β-乳球蛋白多酚三配體復合物納米顆粒的制備與表征

姬雨雪，鄭麗麗，楊 旸，鐘 爽，艾斌凌，鄭曉燕，校 導，盛占武,*

（1.海南大學園藝學院，海南 海口 570228；2.中國熱帶農業科學院海口實驗站，海南 海口 570102；3.海口市香蕉生物學重點實驗室，海南 海口 570102）

植物源多酚阿魏酸（ferulic acid，FA）（親水性）、槲皮素（quercetin，QT）（疏水性）和香草酸（vanillic acid，VA）（兩親性）等具有抗菌、消炎、抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集和血栓形成的作用[1-3]。多酚對外界環境（如光和熱等）的變化非常敏感，穩定性差，易被氧化形成醌類物質失去活性，限制了其在食品工業中的廣泛應用[4]。β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）的結構中含多個結合位點，作為蛋白質載體與多酚結合后可提高多酚的穩定性和溶解度，也可改善蛋白質的環境敏感性。如今，β-LG被廣泛用作包封劑，如納米顆粒[5-7]、乳化劑[8-9]和納米復合物[10]。李曉雷等[11]采用β-LG作為載體，使用高效液相色譜檢測發現在與β-LG結合后，QT的溶解度提高了1 844 倍。

納米材料是指50%及以上的顆粒尺寸分布在1～100 nm[12]。由于納米顆粒粒徑較小，被包埋的生物活性物質可以更容易地穿過小腸細胞壁，增加生物活性物質在血液中的濃度，提高其生物利用率[13]。乳化-蒸發法是制備納米顆粒的方法之一。先將有機相（活性物質）加入水相（乳化劑）中，經過高速剪切、高壓均質和微射流等均質手段形成液滴。然后，在真空條件下蒸發掉液滴中的有機溶劑，即可形成納米包埋顆粒。納米顆粒的大小可以通過改變均質次數與壓力、乳化劑的類型和用量、有機相和水相的體積比例等進行控制。為了獲得較小的粒徑，通常采用微射流等高能量的均質手段[14]。Bengoechea等[15]利用乳化-蒸發法制備了食物蛋白包埋植物甾醇的納米顆粒輸送體系，具有較好的穩定性和分散性。杜文凱[16]制備了β-LG-表沒食子兒茶素沒食子酸酯納米顆粒，有效提高了表沒食子兒茶素沒食子酸酯的抗氧化活性及抗腫瘤活性。金建昌[17]將4 種兒茶素分別與熱誘導β-LG結合制成納米顆粒，結果證明復合物納米顆粒延長了兒茶素的抗氧化時效，并對兒茶素有保護和緩釋效應。

目前關于β-LG作為綠色生物載體的研究多集中在與單一小分子結合形成單配體復合物納米顆粒方面[18-19]。課題組前期進行了3種多酚與蛋白結合的實驗，探究多酚添加順序對復合物負載能力的影響，并且在復合物抑制食品中晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）的研究結果表明，β-LG與3種多酚形成的三配體復合物對AGEs的抑制效果比多酚單體的效果更好，因其單體之間具有疊加增效作用且多酚與蛋白結合增強了多酚穩定性[20]。因此，本研究以具有多個配體結合位點的β-LG為載體，以植物來源的FA、QT與VA為配體，制備同時負載3種活性物質的蛋白多酚復合物，并在此基礎上，優化乳化-蒸發法制備納米顆粒的工藝，進一步降低復合物粒徑，增強多酚穩定性，提高β-LG作為生物載體的利用率，為開發新型的復合納米顆粒提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-LG（18.4 kDa，純度≥90%） 上海源葉生物科技有限公司；VA（純度≥97%）、FA（純度≥99%）、QT（純度≥96.5%） 中國食品藥品檢定研究所；乙醇、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉（均為分析純）西隴化工股份有限公司；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純），8-苯胺萘-1-磺酸銨鹽（1-anilino naphthalene-8-sulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

