鰱魚骨蛋白水解物對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

王鵬，穆雅慧，何思寧，王璐，歸艷，馬松艷，郭麗

（綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061）

鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）是我國淡水養(yǎng)殖的主要魚類之一，2018年養(yǎng)殖產(chǎn)量為385.864萬t，占淡水魚養(yǎng)殖量的15.17%[1]。鰱魚價格低、肉質(zhì)鮮嫩，是生產(chǎn)魚糜等加工制品的常用蛋白質(zhì)資源。但與傳統(tǒng)的海水魚類相比，淡水魚凝膠形成能力弱，同時在魚糜制品生產(chǎn)過程中易發(fā)生蛋白質(zhì)氧化，因此需要添加外源物質(zhì)減少蛋白質(zhì)氧化降解，增強其凝膠品質(zhì)[2-3]。

有研究發(fā)現(xiàn)，骨蛋白水解物能夠抑制鯉魚魚糜的蛋白和脂肪氧化變性，濃度越高效果越明顯[4]。酶法制備的具有抗氧化活性的魚糜加工副產(chǎn)物水解物，可明顯改善魚糜產(chǎn)品凝膠性質(zhì)和保水能力[5]。試驗利用中性蛋白酶制備魚骨蛋白水解物，研究魚骨蛋白水解物對鰱魚肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)及抗氧化活性的影響，以期為魚糜制品的工業(yè)應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活鰱魚，購于大潤發(fā)超市；中性蛋白酶（60 000 U/g），北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司提供；8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽（ANS），深圳市美凱特科技有限公司提供；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），南京奧多福尼生物科技有限公司提供；2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），北京酷爾化學科技有限公司提供；乙二胺四乙酸（EDTA），天津中和盛泰化工有限公司提供；十二烷基硫酸鈉（SDS），天津市大茂化學試劑廠提供；5,5-二硫代二硝基苯甲酸鹽（DNTB），阿拉丁控股集團有限公司提供。

JJ-2B型組織搗碎機，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；CR-400型色差儀，日本柯尼卡美能達公司產(chǎn)品；GL-16G-II型高速冷凍離心機，上海市安亭科學儀器廠產(chǎn)品；TA-XT.puls型質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司產(chǎn)品；Hitachi S-3400N型掃描電子顯微鏡，日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 魚骨蛋白水解物的制備

參考張寶林[6]的方法制備鰱魚骨蛋白水解物，并略作修改。將鰱魚骨洗凈，在50℃水中蒸煮1～2 h，以除去魚骨上的殘肉，將魚骨剪成1～2 cm的小段，采用正丁醇除去魚骨中油脂，將脫脂后魚骨用水清洗3次，再用0.6 mol/L的鹽酸為溶劑，料液比為1∶9，進行超聲脫鈣處理，脫鈣時間為60 min，功率為504 W。脫鈣后吸去魚骨表面的水分，稱重記錄質(zhì)量，用組織搗碎機將魚骨絞碎。以0.02 mol/L磷酸緩沖溶液為溶劑，用中性蛋白酶進行水解。提取條件為pH值7.0，酶底比600 U/g，酶解時間6 h，酶解溫度50～55℃，料液比為1∶20。酶解完成后用沸水滅酶10 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，上清液即為水解液。然后將所得水解液冷凍、干燥，并在4℃下儲存使用。

1.2.2 鰱魚肌原纖維蛋白的制備

將新鮮鰱魚除去內(nèi)臟、皮、頭和尾部，取靠近背部的肉150 g，放入組織搗碎機搗碎，加入5倍體積pH值7.5的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液攪拌均勻，肌肉勻漿液在4℃條件下以轉(zhuǎn)速4 300 r/min離心15 min后，棄去上清液，取出沉淀，在相同條件下用上述5倍體積磷酸鹽緩沖溶液洗滌所得沉淀2次，所得沉淀用5倍體積0.1 mol/L的NaCl溶液在相同的條件下洗滌2次，最后一次離心前抽濾，除去勻漿液中的結(jié)締組織，抽濾結(jié)束后在4℃條件下以轉(zhuǎn)速4 300 r/min離心15 min，得到的沉淀即為肌原纖維蛋白[7]。

1.2.3 魚骨蛋白水解物-肌原纖維蛋白懸浮液制備

取肌原纖維蛋白，加入內(nèi)含0.6 mol/L NaCl的pH值6.5的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解，配制蛋白質(zhì)最終質(zhì)量濃度為40 mg/mL的肌原纖維蛋白懸浮液。再向肌原纖維蛋白懸浮液中分別加入1%，2%，4%，6%，8%的魚骨蛋白水解物（W/肌原纖維蛋白濕重），未添加魚骨蛋白水解物為對照，在4℃下靜置穩(wěn)定12 h。

