海帶褐藻糖膠的分離純化及其抗氧化活性測定

李榮蓉，付燕紅，趙紫涵，阮 新，付學軍，孫利芹

（1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005；2.煙臺海關技術中心，山東 煙臺 264000）

海帶（Laminaria japonica.）中含有褐藻膠、褐藻糖膠、褐藻淀粉[1]等多糖。目前，我國海帶的工業利用率僅占30%[2]，其深加工主要集中在碘、褐藻膠及甘露醇等的生產中[3]，造成海帶價格瓶頸，制約了海帶產業的發展，同時海帶工業殘渣作為廢棄物，其中還有豐富的蛋白質、褐藻糖膠及膳食纖維，造成資源浪費。

褐藻糖膠（Fucoidan）是一種水溶性硫酸雜多糖，主要成分為硫酸化的α-L-巖藻糖，并含少量木糖、甘露糖、半乳糖和糖醛酸等[4]。近年來，大量研究已證明褐藻糖膠具有降血糖血脂、抗氧化、抗菌、抗腫瘤、調節機體免疫力等生理活性作用，已成為海洋藥物研究的熱點，有很好的應用前景[5-12]。目前，國內外對褐藻糖膠的研究較集中于提取率的提高，在進一步分離純化和生理活性研究上不夠深入。褐藻糖膠的初步分離純化通常采用乙醇分級沉淀法、CaCl2法和季胺鹽沉淀法等方法[13]。但其提取物中通常會含有蛋白質、色素、褐藻膠等雜質[14]，采用Sevag法、三氯乙酸法、鞣酸法[15-16]等方法去除蛋白會損失褐藻糖膠，同時會影響褐藻糖膠活性[17]，因此需要對褐藻糖膠分離純化方法、結構和抗氧化活性進行進一步研究。

采用DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱層析及高效液相凝膠色譜（High performance liquidchromatography，HPLC）對海帶中褐藻糖膠粗品進行分離純化工藝的研究，測定了高效液相凝膠色譜分離所得3個組分的分子量，并對DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱層析得到的3個組分清除DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基和·OH（羥自由基）能力進行測定，分析不同分子量褐藻糖膠的抗氧化活性。研究為海帶褐藻糖膠的高效且安全的分離純化方法提供試驗依據，有利于有效開發利用具有生物活性的海洋藻類多糖[18]，減少資源浪費，提高海帶的附加值，更好地開發和利用海洋資源[19]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干海帶，山東榮成尋山集團有限公司提供；纖維素酶（20 000 U/g）、果膠酶（60 000 U/g）、復合蛋白酶（390 000 U/g），帝斯曼公司提供；中性蛋白酶（20 000 U/mL），無錫市酶制劑廠提供；標準葡聚糖，中國計量科學研究院提供；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品；Agilent1100型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產品；CBS-A型程控全自動部分收集器、DHL-A型電腦數顯恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 褐藻糖膠粗品制備方法

工藝流程：干海帶→粉碎、過40目篩→檸檬酸-褐藻酸鈉緩沖液浸提→復合酶解→升溫滅酶→NaOH溶液堿溶消化→過濾→濾液加HCl溶液酸凝過夜→加Na2CO3溶液中和→4倍體積乙醇醇析→減壓抽濾→沉淀→干燥→褐藻糖膠粗品。

酶解條件[20]：纖維素酶添加量1%，中性蛋白酶添加量0.5%，復合蛋白酶添加量0.5%，果膠酶添加量1%，料液比1∶40，pH值6.0，溫度60℃，時間3 h。

1.3.2 褐藻糖膠組分的分離

（1）DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱層析分離褐藻糖膠[21]。分別稱取不同質量（0.1，0.2，0.3，0.4 g）褐藻糖膠粗品，用0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液（Phosphate-Buffered Saline，PBS，pH值7.4）配成5，10，15，20 mg/mL不同質量濃度褐藻糖膠溶液，分別上樣于DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱（1.6 cm×30 cm），用0～2.0 mol/L的NaCl溶液（pH值7.4，0.02 mol/L的PBS配制）線性梯度洗脫，洗脫流速0.5 mL/min，自動部分收集器15 min/管收集。苯酚-硫酸法[22]測定多糖含量，以管數為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制相應的洗脫曲線，收集各洗脫峰，超濾濃縮后冷凍干燥。

（2）高效液相凝膠色譜分離褐藻糖膠。取適量褐藻糖膠粗品，用超純水配制成200 μg/mL的樣品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，4℃下冷藏，備用。

色譜條件：Agilent1100型高效液相色譜系統；Waters UltrahydrogelTM linear色譜柱（7.8 mm×300 mm），示差折光（RI）檢測器，流動相：超純水，流速0.6 mL/min，柱溫40℃，進樣量20 μL。

（3）HPLC測定褐藻糖膠組分相對分子質量。采用1.3.2高效液相色譜條件，將HPLC分離得到的褐藻糖膠樣品組分和一系列不同相對分子質量的標準葡聚糖（12.6，60.6，110，521 kD）分別流經Agilent1100型高效液相色譜系統中Waters UltrahydrogelTM linear色譜柱，標準品質量濃度為200 μg/mL，示差折光檢測器檢測。由標準葡聚糖的相對分子質量對數與保留時間做標準曲線，以此計算樣品相對分子質量及分布，樣品純度由峰型判斷。