F-7000型熒光分光光度計 日本日立公司；Chirascan型圓二色性光譜儀 英國Applied Photophysics公司；UPLC I-Class型超高效液相色譜儀 美國Waters公司；Ultra-TurraxT25高速分散器（配制S25N18G探頭）德國IKA公司；APV-1000微射流高壓均質機 加拿大ATS公司；RTOP-500Y智能光控制箱 浙江拓普云農科技公司；Zetasizer Nano-ZS90動態多分散粒徑儀 英國Malvern公司；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1β-LG三配體復合物的制備

根據Sim?es等[21]的方法，稍作修改。取β-LG（15 mg/mL）在磷酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH 6）中溶解，加入0.02%疊氮化鈉用作防腐劑以避免微生物生長。在室溫（25 ℃）條件下，400 r/min連續攪拌120 min。將β-LG溶液在4 ℃保存過夜，以確保蛋白質完全水化。通過0.2 μm濾膜過濾樣品，去除蛋白質聚集物和雜質。將β-LG溶液放入具塞玻璃管中，在80 ℃水浴加熱15 min，取出后在冰中冷卻10 min。

將FA、QT和VA分別溶解在磷酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH 6）、無水乙醇和70%乙醇溶液中，避光保存。向β-LG溶液加入0.02～0.12 mg/mL不同質量濃度的FA、QT和VA（乙醇含量最多為18%），按照FA＞QT＞VA的順序[20]以1 h的間隔依次加入。

1.3.2β-LG三配體復合物納米顆粒的制備

將1.3.1節獲得復合物溶液用高速分散器在5 000 r/min分散2 min，分別在微射流壓力40、60 MPa和80MPa下均質1～3 次。通過 40 ℃的旋轉蒸發，除去溶劑，使得到的樣品中乙醇含量為0。

1.3.3 粒徑、多分散指數和Zeta電位

在波長633 nm的He-Ne激光驅動下，通過動態多分散粒徑儀測量顆粒尺寸、多分散指數和Zeta電位。取稀釋100 倍后的樣品[21]1.5 mL分別倒入徑長10 mm的一次性石英比色皿和電極比色皿，檢測角度為13°。測試3 次取平均值。

1.3.4 多酚的加載率與加載量

參照鄧楚君[22]、Cheng Hao等[23]的方法，稍作修改。將復合物納米顆粒置于超濾離心管中，在14 000 r/min、4 ℃離心15 min。利用超高效液相色譜測定濾液中3種游離多酚單體的含量。將保留在過濾裝置中的復合物在55 ℃通風的烘箱中干燥24 h并稱質量。按下式計算其加載率和加載量：

FA檢測色譜條件：參照傅超等[24]的方法，略有修改。BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：0.2%甲醇-乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫：0～9 min，10% A，90% B；9～15 min，10%～30% A，90%～70% B；15～25 min，30% A，70% B；檢測波長324 nm；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。

QT檢測色譜條件：參照石曉峰等[25]的方法，略有修改。 BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫：0～9 min，5% A，95% B；9～10 min，5%～45% A，95%～55% B；10～20 min，45% A，55% B；檢測波長360 nm；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。

VA檢測色譜條件：參照鄒曉紅等[26]的方法，略有修改。BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脫：0～15 min，5% A，95% B；15～25 min，5%～20% A，95%～80% B；25～30 min，20% A，80% B；檢測波長254 nm；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。

1.3.5 穩定性

1.3.5.1 貯藏穩定性

樣品充N2后室溫環境下避光保存35 d，每7 d取樣測定粒徑及其多分散指數，考察樣品貯藏過程中粒徑的變化[20]。

1.3.5.2 光穩定性

將樣品放置在離LED光源約9～10 cm處，光照強度為4 000 lx，溫度保持在25 ℃左右，每6 h用超高效液相色譜測定一次樣品中FA、QT與VA含量變化[27]。

