QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測茶葉中胺菊酯

葉美君，杜穎穎，李文萃，陸小磊，劉相真

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究所，浙江 杭州 310016）

0 引言

胺菊酯CAS號為7696-12-0，分子量為331.4，純品為白色結晶固體，具有除蟲菊氣味，在弱酸性條件下穩定。在30℃條件下，水中溶解度為4.6 mg/L；在25℃條件下溶于苯、二甲苯、甲苯和丙酮，微溶于甲醇和乙醇。胺菊酯為世界衛生組織推薦用于公共衛生的主要殺蟲劑之一，用于防治蚊、蠅、蟑螂等衛生害蟲，具有觸殺作用、對蜚蠊有驅趕作用，但致死性能差，有復蘇現象。胺菊酯屬于神經毒劑，大量攝入會致人中毒，引起頭痛、頭昏、惡心嘔吐、雙手顫抖，重者抽搐或驚厥、昏迷、休克[1-2]。目前，國內胺菊酯的研究主要集中在原藥制備、劑型分析，食品中胺菊酯的檢測方法研究較少，相關檢測方法主要集中在氣相色譜或氣相色譜-質譜法，液相色譜或液相色譜-質譜法檢測胺菊酯相關報道較少[3-5]。

在茶園種植過程中尚未報道胺菊酯作為殺蟲劑使用，茶葉中胺菊酯等污染物質可能從生產和流通過程中引入。監測茶葉中胺菊酯殘留水平和排查該類物質污染源的首要任務是建立一種快速、靈敏和準確的檢測方法。鑒于此，選擇高靈敏度的UPLCMS/MS作為檢測儀器，采用GCB、PSA、C18和NH2等填料為吸附劑對茶葉提取液進行凈化，降低UPLC-MS/MS檢測過程中基質干擾，同時該方法具有準確、靈敏和通用性強等優點，可為茶葉安全風險監測與評估提供有效的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

UPLC/TSQ Quantum Access MAX超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀，美國Thermo Fisher Scientific公司產品；分析天平（感量0.000 1 g），瑞士METTLER TOLEDO公司產品；SC-3610型低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司產品；VORTEX-5型旋渦混合器，其林貝爾Kylin-bell產品；HY-5型回旋振蕩器，江蘇省金壇市榮華儀器有限公司產品；CS501旋轉蒸發儀，上海瑞立科學儀器有限公司產品；MTN-2800D型氮吹濃縮裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司產品。

1.2 試劑與材料

胺菊酯（100.2 μg/mL，1 mL，AccuStandard）；磷酸三苯酯TPP（分析純，含量99%），河北百靈威超精細材料有限公司提供；乙腈、甲醇和甲酸（色譜純），德國Merck公司提供；乙酸銨（色譜純），美國Fluka公司提供；乙腈和甲苯（分析純），華東醫藥股份有限提供；醋酸（分析純），上海凌峰化學試劑有限公司提供；無水醋酸鈉（分析純），溫州吉象化學股份有限公司提供；無水硫酸鎂（分析純），上海試四赫維化工有限公司提供；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠PSA（40～60 μm）、十八烷基硅烷鍵合硅膠C18（40～60 μm）、石墨化碳黑GCB（40～120 μm）、50 mL塑料螺紋具塞離心管，上海安譜科學儀器有限公司提供；0.5，1，5，10 mL刻度移液管，天津市天玻玻璃儀器有限公司提供；2 mL一次性無菌注射器，華東醫藥股份有限公司提供；0.22 μm微孔過濾膜（尼龍），上海迪柯馬分析技術有限公司提供。茶葉，市售樣品；茶粉，茶葉磨碎樣品，按照國際標準GB/T 8303—2013制備。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取0.075 0 g TPP于100 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度線，得到750 mg/L的標準儲備溶液。取1 mL標準儲備溶液，用乙腈配制成0.75 mg/L標準使用溶液。

準確移取1 mL胺菊酯標準物質于10 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度線，得到10 mg/L的標準儲備溶液。取1 mL標準儲備溶液，用乙腈配制成1 mg/L標準使用溶液，取適量1 mg/L標準使用溶液和TPP內標，加入含茶葉基質（陰性樣品）的乙腈溶液，配制成2，5，10，50，100 μg/L的基質匹配標準工作溶液，使用內標法定量。

1.4 儀器條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相A為水（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸），流動相B為甲醇（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸）；柱溫40℃；進樣量4.0 μL；電離模式：電噴霧離子化（ESI），電離源極性：正模式，霧化氣：氮氣，離子噴霧電壓3 500 V，霧化室溫度120℃，離子傳輸管溫度350℃，碰撞氣：氬氣，0.2 MPa，掃描模式：SRM多反應監測掃描。