1.3.3 體外抗氧化活性測定

（1）清除DPPH自由基的能力。將褐藻糖膠樣品組分（D-1，D-2，D-3）配成質量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL，各取2 mL于試管中，分別加入0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL，混勻靜置20 min后測定波長517 nm處的光吸度（用乙醇2 mL+水2 mL作參比）。同時，以相同濃度梯度的BHT（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）作為對照，重復上述操作，并設置平行。

DPPH自由基清除能力的計算公式：

式中：Ai——DPPH溶液2 mL+樣品溶液2 mL的吸光度；

Aj——乙醇2 mL+樣品溶液2 mL的吸光度；

Ac——乙醇2 mL+DPPH溶液2 mL的吸光度。

（2）清除·OH的能力。根據Fenton反應原理測定褐藻糖膠清除·OH的能力。將褐藻糖膠（D-1，D-2，D-3）配制成質量濃度為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mg/mL。取6 mmol/L水楊酸1 mL于試管中，加入2 mmol/L FeSO4溶液1 mL混勻，再加入6 mmol/L H2O2溶液1 mL混勻，于37℃下恒溫水浴15 min，于波長510 nm處測定其吸光度A損傷（用水作為參比）。測定后，各加入上述質量濃度的海帶多糖溶液1 mL，混勻靜置10 min，再測定其吸光度A加樣，并用水代替H2O2的A未損傷做參照。同時，以相同質量濃度的維C作為對照，重復上述操作，并設置平行。

·OH清除能力的計算公式：

式中：A損傷——反應體系原來的吸光度；

A未損傷——加入提取液但不加入H2O2的吸光度；A加樣——反應體系加入提取液后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換色譜分離褐藻糖膠

對5，10，15，20 mg/mL不同質量濃度褐藻糖膠溶液，NaCl溶液0～2.0 mol/L梯度洗脫時的分離效果。

褐藻糖膠不同上樣量的離子交換色譜梯度洗脫曲線見圖1。

圖1 褐藻糖膠不同上樣量的離子交換色譜梯度洗脫曲線

由圖1可知，圖（a）～（d）分別是上樣質量濃度為5，10，15，20 mg/mL的洗脫圖。當上樣質量濃度為5 mg/mL時，各組分分離不徹底，且含量較少，不便于收集（見圖1（a））；由圖1（c）和圖1（d），隨著上樣量增大，鹽洗脫峰的多糖含量并沒有增加，表明圖1（c）上樣質量濃度為15 mg/mL時，此時各組分分離程度比較好，且呈現單一對稱峰，說明達到一定的純度。因此，選擇上樣質量濃度15 mg/mL，既達到了良好的分離效果，又便于收集。

根據圖1（c），試驗共分離得到3個峰，分別記為D-1，D-2和D-3。其中，D-1為流出峰，D-2和D-3為鹽洗脫峰，D-2 NaCl溶液濃度為0-0.5 mol/L，D-3 NaCl溶液濃度為1.00～1.25 mol/L。各峰型均無拖尾現象，分離效果較理想。

2.2 高效液相凝膠色譜分離褐藻糖膠

褐藻糖膠的HPLC色譜圖見圖2，HPLC色譜峰的保留時間和相對峰面積見表1。

表1 HPLC色譜峰的保留時間和相對峰面積

圖2 褐藻糖膠的HPLC色譜圖

褐藻糖膠樣品經過高效液相凝膠色譜分出了3個組分H-1，H-2，H-3。其中，H-1的保留時間為8.107 min，H-2的保留時間為9.594 min，H-3的保留時間為10.397 min。

2.3 純度與相對分子量測定結果

2.3.1 褐藻糖膠組分純度

由圖2可知，褐藻糖膠樣品所分出的3個組分，高效液相色譜圖均呈現單一窄峰，因此試驗分離得到的3個組分可被認為是均一組分。

2.3.2 HPLC相對分子量測定結果

標準葡聚糖的HPLC色譜圖見圖3。

圖3 標準葡聚糖的HPLC色譜圖

根據標準葡聚糖的HPLC色譜圖，各標準葡聚糖的出峰時間分別為6.824，8.852，9.576，12.573 min，與其對應的分子量為521，110，60.6，12.6 kD。