1.3.5.3 熱穩定性

將樣品分別置于25、35、45 ℃和55 ℃的避光水浴鍋中。8 h后取樣，使用超高效液相色譜測定樣品中FA、QT與VA含量的變化[28]。

1.3.6 熒光光譜

在25 ℃條件下，取樣品稀釋至恒定蛋白質量濃度（0.20 mg/mL），分別收集激發波長在260～340 nm（Δλ=15 nm）和220～360 nm（Δλ=60 nm）的同步熒光光譜[29]。

在25 ℃條件下，取樣品稀釋至恒定蛋白質量濃度（0.20 mg/mL）分別測定三維熒光圖譜。測定條件：激發波長200～350 nm（采樣間隔2 nm），發射波長200～500 nm（采樣間隔2 nm）[29]。

在25 ℃條件下，取樣品稀釋至恒定蛋白質量濃度（0.20 mg/mL）分別測定外源熒光光譜。避光條件下，用甲醇制備1.36 mmol/L的ANS儲備溶液。將20 μL ANS溶液加入樣品（4 mL）中，并在25 ℃孵育10 min。測量條件：激發波長370 nm，發射波長400～600 nm[30]。

1.3.7 傅里葉紅外光譜

將干燥的納米顆粒與KBr以1∶100的比例混合于瑪瑙研缽中，研磨混勻，壓片后制成透明薄片，放置紅外光譜儀中以4 cm-1的分辨率從4 000～500 cm-1進行頻率掃描。

1.3.8 圓二光譜

在185～260 nm的范圍內，以1 nm/0.5 s的速率，0.2 nm分辨率測量。將蛋白質質量濃度設為0.20 mg/mL，遠紫外區的路徑長度設為0.5 mm，數據采集時采用恒定的氮氣沖洗。實驗數據用CD pro軟件分析各種二級結構的相對含量[31]

1.3.9 透射電子顯微鏡觀察

在80 kV加速電壓下，采用負染色法，將樣品分散液滴在銅網格碳支撐膜上，并在2 min后用濾紙和干燥的網格去除多余的溶液。用負染液磷鎢酸（質量分數2%）在15 s內對樣品進行負染，網格在室溫下風干后進行觀察[21]。

1.4 數據處理

所有實驗重復3 次，用Origin 8.5軟件進行數據分析及作圖處理，采用SAS 9.4軟件進行統計分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 納米顆粒制備工藝優化

為最大程度排除微射流均質壓力的影響，針對不同均質次數對復合物粒徑影響的研究中選取3個不同壓力，結果見表1。當壓力分別為40、60 MPa和80 MPa時，隨著均質次數的增加，復合物粒徑呈現上升現象，平均粒徑最小值均出現于第1次均質的過程中，因此確定最佳均質次數為1 次；隨著微射流均質壓力的增加，復合物粒徑呈現先降低后增加的現象，平均粒徑最小值出現于60 MPa的均質過程中，當均質壓力進行至80 MPa，復合物的粒徑及相應多分散指數有所增加。次數和壓力的增加會導致多分散指數和粒徑增加，推測是由于均質過程中提供大量能量導致新液滴的快速重聚集，即“過處理現象”。高頻的聚集現象和極高的能量密度是產生“過處理現象”發生的主要原因之一[32]。而經過60 MPa壓力下第1次均質過程產生的復合物具有較低的多分散指數，表明經此條件制備的復合物分散性最好。因此，在本實驗的后續研究中，通過對復合物進行60 MPa、1 次微射流均質處理獲得復合物納米顆粒。

表1 不同均質壓力和均質次數下復合物的平均粒徑、多分散指數與Zeta電位Table 1 Mean size, polydispersity index and zeta potential of composite nanoparticles prepared with different homogenization pressures and different homogenization cycles