1.2.4 凝膠制備

肌原纖維蛋白凝膠制備方法采用二次加熱法[7]。將得到肌原纖維蛋白添加不同濃度魚骨蛋白水解物，在40℃水浴條件下加熱30 min后，再放入90℃水浴下加熱20 min，加熱完畢后在冰水中冷卻，最后將得到凝膠放入4℃條件下平衡24 h。

1.3 測定方法

1.3.1 肌原纖維蛋白含量的測定

向試管中分別加入質(zhì)量濃度為10 mg/mL的牛血清白蛋白標準溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，再用水補足至1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑，搖勻后室溫放置30 min，于波長540 nm處測定吸光度。未加牛血清白蛋白溶液做空白對照，以蛋白質(zhì)含量為橫坐標，得到的吸光度為縱坐標做標準曲線。準確量取肌原纖維蛋白稀釋液1 mL加雙縮脲試劑4 mL，室溫反應30 min后，于波長540 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算出蛋白含量[8]。得到的標準曲線為：Y=0.260 3X+0.001 1，R2=0.999 8。

1.3.2 肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的測定

參照吳滿剛[9]方法，取3 mL肌原纖維蛋白稀釋液于比色管中，加入pH值7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液3 mL（內(nèi)含1 mmol/L EDTA、8 mol/L尿素、1% SDS），再加入1%的DNTB溶液0.1 mL，以不加DNTB為空白，劇烈振蕩搖勻后，在25℃水浴中放置1 h，然后以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min。然后于波長412 nm處測上清液的吸光度，計算總巰基的含量。測活性巰基含量時用的是pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液（內(nèi)含1 mmol/L EDTA、1% SDS），其他步驟同上，計算活性巰基的含量。

式中：A——吸光度；

N——稀釋倍數(shù)；

C——分子吸光系數(shù)13 600 M-1cm-1；

M——肌原纖維蛋白含量，mg/mL。

1.3.3 表面疏水性的測定

配制成pH值7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液（PBS），再稱取0.120 g ANS，用pH值7.0的0.1 mol/L PBS溶解并定容至50 mL。取4 mL蛋白液加入20 μL預先配置的ANS溶液，振蕩混勻。使用熒光分光光度計測定樣品熒光強度，激發(fā)波長374 nm，發(fā)射波長485 nm。以蛋白濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，計算線性回歸方程曲線斜率，肌原纖維蛋白表面疏水性用SoANS表示[10]。

1.3.4 白度的測定

用手握住色差儀，將色差儀垂直放置于凝膠表面，測定完畢后，記錄好數(shù)據(jù)并用擦鏡紙擦干色差儀的鏡頭表面，每次放置力度保持均勻，記錄L*（亮度），a*（紅/綠度）和b*（黃色/藍），平行測定3次。

式中：L*——亮度值；

a*——紅/綠度值；

b*——黃/藍度值。

1.3.5保水性的測定

參照Foegeding E A[11]方法，稍作改動。取2 g凝膠樣品放入離心管中稱重，在轉(zhuǎn)速10 000 r/min，溫度4℃條件下離心時間3 min，完成后倒掉離心出來的水，再稱離心管和凝膠的質(zhì)量，通過以下公式計算凝膠保水性，平行測3次。

式中：M——離心管質(zhì)量，g；

M1——離心管與離心后除去水的凝膠總質(zhì)量，g；

M2——離心前離心管與凝膠總質(zhì)量，g。

1.3.6 持油性的測定

稱取1 g凝膠樣品于離心管中，稱得凝膠與離心管重并記錄，加入5 mL大豆油劇烈振動5 min后，在25℃條件下放置30 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，離心后移去上層大豆油，并稱重，平行測定3次。

式中：W0——凝膠樣品質(zhì)量，g；

W1——凝膠與離心管的質(zhì)量，g；

W2——凝膠、離心管與色拉油的質(zhì)量，g

1.3.7 凝膠強度的測定

凝膠樣品置于4℃穩(wěn)定12 h后，去除凝膠表面的液體，室溫下放置10 min后進行質(zhì)構(gòu)分析。選用直徑10 mm的圓柱狀探頭（P/0.5S），設定測試前速度1 mm/s，測試中速度0.5 mm/s，測試后速度10 mm/s，穿刺距離10 mm，觸發(fā)力10 g，數(shù)據(jù)速度100（每秒鐘取點數(shù)），通過軟件對數(shù)據(jù)進行分析[12]。

1.3.8 微觀結(jié)構(gòu)的測定

將肌原纖維蛋白凝膠樣品切成小切條（5 mm×5 mm×5 mm），用2.5%的戊二醛在4℃固定24 h。用pH值7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌肌原纖維蛋白凝膠條3次，除去戊二醛流體，每次持續(xù)10 min。將除去戊二醛的肌原纖維蛋白凝膠條依次在50%，70%，80%，90%，100%乙醇中脫水10 min，重復3次。肌原纖維蛋白凝膠條用100%乙醇∶叔丁醇（1∶1）和叔丁醇置換15 min后，將肌原纖維蛋白凝膠條冷凍干燥36 h。使用掃描電子顯微鏡測定肌原纖維蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)[13]。

