分子生物學探索為食管癌靶向治療開拓新思路

文圖/《中國醫藥導報》 主筆 潘 鋒

劉芝華教授做學術報告

第十五屆“藥明康德生命化學研究獎” 頒獎儀式2021 年12 月18 日以線上方式成功舉辦，設立于2007 年的“藥明康德生命化學研究獎”旨在獎勵從事生命化學及相關領域研究，并在科研創新、成果推廣及高新技術產業化等方面取得突出成就的中青年科技人才。中國醫學科學院腫瘤醫院劉芝華教授潛心鉆研食管癌分子生物學研究20 余年，致力于食管癌的基礎和臨床轉化研究，繪制了全球最大規模的食管癌全基因組圖譜，建立了食管癌精準分子分型體系，結合多維組學數據分析和功能機制，系統研究鑒定了多個與食管癌發生、轉移、耐藥相關的關鍵基因，為食管癌靶向治療、預后判斷及療效預測提供了新的候選分子。憑借在腫瘤學領域尤其是食管癌分子分型和靶向治療研究方面取得的突破進展，劉芝華教授獲頒2021 年度“藥明康德生命化學研究獎杰出成就獎”。

投入腫瘤學研究

20 世紀80 年代劉芝華考入北京大學，北京大學當時沒有醫學部，她選擇了生物系，此后不斷在分子生物學領域深耕，1996 年劉芝華在美國華盛頓州立大學植物生理學及植物分子生物學實驗室完成博士后學習。“其實我學生物也是因為我對醫學很有興趣，覺得生物跟醫學比較近，但我想學醫的愿望一直在心里，一直到讀完博士后我還是想著這事，我就覺得找工作的時候一定要找個醫學單位。”劉芝華說。而在眾多的醫學細分領域中她當時隱約地感到腫瘤發病率高、死亡率高，是一個值得關注的疾病。回國后劉芝華首先選擇了中國醫學科學院腫瘤醫院，一干就是20 多年。

劉芝華回憶道，20 多年前分子生物學在中國熱度剛起，但即使在中國醫學科學院腫瘤醫院這樣的國內頂尖機構，專業人員仍很少，研究水平也相對薄弱。劉芝華給時任分子腫瘤學國家重點實驗室主任的吳旻院士寫了一封信，表達了自己想做這方面研究的愿望。吳旻院士很快接納了她，“你不懂的腫瘤學我們了解，但分子生物學我們不是特別熟悉，你正好過來，我們可以很好地互補一下。”情感上的支持、專業上的鼓勵讓劉芝華很快投入腫瘤研究工作中。

1998 年，在吳旻院士的推薦下劉芝華進入了陳竺院士領銜的“973”項目研究，與眾多基礎研究界的前輩研究員共同工作，和同輩切磋比拼，如饑似渴地學習腫瘤學知識。劉芝華說，當時自己只是個30 歲出頭的年輕人，參與這么大的一個項目，尤其是看到周圍人都特別優秀就“坐不住”了，因而拼命努力學習，不愿落在他人的后面。

繪制全球最大食管癌全基因組圖譜

食管癌是一種發病率較高的常見腫瘤，其侵襲性強，預后差，病因復雜且機制多樣。2020 年4 月《柳葉刀·胃腸病學和肝病學》發表的全球195 個國家地區的食管癌發病率、死亡率和可歸因風險因素等統計數據顯示，2017 年，全球食管癌新發病例47.3 萬例，因食管癌死亡43.6 萬例，中國這兩個數字分別為23.5 萬例和21.3 萬例，均占到全球近一半。外科手術治療食管癌已有百年歷史，至今仍是食管癌傳統的標準治療方法之一，在腫瘤內科步入“精準治療”的時代食管癌藥物治療手段依然十分有限。

