobicity predictions(I—L) of TrPLD1，TrPLD2，TrPLD3 and TrPLD4 proteins

2.6 蛋白二、三級結構預測

使用SOPMA軟件預測TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4蛋白二級結構，如圖5-A所示，TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4蛋白二級結構均由α-螺旋、β-折疊、延伸鏈以及無規則卷曲組成。其中，無規則卷曲和α-螺旋結構是出現較多的結構，而β-折疊和延伸鏈出現比例較小(圖5-A)。利用在線工具SWISS-MODEL對TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4蛋白進行同源建模得到三級結構圖(圖5-B)。

2.7 亞細胞定位

基因編碼的蛋白質只有在特定的亞細胞器中才能發揮穩定的生物學功能。因此，了解蛋白質的亞細胞定位，才能有助于分析不同蛋白質的生物學功能。利用Softberry預測結果表明，TrPLD1主要定位于細胞核上，TrPLD2主要定位于質膜上，TrPLD3主要定位于細胞核上，TrPLD4主要定位于質膜上(表2)。

2.8 磷酸化位點分析

利用NetPhos 3.1 Server在線分析工具預測TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4的磷酸化位點。結果發現，TrPLD1蛋白存在51個Ser磷酸化位點，24個Thr磷酸化位點和25個Tys磷酸化位點(圖6-A)；TrPLD2蛋白存在31個Ser磷酸化位點，16個Thr磷酸化位點和13個Tys磷酸化位點(圖6-B)；TrPLD3蛋白存在105個Ser磷酸化位點、69個Thr磷酸化位點和29個Tys磷酸化位點(圖6-C)；TrPLD4蛋白存在91個Ser磷酸化位點、44個Thr磷酸化位點和15個Tys磷酸化位點(圖6-D)。蛋白潛在的磷酸化位點越多，表明蛋白可能發揮更多的生物學功能，因此，可以推測TrPLD3蛋白具有更重要的作用。

圖5 TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4基因編碼產物的二、三級結構Fig.5 TrPLD1，TrPLD2，TrPLD3 and TrPLD4 genes coding products of secondary and tertiary structure

表2 TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4亞細胞定位預測Tab.2 Prediction of TrPLD1，TrPLD2，TrPLD3 and TrPLD4 subcellular localization

2.9 粉紅單端孢在侵染甜瓜果實不同時期TrPLDs的表達分析

通過模擬粉紅單端孢侵染甜瓜果實體內試驗，其中TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4與對照相比，表達量均存在顯著差異(P<0.05)(圖7)。如與對照相比，處理組的TrPLD1表達量在侵染的第2，4，6，8 小時分別為對照組的2.07，2.17，3.89，9.51倍；TrPLD2的表達量在侵染的第2，4，6，8小時分別是對照組的1.07，2.19，3.27，13.64倍；TrPLD3的表達量在侵染的第2，4，6，8 小時分別是對照組的1.72，6.36，6.82，21.56倍；TrPLD4的表達量在侵染的第2，4，6，8 小時分別是對照組的2.13，7.36，9.32，12.04倍。由此可見，甜瓜汁的加入，顯著上調了TrPLD基因的表達，也表明TrPLD在調控粉紅單端孢侵染甜瓜果實過程中，具有重要的致病作用。同時，第8小時的TrPLD3的表達量顯著高于TrPLD1、TrPLD2和TrPLD4(P<0.05)。由此表明，與其他基因相比，TrPLD3在粉紅單端孢侵染果實過程中具有更加重要的調控作用。

圖6 TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4蛋白的磷酸位點分析Fig.6 Protein phosphorylation sites analysis of TrPLD1，TrPLD2，TrPLD3 and TrPLD4 proteins

豎線表示標準誤(±s)；不同字母代表差異顯著(P<0.05)。Vertical line indicating standard error(±s)； different letters indicating significant differences(P<0.05).