1.3.9 抗氧化性的測定

（1）ABTS自由基清除能力。配制7 mmol/LABTS溶液，將ABTS與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，將混合溶液置于25℃環(huán)境下避光存放12～16 h，從而得到ABTS儲備液。用pH值4.5、濃度20 mmol/L乙酸鈉溶液稀釋至波長734 nm處的吸光度為0.7±0.02。取3 mL該溶液與20 μL試樣液混合后放置6 min，于波長734 nm處測定吸光度。

式中：I——ABTS自由基清除率，%；

A0——對照的吸光度；

As——樣品的吸光度。

（2）DPPH自由基清除能力。樣品組Ai用2 mL稀釋后待測溶液與DPPH溶液2 mL均勻混合；空白組Aj是用2 mL稀釋后待測溶液與2 mL乙醇均勻混合；對照組Ac為2 mL純凈水與DPPH溶液2 mL均勻混合。

（3）羥自由基清除能力。在試管中加入pH值7.4的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液2 mL，去離子水1.0 mL，將上述液體搖勻；繼續(xù)加入0.75 mol/L FeSO4溶液1.0 mL，充分混勻；加入0.01%H2O21.0 mL，振蕩1 min，加入1.5 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液1.0 mL，將混合液在37℃水浴45 min，于波長536 nm處檢測反應體系吸光度Ap，以去離子水1.0 mL代替H2O21.0 mL，其余條件相同，測其吸光度A，以樣液1.0 mL代替去離子水，其余條件相同，測其吸光度值As。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白疏水性的影響

鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白疏水性的影響見圖1。

圖1 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白疏水性的影響

由圖1可知，與形成凝膠前相比，鰱魚肉肌原纖維蛋白形成凝膠后，表面疏水性明顯增加，增加至凝膠形成前的15.5倍，因為蛋白加熱形成凝膠，高溫破壞了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，讓更多的疏水性氨基酸暴露出來，導致凝膠的表面疏水性增大。

隨著鰱魚骨蛋白水解物添加量增加，肌原纖維蛋白凝膠表面疏水性總體呈下降趨勢，由于外露的疏水性基團增加到一定程度時，部分蛋白質(zhì)分子通過疏水相互作用形成蛋白質(zhì)聚集，使暴露在蛋白分子表面的疏水基團又被包埋[14]，從而導致表面疏水性下降。

2.2 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的影響

鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的影響見圖2。

圖2 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的影響

由圖2可知，當添加鰱魚骨蛋白水解物后，總巰基含量、活性巰基的含量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，可能是隨著鰱魚骨蛋白水解物添加量的增加，使得肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)部分展開，從而使蛋白結(jié)構(gòu)中的二硫鍵變化形成巰基，使總巰基含量得以升高。而蛋白溶解度提高，會使包埋于分子內(nèi)部的巰基暴露出來，進而使得活性巰基的含量逐漸增加[15]。

2.3 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋凝膠白度的影響

鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白凝膠白度的影響見圖3。

圖3 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白凝膠白度的影響

由圖3可知，當添加量為1%～2%時，添加鰱魚骨蛋白水解物的肌原纖維蛋白凝膠白度明顯高于空白對照，當添加量為2%時，凝膠的白度達到最大，為35.80。鰱魚骨蛋白水解物本身呈白色，使凝膠的白度值有所增加。凝膠的白度變化大小取決于蛋白質(zhì)變性的程度，白度值越小說明蛋白質(zhì)變性程度越嚴重。當添加量大于4%時，白度值有所下降，可能是由于水解物添加量較大，攪拌溶解時間增加，進而導致肌原纖維蛋白在空氣中暴露時間較長，從而導致凝膠白度降低[16]。

2.4 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響見圖4。

圖4 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

隨著鰱魚骨蛋白水解物添加量的增多，肌原纖維蛋白凝膠的保水性呈上升趨勢，鰱魚骨蛋白水解物添加量為6%以上時，與未添加鰱魚骨蛋白水解物凝膠相比保水性提高了5%。鰱魚骨蛋白質(zhì)經(jīng)過水解后產(chǎn)生小分子肽，當其添加到魚糜凝膠中時，自身可能會填充到魚糜凝膠的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)中，使凝膠更加致密，從而提高魚糜制品的保水性[17]。