在中國醫學科學院腫瘤醫院工作的20 多年時間里，劉芝華的研究主要圍繞食管癌分子機制層層遞進。食管癌有明顯的地區發病率差異和家族聚集現象，劉芝華團隊發現河南、山西等太行山地區是食管癌高發區，他們定期下現場調查，探索食管癌是否與遺傳相關，希望能找到明確的遺傳易感基因。雖然經過多年努力這一設想沒有實現，但當時基本的摸排工作仍然增加了劉芝華對這一疾病的認知。“從現在的角度看，我們覺得同一個家族的人可能飲食習慣、生活方式、環境暴露方面更相似，導致了食管癌家族聚集性明顯。盡管食管癌可能不存在像乳腺癌那樣直接存在的一個易感基因，但仍有可能是多個基因相互作用的結果。”劉芝華說。

2015 年，劉芝華團隊開始了大規模食管癌基因組圖譜測序分析研究，此時國內也有不少團隊開展了針對食管癌基因組的研究，但例數普遍僅有幾十例到上百例且均取樣自新鮮標本，僅做DNA 編碼區外顯子測序，食管癌基因圖譜的全貌始終模糊不清，基因對食管癌患者的臨床意義、病情發展和預后判斷仍無法給出明確的指導。經過不懈努力，劉芝華團隊最終完成了超過500 對患者的全基因組測序，研究團隊不僅對能表達為蛋白質的外顯子進行了測序，還對大量不表達的非編碼區內含子進行了測序，研究論文于2020 年發表在Cell Research 雜志上，成為全球公開發表的最大規模食管癌基因組圖譜研究。基于這些基因組信息劉芝華將食管癌進行了分子分型，發現具有NFE2L2（NRF2）通路突變及RTK-RAS-MYC 通路擴增的食管癌患者預后較差，其中具有NRF2 突變的患者尤其差，而沒有相應基因突變及通路擴增的患者預后則相對較好，這一發現給新藥研發帶來了啟示。

尋找食管癌新藥靶點

與肺癌、乳腺癌相比，目前可用于食管癌治療的藥物屈指可數，這是由于發達國家食管癌疾病負擔較輕，相較于肺癌、乳腺癌等高發病率的腫瘤，全球頂尖學術機構及制藥企業對食管癌研究的投入都明顯偏少，研究進展相對滯后。直到2019 年美國FDA 批準Keytruda（K藥）用于食管癌治療，食管癌才首次迎來新的免疫治療選擇，而靶向藥則無一獲批。在完成全球最大規模的食管癌基因圖譜測序后，劉芝華意識到想要研發新的靶向藥物，僅對食管癌進行基因層面的分型是不夠，“要找藥物的靶點其實主要是針對蛋白質，不管發現什么樣的基因突變，最終起作用還是因為表達的蛋白不一樣，而蛋白起作用還要通過各種不同的修飾。”劉芝華說。

劉芝華認為，食管癌或需要一種“多組學多層面”的分型，她帶領團隊在DNA 測序的基礎上增加了DNA 甲基化、RNA 和蛋白質研究，但相較于DNA、RNA 測序蛋白質分析難度大得多。生物界遺傳信息的傳遞有一個經典的“中心法則”，即遺傳信息從DNA 傳遞給RNA，再從RNA 傳遞給蛋白質，前后兩個傳遞過程分別被稱為轉錄和翻譯。但由RNA 翻譯而來的“蛋白質”實則為一級結構的多肽，還需經折疊修飾過程才能成為有生物活性的蛋白質，而針對這些二級結構修飾過程的研究工作量非基因測序可及，還需要大量研究。

劉芝華介紹，泛素化是一種可逆的翻譯后修飾過程，由E1 泛素激活酶、E2 泛素結合酶以及E3 泛素連接酶依次介導完成。發生泛素化修飾的底物蛋白通常會被蛋白酶體降解，但也有可能通過非降解途徑影響蛋白活性、定位以及相互作用等。與泛素化過程相反，去泛素化酶通過清除、重編輯底物上的泛素鏈來逆轉泛素化修飾。泛素化與去泛素化修飾廣泛滲透到幾乎所有的細胞生命活動當中，其異常調控與包括腫瘤在內的多種人類疾病密切相關。簡言之，泛素化為細胞內蛋白質降解的過程，去泛素化則有助于蛋白質穩定。劉芝華認為，這兩個對應的過程在腫瘤的發生發展、侵襲轉移、耐藥等方面都發揮著重要的作用，但泛素化與去泛素化的穩態失衡在人類腫瘤中的作用尚不明確。

