雙水相萃取結合硼酸親和吸附分離純化辣根過氧化物酶

吳雅嬌，邢又元，韓 娟*，吳嘉聰，李媛媛，王 赟,*

（1.江蘇大學化學化工學院，江蘇 鎮江 212003；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212003；3.江蘇大學京江學院，江蘇 鎮江 212003）

辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP，E.C.1.11.1.7）作為一種過氧化物酶，是由糖蛋白和褐鐵卟啉組成的植物糖蛋白[1]。HRP是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶[2]，目前已廣泛用于化學工程[3]、環境保護[4-5]、突變育種[6]、醫學診斷[7]和食品加工[8]等領域。辣根作為一種長年生香草，是HRP的主要來源。目前，HRP的純化技術一直集中在各種色譜技術上，例如苯基瓊脂糖凝膠CL-4B上的疏水相互作用色譜法[9]、伴刀豆球蛋白A瓊脂糖親和色譜法[10]、膨脹床離子交換色譜法[11]以及透析-凝膠過濾色譜法[12]等。然而，色譜技術既費時又昂貴，大規模應用受到限制。因此，開發一種操作簡單、成本低和選擇性好的純化HRP的新方法備受關注。

雙水相萃取已被證實是一種將分離、濃縮和純化集成的單元操作。雙水相體系（aqueous two-phase system，ATPS）是指將兩種互溶的物質相混合，增加體系中物質的濃度達到（或超過）臨界濃度后，原本互溶的均一體系會分成有明顯界限的兩相體系。雙水相萃取具有成本低、生物相容性好和易于擴大等優點。目前，聚合物-鹽ATPS已廣泛用于分離純化蛋白質[13]，例如木瓜蛋白酶[14]、菠蘿蛋白酶[15]、卵清蛋白[16]和纖溶蛋白酶[17]。然而，盡管雙水相體系在分離純化蛋白質方面有一定優勢，但目標蛋白質選擇性差和聚合物價格昂貴仍然是其工業應用的主要限制。

近年來，磁性氧化石墨烯（graphene oxide@Fe3O4，GO@Fe3O4）在分離純化蛋白質領域表現優異，引起了廣大學者的關注。其中，GO比表面積大[18]，易于修飾和生物相容性好[19]，同時Fe3O4具有重復利用性，可降低分離成本[20]。因此，GO@Fe3O4納米材料是分離和純化蛋白質的理想載體[21]。樹枝狀聚合物聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）具有豐富的官能團，可作為GO@Fe3O4的主要支架增強材料和蛋白質的結合強度。基于此，本實驗利用一種“多價”苯硼酸親和磁性石墨烯復合材料（d-PBA-GO@Fe3O4@PEI）作為進一步純化糖蛋白的分離材料。一方面，磁性材料表面連接了苯硼酸基團，苯硼酸與糖類化合物上的鄰二羥基或間二羥基能形成可逆硼酸酯鍵，這種酯鍵會受外界環境pH值的影響，弱堿性條件下形成，酸性條件下解離，使得磁性材料與糖蛋白具有特異性吸附；另一方面，樹狀聚合物PEI可以放大硼酸配體的數量，從而增加對糖蛋白的結合親和力。

基于此，本實驗將雙水相萃取與親和吸附相結合，建立一種集成化方法用于植物中HRP的分離純化。首先以9種模型化合物為例，優化兩步雙水相萃取體系的最佳條件，接著加入“多價”苯硼酸親和磁性石墨烯復合材料進一步純化HRP，構建適用于HRP分離純化的集成化方法。最終將該集成化方法用于植物辣根粗提液中，實現HRP的分離純化。該集成化方法具有優異的分離純化性能，與傳統色譜技術相比，具有操作簡單和成本低的優勢，對植物糖蛋白的工業化生產具有良好的前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