1.5 樣品前處理

（1）提取。稱取經粉碎的茶葉樣2.0 g于50 mL離心管中，加入10 mL水浸泡30 min，然后加入15 mL乙腈（1%醋酸），6 g無水硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉劇烈振蕩提取1 min，以轉速4 200 r/min離心5 min。

（2）凈化。吸取4 mL上清液于內含300 mg無水硫酸鎂，300 mg PSA、200 mg C18和200 mg GCB的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻1 min，以轉速4 200 r/min離心5 min。準確移取1 mL上清液于5 mL塑料離心管中，加入66.67 μL TPP內標，過0.22 μL微孔濾膜，供UPLC-MS/MS檢測。

2 結果與分析

2.1 液相色譜-質譜條件優化與選擇

2.1.1 質譜條件的優化

將胺菊酯和TPP的標準溶液進入質譜儀器直接分析，采用ESI+模式。在MS+MS/MS模式下，選擇信號強度高、穩定性好的準分子離子作為母離子進行優化，超高效液相色譜-串聯質譜參數（包括碰撞能量CE、透鏡補償電壓Tube lens等）。

胺菊酯的超高效液相色譜-串聯質譜參數見表1。

表1 胺菊酯的超高效液相色譜-串聯質譜參數

2.1.2 色譜條件的優化

根據胺菊酯的結構特點，采用通用型的C18色譜柱作為分離柱，分別選擇乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液，在3%～90%有機相質量分數范圍內進行梯度洗脫，考查流動相對胺菊酯檢測的影響。在正離子模式下，酸性能夠促進化合物的離子化，提高化合物的離子化效率和靈敏度，在水相中添加0.1%甲酸時，胺菊酯的靈敏度高，分離效果滿意。在水相中添加5 mmoL乙酸銨，胺菊酯峰型對稱、信噪比增大、靈敏度提高。

試驗結果表明，當選擇乙腈-水（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸）溶液體系時，胺菊酯的色譜分離、保留和靈敏度情況較為理想，穩定性較好，但內標TPP的穩定性和靈敏度欠佳。選擇甲醇-水（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸）作為流動相，內標TPP的響應和穩定性顯著提升，但胺菊酯的響應相對乙腈溶液略微下降。在有機相B中加入一定量的乙酸銨和甲酸，配置成含5 mmol/L乙酸銨和0.1%（V/V）甲酸的甲醇溶液，保證流動相中甲酸和乙酸銨的濃度一致，以提高樣品的穩定性和重復性。綜上所述，試驗采用水（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸）-甲醇（含5 mmol/L乙酸銨，0.1%（V/V）甲酸）作為流動相進行梯度洗脫。

梯度洗脫程序見表2，胺菊酯和TPP標準溶液在LC-MS/MS上的色譜圖見圖1。

圖1 胺菊酯和TPP標準溶液在LC-MS/MS上的色譜圖

表2 梯度洗脫程序

2.2 前處理方法優化

2.2.1 提取方法的選擇

茶葉含水率低，在提取之前加入一定量的水浸泡（非提取劑），基于乙腈良好的提取效率，植物源食品中農藥殘留檢測大量采用乙腈為提取劑[6-8]。前期試驗表明，提取劑中加入1%醋酸可改善胺菊酯在UPLC-MS/MS上的峰型，提高檢測靈敏度。

提取方式主要有超聲、旋渦、振蕩和勻漿等，根據前期試驗，結合GB 23200.121《食品安全國家標準植物源性食品中331種農藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯用法》中7.3種茶葉和香辛料的前處理方法，采用振蕩提取方式。

2.2.2 凈化材料的選擇與優化

茶葉中有機酸、脂肪和磷脂較高，GCB、PSA、C18和NH2等填料去雜質效果較優，對目標化合物進行分離和純化，選取GCB、PSA、C18和MgSO4等填料為分散萃取（dSPE）材料，采用正交試驗設計研究方法，通過基質效應和回收率評價凈化效果。

選取茶葉胺菊酯陰性樣品，根據上述1.5樣品前處理制備茶葉空白基質，以茶葉空白基質為溶劑配置成系列濃度的基質加標溶液，以胺菊酯與TPP內標物的峰面積比值作為縱坐標，胺菊酯濃度與TPP內標物濃度的比值為橫坐標，繪制基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線。基質效應以η表示：η=（基質匹配標準曲線的斜率k(s+ck)-溶劑標準曲線的斜率k(s)/溶劑標準曲線的斜率k(s)[9]。