2.2 粒徑、多分散指數和Zeta電位

如表2所示，經過80 ℃熱處理15 min的β-LG平均粒徑為185.6 nm，添加多酚后，復合物平均粒徑在130.8～156.2 nm之間，為亞微米級，可見，多酚的加入使復合物粒徑降低，這主要是因為3種多酚與蛋白發生結合，使蛋白分子間相互作用減少，表現為粒徑的降低[33]。經過乳化-蒸發方法制備的復合物平均粒徑在74.5～80.7 nm之間，為納米顆粒。可見，乳化-蒸發法進一步減小了復合物粒徑，可能是由于在真空條件下，復合物中的有機溶劑蒸發后液滴收縮導致[34]。

不同多酚質量濃度的復合物納米顆粒多分散指數都小于0.21，證明復合物納米顆粒粒徑呈單峰分布且穩定均勻。從表2可以看出，隨著多酚質量濃度的增加，復合物納米顆粒的粒徑呈下降趨勢，多酚質量濃度在0.12 mg/mL時，粒徑趨于平穩，證明多酚質量濃度對復合物粒徑有一定影響，在質量濃度0.08 mg/mL條件下的粒徑和多分散指數最優，但隨著多酚質量濃度的增加Zeta電位未發生規律性的變化。三配體復合物的粒徑隨多酚質量濃度的增加而增加，在0.12 mg/mL時多分散指數明顯提高，說明此質量濃度下的復合物粒徑不均勻，呈多峰分布，可能是蛋白結合位點飽和，未結合的多酚分布在復合物中，而復合物納米顆粒未出現這種情況可能是因為納米結構具有更大的比表面積，可結合更多的化合物[33]。綜合分析，選擇最穩定的質量濃度0.08 mg/mL多酚的納米顆粒進行后續表征。

表2 復合物的平均粒徑、多分散指數與Zeta電位Table 2 Mean size, polydispersity index and zeta potential of composite nanoparticles

2.3 加載率與加載量

表3 FA、QT和VA在復合物中加載率和加載量Table 3 Loading efficiency and loading capacity of FA, QT and VA in composite nanoparticles

表3顯示復合物納米顆粒中FA、QT和VA的加載率分別為86.78%、75.00%和86.4%。三配體復合物FA、QT和VA的加載率分別為60.11%、37.09%和68.93%。復合物納米顆粒的加載率均明顯高于三配體復合物，其中，復合物納米顆粒中FA、QT和VA比三配體復合物高26.67%、37.91%和17.47%，這可能是因為納米結構具有更大的比表面積和體積比，能結合更多小分子，這與粒徑結果一致。在復合物中，FA與VA的加載量都高于QT，這可能是QT的疏水性所致，而經乳化-蒸發處理后的納米顆粒中，QT的加載率升高約38%。

2.4 穩定性

2.4.1 熱穩定性

如圖1所示，隨著溫度的升高，復合物納米顆粒中FA加載率變化不明顯，而QT和VA呈下降趨勢；三配體復合物中多酚加載率均呈現下降趨勢，其原因可能是熱處理減弱了β-LG與多酚之間作用力，使部分多酚從β-LG上解離，失去β-LG的保護所致。Prigent等[35]研究了在5、25 ℃和60 ℃條件下牛血清白蛋白與綠原酸的非共價作用，結果顯示，兩者的結合能力隨著溫度的升高而降低，這與本研究結果一致。

圖1 不同溫度下復合物中FA（A）、QT（B）和VA（C）的加載率Fig. 1 Loading efficiency of FA (A), QT (B) and VA (C) in composite nanoparticles at different temperatures

2.4.2 光穩定性

如圖2所示，在可見光照射24 h之內，復合物中FA、QT和VA的加載率呈下降趨勢。納米顆粒中FA、QT和VA的多酚加載率分別下降12%、8%和4%，三配體復合物中FA、QT和VA的多酚加載率分別下降13%、21%和10%。可以看出，復合物納米顆粒加載率的下降速率低于三配體復合物。在照射24 h后，復合物中多酚的加載率下降速率顯著增大，而在對照組在避光條件下，多酚加載率的變化較小。