2020 年1 月，劉芝華團隊在Cell Reports 上發表的一項研究，揭示了泛素化與去泛素化過程在鱗狀細胞癌發生發展中的關鍵作用。研究人員系統闡釋了泛素化與去泛素化過程在調控ARID1A 穩定性，以及調控鱗狀細胞癌發生發展中的關鍵作用。研究人員發現SDC2 是ARID1A 低表達促進鱗狀細胞癌發生發展的下游環節，提出的將SDC2 中和抗體應用于ARID1A低表達的鱗狀細胞癌患者的治療方法具有潛在的臨床應用意義。

2021 年3 月，劉芝華團隊在Advanced Science 雜志上發表論文，闡述了去泛素化酶OTUD1 在腫瘤細胞凋亡與化療耐藥中扮演的關鍵角色。研究人員利用體內篩選模型發現，在順鉑耐受的腫瘤細胞中去泛素化酶OTUD1 表達量顯著降低，通過對臨床標本的進一步分析發現OTUD1 低表達與患者不良預后顯著相關，該研究為食管鱗癌臨床治療開拓了新的思路。除了泛素化與去泛素化研究外，劉芝華團隊還探索了丁酰化、乳酸化等修飾方式對食管癌的影響，旨在找到與不同蛋白修飾有關的靶點，以指導拓展食管癌新的診療方式。

劉芝華介紹說，他們團隊根據多組學多層面的結果將食管癌分為4 類，結合多維組學數據和功能機制等系統研究，提出了更全景的食管癌個體化精準診療策略，并為食管癌靶向治療、預后判斷及療效預測提出多個新的候選分子，包括一些已經獲批可用于治療其他腫瘤的“老藥”也因此重獲潛力，針對食管癌適應證已進入臨床研究階段。

劉芝華舉例介紹，以細胞周期抑制劑為例，細胞周期是細胞生命活動的基本過程，而核心細胞周期機制活動也廣泛存在于各類腫瘤，許多科學家試圖尋找與細胞周期相關的藥物。直到2015 年，全球首個細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinase，CDK）4/6 抑制劑Palbociclib 才獲批在美國上市，2018 年進入中國用于乳腺癌治療。

“科學家一直在想辦法尋找細胞周期相關藥物，前些年基本上都失敗了，近年來乳腺癌領域出現了CDK4/6 抑制劑，針對雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性、人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陰性的乳腺癌患者效果很好。從分子機制看，乳腺癌ER 陽性可激活細胞周期蛋白（Cyclin）D1 高表達，而食管癌例也存在Cyclin D1 大量擴增，這意味著CDK4/6 抑制劑可能具備食管癌治療潛力，但仍需臨床試驗進一步驗證。”劉芝華說。

劉芝華坦言，總體而言全球食管癌研究空白仍多，由于肺癌、乳腺癌全球高發，世界各國科學家均投入了大量人力和資源進行研究，這些腫瘤目前已進入“精準治療”時代。在中國進行食管癌研究一直要有一種“使命感”，全球50%的食管癌病例在中國，全世界做得最好的研究也在中國，需要中國學者繼續投入更多的精力和關注。但國內現在的研究離真正解決患者的臨床問題還有不少距離。食管癌各個環節都還有太多的問題要研究，但我們如果不堅持做下去，可能再過多少年食管癌的治療依然還是沒有好方法，因此一定要堅持做下去，相信不遠的將來中國的食管癌患者將迎來更多的治療選擇。

腫瘤微環境影響乳腺癌療效

乳腺癌居女性惡性腫瘤之首，其中三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是復發率和死亡率最高的乳腺癌亞型。TNBC 對激素療法和靶向療法均無效，目前以傳統化療為主要治療手段，但效果并不理想。盡管癌癥免疫治療已進入快速發展時期，TNBC 的免疫治療卻仍舉步維艱。