17R4聚環氧丙烷-聚環氧乙烷-聚環氧丙烷（polypropylene oxide-polyethylene oxide-polypropylene oxide，PPO-PEO-PPO，相對分子質量2 700）、(NH4)2SO4（純度≥99.0%）、磷酸氫二鉀（純度≥99.0%）、檸檬酸鉀（純度≥99.5%）、濃硫酸（純度98.0%）、高錳酸鉀和和葉綠素a（chlorophyll-a，CHL，純度≥85%） 國藥集團化學試劑有限公司；HRP（酶活力＞150 U/mg） 麥克林生化科技有限公司；細胞色素C（cytochrome C，CYT，來自牛心，純度≥95.0%）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，純度96.0%）、花青素（anthocyanin，ANT，純度95.0%）、胡蘿卜素（carotene，CAR，純度≥95.0%）、黃芪多糖（astragalus polysaccharides，ASP，純度＞98.0%）、蔗糖（sucrose，SUC，純度≥99.0%）、果糖（fructose，FRU，純度99.0%）、石墨粉、六水合氯化鐵、氨水、七水合亞硫酸鐵、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、氰基硼氫化鈉、4-甲酰基苯基硼酸 阿拉丁生化科技股份有限公司。所有化學試劑無需進一步純化即可使用。

1.2 儀器與設備

DF-101S恒溫磁力攪拌器 河南省鞏義予華儀器有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；RX-DD7折光率儀 日本愛拓公司；DDS 307A電導率儀上海儀電科學儀器股份有限公司；PHS-3C pH計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 d-PBA-GO@Fe3O4@PEI的制備

根據本課題組前期的工作合成d-PBA-GO@Fe3O4@PEI[22]，得到的材料用磁鐵吸出，用水和乙醇洗滌，40 ℃干燥備用。

1.3.2 濁點的測定

制備一系列不同濃度的17R4純溶液及加入鹽（K3C6H5O7/(NH4)2SO4/K2HPO4，質量分數1%）的混合溶液。將數字溫度計放入盛裝上述溶液的試管中并在恒溫水浴鍋中加熱，直到溶液變渾濁為止。然后將樣品從水浴鍋中取出并在室溫下冷卻。通過觀察捕捉濁度消失的突變點，以獲得溶液的濁點。溫度的誤差控制在0.1 ℃以內，將3 次測定結果取平均值即為濁點。

1.3.3 液液相平衡的測定

通過滴定法測定17R4-鹽ATPS的液液相平衡數據。首先，將質量分數已知的聚合物溶液加入到錐形燒瓶中，并浸入25 ℃恒溫水浴中。然后，將質量分數已知的鹽溶液滴入錐形瓶中，直到澄清溶液變渾濁為止。將去離子水滴加到燒瓶中以得到澄清溶液，并重復該過程。通過稱量法計算混濁點17R4（w1）和鹽（w2）的質量分數。

1.3.4 9種目標物在集成化方法中的分配

首先，將一定量的9種模型化合物（CHL、HRP、CYT、BSA、ANT、CAR、ASP、SUC、FRU）加入到17R4-鹽ATPS中，相平衡后，3種多糖分布到富鹽相中，而其他模型化合物富集在17R4富集相中，從而實現了糖類物質的去除。其次，將檸檬酸鈉電解質溶液添加至富17R4相中，調節其相間電位差后控溫形成17R4-檸檬酸鈉ATPS，此時蛋白質分離進入鹽富集相中，色素仍然保留在17R4富集相中，從而達到去除色素的目的。然后，在上述富鹽相中加入一定量的d-PBA-GO@Fe3O4@PEI吸附劑，調節最佳吸附條件，實現HRP與d-PBA-GO@Fe3O4@PEI的親和吸附，而其他兩種雜質蛋白仍然保留在水相中。最后，調控吸附條件實現洗脫HRP。

1.3.5 植物辣根中HRP的分離純化

首先洗凈辣根（25 g），然后在4 ℃加入100 mL預冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.5），12 000 r/min勻漿5 次。抽濾后，將上述PBS添加至濾液中至200 mL。在冰水浴條件下，用超聲波（40 kHz）將溶液超聲處理3 次，每次20 min。搖動后，將提取物4 ℃、8 000 r/min離心15 min，得到一定量的辣根粗提取物。將一定量辣根粗提物加入到兩步ATPS進行初級純化，接著用d-PBA-GO@Fe3O4@PEI進一步親和吸附HRP，最后得到純化后的HRP。