圖2 不同光照時間下多酚單體在復合物中的加載率Fig. 2 Loading efficiency of polyphenol monomers in composite nanoparticles with different light exposure durations

2.4.3 貯藏穩定性

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，復合物粒徑逐漸變大，這主要是由于多酚和蛋白的聚集體是熱力學不穩定體系，隨著貯存時間的延長顆粒之間發生相互聚集使界面自由能降低，從而導致復合物粒徑的增大[36]。貯藏35 d后，復合物納米顆粒的粒徑仍然小于100 nm，說明其穩定性較高。

圖3 貯藏穩定性Fig. 3 Storage stability of composite nanoparticles

2.5 熒光光譜

2.5.1 同步熒光光譜

采用同步熒光光譜法對熒光團微環境的變化進行表征[37]。如圖4所示，加入3種多酚后2 種樣品的熒光強度均明顯降低，說明多酚的加入對β-LG的微環境造成了影響，色氨酸的熒光強度下降較多，說明蛋白質的構象變化主要發生在色氨酸基團附近[38]。

圖4 復合物同步熒光光譜圖Fig. 4 Synchronous fluorescence spectra of composite nanoparticles

2.5.2 外源熒光光譜

通過熒光疏水探針ANS的結合，檢測蛋白質疏水性的變化。β-LG具有不同的2個ANS結合位點，一部分位于內部（即在疏水蛋白核內），含有二硫鍵；以及另一部分位于外部（即靠近蛋白表面的疏水斑），負責非特異性的ANS相互作用[39-40]。如圖5所示，加入多酚后，蛋白疏水性顯著降低，可能是因為多酚的加入使蛋白疏水區與ANS結合的位點減少，這與羅舒菡[41]研究結果一致。蛋白疏水性隨著復合物粒度的降低而降低，這可能是納米顆粒制備過程中經過微射流均質的處理。在高壓剪切作用下，蛋白顆粒表面暴露出了更多的可與多酚結合的內部疏水基團[42]，導致更少的疏水性氨基酸與ANS結合。這也可以解釋當加入多酚質量濃度相同時，復合物納米顆粒比三配體復合物具有更高的加載率。

圖5 復合物外源熒光光譜圖Fig. 5 Extrinsic fluorescence emission spectra of composite nanoparticles

2.5.3 三維熒光光譜

三維熒光光譜是當激發波長和發射波長同時變化時，獲得的熒光強度變化，它可以提供蛋白質結構變化的更多細節。圖6中存在4個峰：a、b、c和d。峰a代表Trp和Tyr殘基的光譜特征峰；峰b與蛋白質的二級結構相關；峰c代表瑞利散射峰；峰d代表二階散射瑞利散射峰[43]。從圖6A、B可知，由于FA、QT和VA的加入，峰a和峰b的熒光強度逐漸降低，這說明FA、QT和VA不僅可以影響Tyr和Trp殘基附近的微環境，還可能造成蛋白質結構的改變。且復合物納米顆粒（圖6C）的峰b明顯比三配體復合物（圖6B）的峰b低，說明前者的二級結構變化比后者大。

圖6 β-LG（A）、三配體復合物（B）和復合物納米顆粒（C）的三維熒光圖譜Fig. 6 Fluorescence excitation-emission matrix landscapes of β-LG (A),three-ligand composite (B) and nanoparticles (C)