腫瘤微環境是一個復雜的生態系統，其中固有免疫和適應性免疫細胞、基質細胞、癌細胞及其相互作用，構成精細的調節網絡，共同決定癌癥的發生和發展。早期IMpassion 130 臨床試驗表明，anti-PD-L1 抗體阿替利珠單抗（Atezolizumab）聯合白蛋白結合型紫杉醇（Nab-paclitaxel），能夠顯著降低PD-L1 陽性TNBC 患者的無疾病進展或死亡風險，但近期的IMpassion 131 臨床試驗表明，阿替利珠單抗聯合紫杉醇卻無法使TNBC 患者獲益。不同臨床試驗的結果差異提示不同的化療藥物可能會導致不同的腫瘤微環境特征，進而影響免疫檢查點抑制劑的治療效果，系統解析用藥前后腫瘤微環境變化是理解免疫治療及化療藥物作用機制，提高TNBC 整體治療效果的關鍵。

2021 年10 月14 日，劉芝華教授、北京大學生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）張澤民教授、中國醫學科學院腫瘤醫院馬飛教授和徐兵河教授合作，在Cancer Cell 以Research Article 形式在線發表了題為Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated with response to PD-L1 blockade in triple negative breast cancer 的研究論文。研究人員收集了來自22 例TNBC 患者治療前和治療后的78 例配對樣本，其中11 例接受阿替利珠單抗聯合紫杉醇化療，11 例接受紫杉醇單藥化療，通過整合單細胞轉錄組測序、T 細胞受體序列測序和染色質可及性測序，構建了TNBC 患者腫瘤微環境和外周血來源免疫細胞的高分辨率轉錄組和表觀組動態圖譜。該研究系統比較了響應患者和非響應患者的腫瘤微環境及外周血免疫特征，闡明了免疫細胞在不同治療方案下的動態變化，揭示了anti-PD-L1免疫治療聯合紫杉醇化療在TNBC中的作用機制。

通過比較聯合用藥組不同響應患者的腫瘤及外周血免疫細胞的組成差異，研究人員發現響應患者的腫瘤微環境富集了兩群高表達CXCL13 的T 細胞，即CD8-CXCL13 和CD4-CXCL13，這兩群細胞同時高表達T 細胞毒性和“耗竭”相關基因。為了進一步精確刻畫不同免疫細胞的組成成分和比例變化與治療效果的關聯，研究人員設計了“預測指數”和“治療指數”兩個指數，通過對兩個指數的分析研究人員發現更高基線水平的CD8-CXCL13 和CD4-CXCL13，能夠預測更好的免疫治療響應。此外，研究人員還發現響應患者的腫瘤微環境中富集了兩群高表達CXCL9 和CXCL10 的促炎性巨噬細胞，且這兩群促炎性巨噬細胞與CXCL13+T 細胞存在顯著正相關。

通過比較化療組和聯合用藥組免疫細胞的動態變化，研究人員發現與聯合用藥相反，紫杉醇單藥化療方案能夠顯著降低響應患者腫瘤微環境中的CXCL13+T 細胞，并導致具有免疫抑制功能的巨噬細胞在腫瘤微環境中富集。上述發現表明紫杉醇化療方案可能會削弱核心抗腫瘤免疫細胞，而免疫檢查點抑制劑則能夠顯著增加核心抗腫瘤免疫細胞，提示紫杉醇化療方案與阿替利珠單抗聯合應用時，會影響anti-PD-L1 抗體對TNBC 患者的治療效果。該研究揭示了TNBC 患者對于anti-PD-L1免疫治療敏感和耐藥的分子機制，鑒定了關鍵免疫組分及其在免疫檢查點抑制劑和紫杉醇化療方案下的動態變化，闡明了紫杉醇化療與阿替利珠單抗聯合應用不能有效增加TNBC 患者治療效果的原因。這一研究的科學發現為解析腫瘤及其他疾病中免疫細胞的動態調控機制，指導TNBC 患者臨床分型以實現精準治療以及開發新的臨床檢測與治療手段提供了新的思路。（封面圖為中國醫學科學院腫瘤醫院劉芝華教授）