目標物的酶活力回收率（Ye）、蛋白分布系數（Kp）、純化因子（PF）、分配系數（K）和提取效率（E）的計算如式（1）～（5）所示：

式中：Etop、Vtop和Me分別為上相的酶活力/（U/mL）、上相的體積/mL和初始總酶活力/（U/mL）；Mp、Ptop和Pbottom分別為初始蛋白質量濃度/（g/mL）、上相和下相中的蛋白質量濃度/（g/mL）；Ctop和Cbottom分別為目標物在上相和下相中的平衡質量濃度/（g/mL）；Ca、Va和ms分別為富集相中的目標物質量濃度/（g/mL）、富集相的體積/mL和目標物的初始添加量/g。

1.3.6 目標物的測定

用Micro BCATM蛋白測定試劑盒測定HRP、BSA和CYT的含量[23]；ASP、PUP和FRU含量通過苯酚-硫酸法測定[24]。

CAR測定：通過將25 mg CAR溶于少量三氯甲烷并用石油醚稀釋至100 mL，可得到250 μg/mL的CAR母液。然后通過稀釋CAR母液獲得不同質量濃度（5、10、20、30、40、50、60 μg/mL）的CAR標準溶液，并通過測量450 nm波長處的吸光度繪制CAR的標準曲線。用石油醚稀釋后，在450 nm波長處測定樣品溶液的吸光度。

ANT測定：將ANT（20 mg）溶于10 mL甲醇中，獲得ANT母液，并通過稀釋母液獲得不同質量濃度（0.031 25、0.062 5、0.25、0.5、1 mg/mL）的標準溶液。然后將2.5 mL硫酸添加至0.5 mL標準溶液中，并通過分光光度計在500 nm波長下測定溶液吸光度以繪制標準曲線。樣品溶液用甲醇稀釋，并根據上述程序測定吸光度。

CHL測定：將CHL（10 mg）溶于100 mL乙醇中，以制備不同質量濃度（10、20、30、40、50、60 μg/mL）的標準溶液。在652 nm波長處測定吸光度以繪制標準曲線。用乙醇稀釋后測定樣品溶液的吸光度。

1.3.7 酶活力測定

將一定質量濃度HRP溶液0.1 mL轉移至底物溶液中，該底物溶液包含1.4 mL 4-氨基安替吡啉溶液和1.5 mL H2O2溶液。隨后，每1 min記錄一次510 nm波長處溶液的吸光度，直到每分鐘內吸光度的增加達到穩定值。HRP活力通過式（6）計算：

式中：E510nm為510 nm波長處每分鐘吸光度的增加量；V為反應液的總體積/mL；ΔA為6.58，表示1個單位HRP能在1 min內使吸光度提高6.58；Ew為0.1 mL酶溶液中酶質量/mg。

1.4 數據統計與分析

在進行3 次重復實驗后，使用Excel 2010和Origin 9.0軟件進行統計分析，通過t檢驗進行單因素方差分析，后用Duncan法進行差異顯著性比較，P＜0.05，差異顯著。作圖使用Origin 9.0軟件。

2 結果與分析

2.1 17R4濁點的分析

溫敏聚合物濁點研究是構建溫敏聚合物-鹽ATPS的依據。17R4含量與濁點的關系如圖1所示，濁點會隨著17R4質量分數的增加而降低。由于膠束-膠束相互作用增加，膠束濃度增加從而使自由水成分相對減少，膠束則更容易團聚。濁點在0.1% 17R4時達到最高（81 ℃），在10% 17R4時達到最低（25.5 ℃）。為考察鹽對濁點的影響，向17R4溶液中加入一定量的3種鹽（(NH4)2SO4、K3C6H5O7、K2HPO4），并分別測量其濁點變化。結果顯示3種鹽均會降低17R4的濁點。受鹽析能力的影響[25]，體系中的鹽會與聚合物競爭水分子，使膠束脫水并增強膠束間的作用力。因此，鹽可以降低聚合物溶液的濁點溫度。此外，每種鹽對濁點的影響也不同，這3種鹽改變濁點的能力排序如下：(NH4)2SO4＞K3C6H5O7＞K2HPO4。