正交設計試驗見表3，正交設計試驗數據見表4，正交設計試驗數據分析見表5。

表3 正交設計試驗/mg

表5 正交設計試驗數據分析/mg

由表4可知，GCB，PSA，C18和MgSO4等凈化材料對胺菊酯的基質效應顯著，為進一步明確GCB，PSA，C18和MgSO4各因素中對基質效應的影響，采用直觀分析法對表4試驗結果進行處理。正交試驗數據處理過程如下：分別對每次試驗各因素的一水平的試驗結果求和，即K1，再對每次試驗各因素的二水平的試驗結果求和，即K2，對每次試驗各因素的三水平的試驗結果求和，即K3，分別求出各因素的極差R（最大值和最小值之間的差值），根據極差R的大小判斷各因素對試驗結果的影響。

表4 正交設計試驗數據

由表5可知，R(GCB)>R(PSA)>R(C18)>R(MgSO4)，極差越大，所對應的因素越主要，由此可以確定GCB和PSA在凈化過程中為主要因素，C18和MgSO4在凈化過程中為次要因素，為尋找最優的水平組合，首先對GCB進行單因素試驗，再對PSA進行單因素試驗。

由表5可知，K1(GCB)>K2(GCB)>K3(GCB)，由此可見，GCB含量越低，基質效應越顯著，為了降低基質效應，試驗提高GCB的含量。

GCB單因素試驗設計GCB單因素試驗設計見表6，GCB對胺菊酯基質效應的影響見表7。

表6 GCB單因素試驗設計/mg

表7 GCB對胺菊酯基質效應的影響

由表7可知，GCB含量增加，基質效應減少，當GCB含量繼續增加，大于300 mg時，基質效應無顯著變化，由此GCB選定為200 mg。

由表5可知，K1(PSA)=K2(PSA)>K3(PSA)，由此可見，PSA含量增加，基質效應下降，為了降低基質效應，試驗提高PSA含量。

PSA單因素試驗設計見表8，PSA對胺菊酯基質效應的影響見表9。

表8 PSA單因素試驗設計/mg

表9 PSA對胺菊酯基質效應的影響

由表9可知，當PSA>300 mg，含量繼續增加，基質效應無顯著變化，由此PSA選定為300 mg。

結合表4、表5、表7和表9數據結果和數據分析，分散萃取材料的配比為GCB（200 mg），PSA（300 mg），C18（200 mg），MgSO4（300 mg）。

2.3 方法驗證與評價

2.3.1 方法線性方程、檢出限和定量限

采用茶葉空白基質配制標準溶液，以胺菊酯與內標物質的質譜響應峰面積比值（Ri）作為縱坐標，質量濃度作為橫坐標繪制標準工作曲線（由于樣品和標準溶液的內標物質量濃度一致，采用質量濃度為橫坐標），標準工作曲線為Y=0.003 630 96X+0.001 422 55，在2～100 μg/L的質量濃度范圍內呈現良好的線性關系，相關系數R2=0.994 2。胺菊酯采用茶葉空白基質逐級稀釋，當質量濃度稀釋至3.3 μg/L，S/N的值為3，由此確定方法檢出限（LOD）為3.3 μg/kg，以S/N=10計算最低添加水平（10 μg/kg），以10 μg/kg為添加水平進行回收率試驗，根據最低添加水平的回收率和相對標準偏差確定方法定量限（LOQ）為10 μg/kg。

2.3.2 方法準確度和精密度

分別稱取2.0 g胺菊酯茶葉陰性樣品，加入適量標準使用溶液，配制成低、中、高3個質量濃度水平（10.0，20.0，100.0 μg/kg）的加標樣品，按照1.5樣品前處理方法進行提取與凈化，然后采用UPLC-MS/MS檢測，每一個加標水平測定6次。

胺菊酯在茶葉中的加標回收率（n=6）見表10。

表10 胺菊酯在茶葉中的加標回收率（n=6）

由表10可知，胺菊酯在低、中、高3個質量濃度水平均有著較好的準確度與精密度，加標回收率為77.11%～105.71%，相對標準偏差（RSD）為6.39%～7.84%。

2.4 實際樣品檢測

采用QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法對30份綠茶、紅茶、青茶、黑茶和白茶樣品進行監測，其中胺菊酯陽性樣品1份，殘留量為0.012 mg/kg，檢出率為3.33%，茶葉中胺菊酯的檢出率和殘留量均較低。

3 結論

以乙腈（1%醋酸）為提取溶劑，振蕩為提取方式，經石墨化碳黑、PSA和C18凈化，通過前處理方法中凈化材料的優化，選擇最優的凈化材料配比，建立QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測茶葉中胺菊酯的試驗方法。該分析方法高效便捷、可操作性強，方法的靈敏度、精密度和準確度滿足茶葉的日常檢測要求。