標準葡聚糖標準工作曲線見圖4。

圖4 標準葡聚糖標準工作曲線

根據圖4葡聚糖標準工作曲線和圖2褐藻糖膠樣品中各組分的出峰時間可得3個組分的分子量大小。

色譜峰的保留時間和分子量見表2。

表2 色譜峰的保留時間和分子量

2.4 褐藻糖膠清除自由基的測定結果

2.4.1 褐藻糖膠清除DPPH自由基的測定結果

褐藻糖膠各組分和BHT的DPPH自由基清除見圖5。

由圖5可知，在試驗質量濃度范圍內，褐藻糖膠3個組分D-1，D-2，D-3和BHT對DPPH自由基都有一定的清除作用，隨著質量濃度的增加，DPPH自由基的清除率也在增大，均呈一定劑量-效應相關性，清除率大小為BHT>H-3>H-2>H-1。測定BHT和褐藻糖膠各組分的IC50值，以BHT抗氧化劑作為對照，不同分子量褐藻糖膠組分清除DPPH自由基能力均低于BHT，BHT的IC50為0.922 8 mg/mL。褐藻糖膠中D-3的IC50最小，為1.254 0 mg/mL，表示對DPPH自由基的清除能力最強；其次是D-2，IC50為1.874 0 mg/mL；D-1對DPPH自由基的IC50最大，為2.412 2 mg/mL，對DPPH自由基的清除能力最弱。3個組分由強到弱排列順序為D-3>D-2>D-1，對比分子量發現，褐藻糖膠的分子量越小，對DPPH自由基的清除能力越強，體外抗氧化效果越好。

圖5 褐藻糖膠各組分和BHT的DPPH自由基清除率

2.4.2 褐藻糖膠清除羥基自由基的測定結果

褐藻糖膠各組分和維C的·OH清除率見圖6。

圖6 褐藻糖膠各組分和維C的·OH清除率

由圖6可知，在試驗質量濃度范圍內，褐藻糖膠3個組分D-1，D-2，D-3和維C對·OH都有一定的清除作用，隨著質量濃度的增加，·OH的清除率也在增大，呈一定劑量-效應相關性，當升高到一定質量濃度時，清除率基本趨于定值。測定維C和褐藻糖膠各組分的IC50值，以維C作為對照，維C的IC50為0.349 8 mg/mL，褐藻糖膠組分中D-3的IC50小于維C，D-1和D-2的IC50大于維C。褐藻糖膠D-3的IC50最小，為0.306 5 mg/mL，表示對·OH的清除能力最強；其次是D-2，IC50為0.549 1 mg/mL；D-1的IC50最大，為0.795 1 mg/mL，對·OH的清除能力最弱。由此可見，褐藻糖膠對·OH有較強的清除能力，3個組分由強到弱排列順序為D-3>D-2>D-1，即褐藻糖膠的分子量越小，對·OH的清除能力越強，體外抗氧化活性越好。

3 討論

利用高效液相凝膠色譜對海帶褐藻糖膠粗品進行分離純化，達到很好的分離效果，分離純化的同時可測出各組分的分子量。該分離方法相較于離子交換層析和凝膠柱層析等其他分離方法，具有樣品處理簡單、靈敏度高、制備方便快速、樣品用量少且不被破壞等優點，已有相關文獻報道高效液相色譜在褐藻糖膠研究中用于測定組分的單糖組成[23-24]，但采用高效凝膠色譜分離褐藻糖膠組分并對各組分進行分子量的測定相關文獻少見。

對高效液凝膠相色譜純化得到的褐藻糖膠3個組分進行了分子量測定，結果為193.148，74.407，44.452 kD。與周軍明[25]用離子交換層析純化褐藻糖膠后采用Sephadex G-150型凝膠柱層析測的各組分分子量為120 226.4 D和13 182.5 D的結果有一定差異，可能因多糖種類不同導致。用高效液凝膠相色譜測定多糖分子量要比Sephadex G-150型凝膠柱層析更為快速、精確。試驗還測定了DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱層析純化得到的褐藻糖膠3個組分清除DPPH自由基和·OH的能力與分子量的相關性，與陶傳云等人[26]研究褐藻糖膠多糖的體外抗氧化性能結果相一致，均證明了分子量越小的組分，體外抗氧化效果越好。由于時間限制，沒有進一步研究D-1，D-2，D-3 3個組分與H-1，H-2，H-3 3個組分的對應關系及相關性，褐藻糖膠各組分的組成、結構及生物體內的活性還需要繼續深入研究和探索。

4 結論

（1）采用2種方法對海帶褐藻糖膠粗品進行分離純化，結果表明，DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱層析和高效液相凝膠色譜均分離出3個組分，適于褐藻糖膠的純化[27]。

（2）DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱層析的最佳條件為褐藻糖膠粗品上樣量為20 mL（質量濃度為15 mg/mL），0.5 mL/min，0～2.0 mol/L的Na-Cl溶液進行線性梯度洗脫，得到的3個峰分別為D-1，D-2，D-3，其中D-1為流出峰，D-2和D-3為鹽洗脫峰。高效液相凝膠色譜分離所得H-1，H-2，H-3共3個組分，分子量分別為193.148，74.407，44.452 kD。

（3）D-1，D-2，D-3組分對DPPH自由基和·OH自由基均表現出一定的清除能力，3個組分清除DPPH自由基能力均低于BHT；D-3清除·OH的能力高于維C，D-1和D-2清除·OH的能力低于維C。且3個組分對2種自由基的清除率隨質量濃度升高而增大，清除2種自由基能力由強到弱的排列順序均為D-3>D-2>D-1，即分子量越小，體外抗氧化活性越高。