圖1 17R4溶液的濁點與含量及鹽的關系Fig. 1 Relationship between cloud point and concentration of 17R4 solution with different salts

2.2 17R4-鹽ATPS的液液相平衡行為

實驗測定了17R4-鹽ATPS的液液相平衡組成，如表1所示。當ATPS分相后，17R4富集在ATPS的上相，鹽富集在ATPS的下相。增加鹽或聚合物的用量均使系線長度延長，有利于ATPS的液液相分離。通過實驗還發現，當聚合物質量分數在7%～8%，鹽質量分數在13.2%～13.7%時的分相效果較好。從圖2可以看出，聚合物17R4質量分數8%的斜率均大于7%，相稀釋度更小，分相效果更佳。圖1表明鹽對17R4相分離的影響順序為(NH4)2SO4＞K2HPO4＞K3C6H5O7。由于鹽的水合作用比較強，與聚合物爭奪水分子，所以發生了相分離。對于此ATPS，無機鹽比有機鹽的分相效果強，(NH4)2SO4的鹽析能力最好。因此，實驗選擇8% 17R4-13.2%～13.7% (NH4)2SO4ATPS作為初級分離體系。

圖2 聚合物種類在25 ℃條件下對雙水相體系液液相平衡組成的影響Fig. 2 Effect of polymer type on the liquid-liquid equilibrium composition of two-phase aqueous system at 25 ℃

表1 17R4（w=7%/8%）-K3C6H5O7/(NH4)2SO4/K2HPO4ATPS在25 ℃的液液相平衡組成Table 1 Lliquid-liquid equilibrium data for 17R4 (w =7%/8%)-K3C6H5O7/(NH4)2SO4/K2HPO4 ATPSs at 293.15 K

2.3 9種模型化合物在17R4-鹽ATPS中的分配

由于植物中存在各種化學成分，有效分離和純化植物中的特定成分尤為困難。為選擇用于選擇性分離HRP的最佳ATPS，實驗選擇3種模型化合物（包括多糖、色素和蛋白質）研究ATPS作為初級純化步驟的效果。實驗探究HRP、BSA、CYT、ASP、SUC、FRU、CHL、ANT和CAR在17R4-鹽ATPS中的分配情況。實驗發現糖類物質主要分布在鹽富集相，而色素和蛋白質則傾向于分布在溫敏聚合物相。當固定17R4質量分數為8%時，3種鹽對9種模型化合物的分離效率影響順序為(NH4)2SO4＞K2HPO4＞K3C6H5O7。因此，選擇8% 17R4-(NH4)2SO4ATPS作為分離最佳體系。(NH4)2SO4質量分數的改變對9種模型化合物分離效果見圖3。(NH4)2SO4質量分數增加會導致其鹽析作用增強，從而將目標物驅動分配到聚合物富集相。但(NH4)2SO4質量分數過高也會導致鹽富集相的黏度降低，從而導致傳質效率和提取效率的降低。因此，實驗選擇8% 17R4-13.2% (NH4)2SO4ATPS作為HRP的初步純化體系。此時9種模型化合物在聚合物富集相的最佳提取效率分別為：（88.88±2.82）%（HRP）、（75.78±2.76）%（BSA）、（74.16±2.64）%（CYT）、（94.96±2.32）%（CHL）、（94.96±3.12）%（ANT）、（87.05±3.46）%（CAR）、（7.64±3.14）%（SUC）、（10.12±2.79）%（ASP）和（2.01±1.52）%（FRU）。

圖3 9種目標物在8%17R4-(NH4)2SO4ATPS中的分配效果Fig. 3 Partition efficiency of nine target compounds in 8%17R4-(NH4)2SO4 ATPS