2.5 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋凝膠持油性的影響

鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白凝膠持油性的影響見圖5。

圖5 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白凝膠持油性的影響

隨著鰱魚骨蛋白水解物添加量的增加，肌原纖維蛋白凝膠持油性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。與未添加鰱魚骨蛋白水解物的凝膠相比，鰱魚骨蛋白水解物添加量為1%，2%時，凝膠持油性降低了5.70%，2.99%，可能是添加少量鰱魚骨蛋白水解物在一定程度上破壞了蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，物理截留油粒的能力降低，故持油性降低[18]。當添加量為4%，6%，8%時，凝膠持油性提高了0.88%，1.05%，5.26%，可能是大量的鰱魚骨蛋白水解物與肌原纖維蛋白分子結(jié)構(gòu)間產(chǎn)生相互作用，使親脂基團大量暴露，從而提高了凝膠的持油性[19]。

2.6 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋凝膠強度的影響

鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白凝膠強度的影響見圖6。

圖6 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白凝膠強度的影響

隨著鰱魚骨蛋白水解物添加量的增大，肌原纖維蛋白凝膠強度呈先增加后下降趨勢。未添加鰱魚骨蛋白水解物的凝膠強度為64.59 g，當鰱魚骨蛋白水解物添加量為4%時，凝膠強度達到最大，為88.33 g，與空白對照組相比上升了36.74%，部分鰱魚骨蛋白水解物填充在蛋白質(zhì)的空隙間，使得蛋白質(zhì)凝膠強度一定程度上有所升高。隨著鰱魚骨蛋白水解物添加量的增加，凝膠強度有所下降，可能是由于過多的鰱魚骨蛋白水解物破壞了凝膠的結(jié)構(gòu)，導致凝膠強度的下降。

2.7 微觀結(jié)構(gòu)觀察

不同魚骨蛋白水解物的肌原纖維蛋白凝膠電鏡圖見圖7。

圖7 不同魚骨蛋白水解物的肌原纖維蛋白凝膠電鏡圖

隨著鰱魚骨蛋白水解物添加量的增加，凝膠結(jié)構(gòu)變得光滑平整，由圖7可知，未添加量鰱魚骨蛋白水解物時，凝膠有明顯的斷層現(xiàn)象，粗糙且有較大蜂窩狀空洞，當添加量為1%時，凝膠中有不規(guī)則空洞且有蛋白質(zhì)聚集；當繼續(xù)增加添加量時，凝膠的斷層逐漸變小，這與添加鰱魚骨蛋白水解物后凝膠強度的變化相一致，蛋白凝膠特性的好壞取決于蛋白質(zhì)分子伸展和交聯(lián)的相對速率，當?shù)鞍踪|(zhì)伸展速率高于交聯(lián)速率時，蛋白質(zhì)分子得以充分伸展，從而彼此相互作用形成有序的凝膠結(jié)構(gòu)；反之則形成粗糙的凝膠網(wǎng)絡[20]。當添加量為4%時，凝膠的結(jié)構(gòu)平整光滑，三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，有利于凝膠對水的束縛能力。當添加量大于4%，凝膠的結(jié)構(gòu)又開始松散，出現(xiàn)斷層，三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)松散，這與李學鵬等人[21]研究添加微細鰈魚魚骨泥對金線魚魚糜凝膠品質(zhì)的影響結(jié)果相近。

2.8 鰱魚骨蛋白水解物添加量對肌原纖維蛋白凝膠抗氧化性的影響

添加鰱魚骨蛋白水解物的肌原纖維蛋白對自由基清除率的影響見圖8。

圖8 添加鰱魚骨蛋白水解物的肌原纖維蛋白對自由基清除率的影響

試驗研究鰱魚骨蛋白水解物的肌原纖維蛋白添加量清除ABTS自由基、DPPH自由基和羥自由基的影響。當鰱魚骨蛋白水解物添加量大于4%時，對ABTS自由基和DPPH自由基清除率達到最大，清除率分別為27.2%，88.4%。鰱魚骨蛋白經(jīng)酶解后結(jié)構(gòu)被破壞，形成的水解物含有抗氧化性氨基酸的肽段，增強了其抗氧化能力[22]。也可能是由于蛋白水解后，反應位點增多，能提供更多活潑質(zhì)子與自由基結(jié)合成穩(wěn)定的物質(zhì)，因而提高了抗氧化活性。

3 結(jié)論

研究了魚骨蛋白水解物對肌原纖維蛋白巰基、表面疏水性、凝膠性能、微觀結(jié)構(gòu)及抗氧化作用的影響。肌原纖維蛋白表面疏水性、總巰基和活性巰基含量隨魚骨蛋白水解物添加量增大而增加。添加量為4%魚骨蛋白水解物可保持使凝膠具有較高的凝膠強度和保水力，掃描電鏡觀察也同樣顯現(xiàn)出致密的微觀結(jié)構(gòu)。4%魚骨蛋白水解物-肌原纖維蛋白復合物清除DPPH自由基達到最高，清除率為88.4%。