2.6 紅外光譜

用紅外光譜分析多酚與蛋白質結合的構象變化，1 700～1 600 cm-1峰位的酰胺I帶與蛋白的二級結構相關。如圖7所示，酰胺I帶（C＝O拉伸）從1 639.37 cm-1（線d）顯著移動到1 643.35 cm-1（線f），這種位移變化是蛋白與多酚相互作用的結果，根據Tao Yang等[44]的研究，花青素與β-LG等蛋白質相互作用，導致蛋白質二級結構中α-螺旋結構增多，這與本研究結果一致。與此同時，比較β-LG（線d）、三配體復合物（線e）和納米顆粒復合物（線f）的紅外光譜，發現位于3 363.45 cm-1的羥基振動峰轉移到了3 354.24 cm-1，這是因為蛋白中酰胺的氨基與FA（線a）、QT（線b）和VA（線c）的羥基之間發生了相互作用而形成了氫鍵，氫鍵的形成會使伸縮振動波數移向低波數，這說明多酚已被蛋白包埋[45]。

圖7 多酚單體與復合物的傅里葉紅外光譜Fig. 7 FTIR spectra of polyphenol monomers and composite nanoparticles

2.7 圓二色譜結果

β-LG與多酚等小分子相互作用可能導致β-LG二級結構的相關變化。由表4可知，與純β-LG相比，復合物納米顆粒中的α-螺旋相對含量由11.0%增加到35.3%，三配體復合物中的α-螺旋相對含量由11.0%增加到15.1%，這可能是多酚與蛋白的相互作用引起了多肽鏈的收縮，形成新的氫鍵所致。兒茶素與β-LG相互作用研究表明，兒茶素使β-LG中的α-螺旋相對含量增加，β-LG結構更加穩定，這與本研究結果一致[46]。

表4 復合物二級結構變化Table 4 Changes of secondary structures in composite nanoparticles

2.8 透射電子顯微鏡觀察結果

如圖8所示，經過80 ℃熱處理15 min的β-LG呈球形且有聚集（圖8A）；三配體復合物（圖8B）為圓形且分布均勻，并且在負染過程中形成了團簇；圖8C、D分別為0.12 mg/mL和0.08 mg/mL多酚質量濃度下的復合物納米顆粒，外形近似橢圓形，粒徑在50～60 nm之間，與動態光散射結果一致。

圖8 復合物透射電鏡圖Fig. 8 TEM images of composite nanoparticles

3 結 論

利用熱變性后的β-LG為載體同時負載FA、QT和VA三種多酚，制備三配體復合物。再利用乳化-蒸發法成功制備出低于100 nm的復合物納米顆粒，探究微射流壓力、均質次數和多酚質量濃度對納米顆粒的影響。結果表明，在微射流均質壓力為60 MPa、均質1 次，加入的多酚質量濃度為0.08 mg/mL時，可獲得粒徑分布穩定的復合物納米顆粒。通過分析同步熒光、三維熒光、外源熒光光譜的變化發現多酚對復合物蛋白的微環境、二級結構和疏水性有明顯影響，乳化-蒸發法使蛋白表面疏水性升高，蛋白二級結構變化更明顯；通過紅外色譜分析，多酚與蛋白主要通過氫鍵結合。通過圓二色譜進一步分析復合物中蛋白二級結構的變化，相較β-LG，復合物納米顆粒的二級結構變化較大；相較三配體復合物，納米顆粒的α-螺旋相對含量增加，β-折疊相對含量減少，β-轉角相對含量基本不變，無規卷曲增加；透射電子顯微鏡圖像結果顯示，2 種復合物均呈橢圓形，與三配體復合物相比，納米顆粒分布更均勻、粒徑更小。通過動態光散射和超高效液相色譜分析，復合物納米顆粒對3種多酚的加載率和穩定性均高于三配體復合物。綜上，可以推測出在乳化-蒸發過程中，微射流均質使蛋白暴露出更多多酚結合位點，提高蛋白的加載率；旋轉蒸發去除溶劑則顯著提高了復合物的粒徑，使其達到納米級，并將多酚包埋在蛋白內，因納米顆粒具有尺寸效應和表面效應等特性，又可顯著提高多酚穩定性，這為構建多種活性物質的包埋與輸送體系提供了理論基礎。