3 結論與討論

本研究通過對粉紅單端孢全基因組測序注釋發現，該病原菌中同時存在4個TrPLD基因，分別命名為TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4。利用生物信息學軟件分別對4個PLD蛋白的序列進行分析，對結構和功能進行預測，結果顯示，4個蛋白分別含有100，60，203，150個潛在的磷酸化位點，磷酸化具有重要的調節、控制蛋白質活力功能作用，蛋白經磷酸化后，對后續參與細胞增殖、分化等生命活動有重要意義[20]。通過Softberry生物學軟件分析發現，粉紅單端孢中TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4蛋白具有不同的亞細胞定位，TrPLD1和TrPLD3定位于細胞核上，TrPLD2和TrPLD4定位于質膜上。已有研究結果發現，定位于不同細胞器的蛋白對調控病原菌的致病性具有不同的作用[21]。因此，TrPLD基因家族的具體生物學功能還需進一步研究。

保守結構域是生物進化或一個蛋白家族中具有不變或者相同的結構域，通常是基因的核心，具有非常重要的生物學功能。通過對蛋白結構域分析發現，4種TrPLD蛋白均具有PLD的2個保守結構域PLDc的HKD基序，該結構域是磷脂酰轉移酶活性所必需的，其主要包含組氨酸、賴氨酸和天冬氨酸[22-25]。通過對PLD晶體結構的研究也發現，2個HKD基序結合能夠形成PLD的活性位點，具有催化水解的活性，因此2個HKD基序對于PLD功能的發揮是必需的[26]。C端的HKD基序促進磷脂復合酶基底的形成，N端HKD基序主要為親核基團，在生物體內二者共同作用發揮功能[27]。這些高度保守的結構域表明，TrPLD基因對調控病原菌生長、發育和致病性具有重要的作用。但由于同一個基因家族中的不同基因包含不同的結構域和作用位點，因此不同的TrPLD基因在不同細胞中行使不同的生物學功能。保守結構域分析還發現，與其他TrPLD蛋白相比，TrPLD3除HKD基序外，還具有能與N端磷酸肌醇結合的PX和PH結構域，因此，可推測該蛋白對粉紅單端孢的生長發育和致病性可能具有更加重要的調控作用。

本研究通過qRT-PCR分析了在模擬粉紅單端孢體內侵染甜瓜果實過程中TrPLD1、TrPLD2、TrPLD3和TrPLD4的基因表達，發現4個TrPLD基因的表達量具有顯著差異，隨著侵染時間的延長，4個TrPLD表達量均發生顯著上調，由此說明TrPLDs基因對粉紅單端孢的致病性具有重要調控作用。其中，與其他TrPLD基因相比，TrPLD3表達量上調最為顯著，這說明TrPLD3基因在粉紅單端孢侵染甜瓜過程中具有更重要的調控作用。所以，PLD家族中的PX或PH結構域對真菌的生長、發育和致病等具有重要作用。為進一步研究PX結構域的功能，僅對FgPLD1基因的PX結構域進行了敲除，結果表明，敲除PX結構域后的突變株與ΔFgPLD1有相似的表型特征，包括影響菌絲生長、菌落形態、無性和有性生殖過程等。這些結果均表明，PX結構域是PLD基因的重要的功能區[12]。在內生真菌和釀酒酵母中[15，19]也有相同的試驗現象，只有敲除包含PX/PH結構域的基因缺失突變株在分生孢子萌發、菌落形態、毒力和菌絲融合上表現出一定的缺陷，而敲除不包含這兩類結構域的其他基因則沒有顯著的影響；而淡紫擬青霉的PLD結構中由于只存在HKD保守序列，無PX結構域，導致PlPLD的缺失對菌絲生長、分生孢子形成和孢子萌發均無明顯差異[18]。由此表明，PLD對病原真菌的生長發育、致病及產毒是否具有重要的作用，關鍵是PLD結構中是否存在PX結構域。由此表明，TrPLD3結構中PX結構域對粉紅單端孢侵染果實具有重要的調控作用。

本研究對粉紅單端孢TrPLD基因家族進行了鑒定，通過保守結構域分析推測，4個TrPLD基因中只有TrPLD3基因調控菌絲生長、菌落形態和產毒等。同時qRT-PCR分析表明，粉紅單端孢侵染甜瓜果實過程中，與其他3個TrPLD基因相比，TrPLD3的表達量最高，隨著侵染時間的延長，其表達量的上調最為顯著。綜上所述，TrPLD3可能對粉紅單端孢的致病性具有更加重要的調控作用，其具體的分子作用機制尚需進一步深入研究。