2.4 17R4-Na3C6H5O7 ATPS進一步分離蛋白質和色素

將9種模型化合物分配到17R4-(NH4)2SO4ATPS后，蛋白質和色素分離富集到溫敏聚合物17R4相中。為了進一步分離色素和蛋白質，將電解質添加到ATPS中，然后將蛋白質反萃取到富鹽相中。根據先前關于電解質調節對ATPS中蛋白質分布影響的研究，通過添加電解質可以產生不同的靜電勢（相間勢）[26]。由于蛋白質的電荷狀態取決于pH值，可以通過操縱電解質和pH值調節蛋白質的分配。因此，研究Na3C6H5O7、Na2SO4和NaCl 3種電解質對蛋白質分配的影響。考慮到鹽析作用的影響，控制體系中電解質的濃度為100 mmol/L以消除鹽析作用的影響，同時具有最大化相間電位的作用[27]。為充分了解外加電解質對體系蛋白質分配的過程影響，以加入Na3C6H5O7為例進行詳細介紹。對疏水性的凝聚相具有較強的親和性，故向體系中加入Na3C6H5O7時，主要分配于體系下相，從而在兩相間產生相間電位差。在此電勢的作用下，體系中帶正電的物質會富集于體系的凝聚相，同時，體系中帶負電物質則被排斥到體系稀釋相。蛋白質的等電點大多為酸/中性左右，而當體系pH值為8.0時，蛋白質帶負電荷。此時，加入Na3C6H5O7所產生的相間電位會對蛋白質產生排斥作用，進入稀釋相。另外，當體系pH值為7（接近等電點）時，蛋白質幾乎不帶電，加入Na3C6H5O7產生的相間電位并不會對蛋白質在兩相間分配以及蛋白質回收率產生顯著影響。如圖4所示，在實際實驗中，加入Na3C6H5O7對蛋白質去除率造成的影響均與上述結論相符，從而驗證了前文論述的正確性，并證實了借助調節體系pH值與外加電解質調節荷電物質（如蛋白質）在兩相間分配的可行性。另外，還向體系中加入Na2SO4和NaCl以研究和Cl-對體系蛋白質和色素回收率的影響，結果如圖4所示。可知不同電解質離子的疏水性序列如下：該序列與文獻所述相符，從而論證了上述理論的準確性[28]。因此，當Na3C6H5O7添加到ATPS中時，大多數蛋白質從富含17R4的相進入富含鹽的相，因此通過這種反萃取操作實現了蛋白質和色素的分離。富鹽相中HRP、BSA和CYT 3種蛋白質的提取效率分別為（75.43±1.26）%、（73.80±1.73）%和（70.38±2.33）%，而鹽富集相中ANT、CAR和CHL3種色素的提取效率分別為（1.07±0.33）%、（1.37±0.21） %和（2.11±0.38）%。此步驟成功實現了從蛋白質中去除色素的目的。

圖4 外加電解質對體系蛋白質和色素回收率的影響Fig. 4 Influence of added electrolyte on recoveries of protein and pigment

2.5 苯硼酸親和吸附材料進一步純化HRP

課題組前期合成了一種樹枝狀“多價”苯硼酸親和磁性石墨烯復合材料d-PBA-GO@Fe3O4@PEI用于HRP的分離，選擇性分離效果令人滿意[22]。GO比表面積大，且表面含有豐富的官能團，擁有較強的生物相容性，可以被其他功能聚合物修飾改性。GO的這些優異特性為蛋白酶的吸附提供了空間以及活性位點，同時，Fe3O4具有特定的磁性結構和可回收特性，可重復利用，從而降低蛋白質分離的成本[29]。樹狀聚合物PEI用于增強磁性材料與糖蛋白的結合強度。由于其獨特的特性，豐富的官能團和易于修飾，樹枝狀PEI被選作磁性材料的主要支架。而且，PEI鏈上的豐富氨基還可以改善材料的親水性，并有助于減少非糖蛋白的吸附。同時，還在磁性材料表面連接了苯硼酸基團，使材料與糖蛋白特異性吸附。PEI已被證明是一種出色的支架，可以放大硼酸配體的數量，從而增加對糖蛋白的結合親和力。根據前期的討論結果[22]，d-PBA-GO@Fe3O4@PEI吸附HRP的最佳條件為：HRP質量濃度0.9 mg/mL、吸附pH 8.0、吸附溫度35 ℃以及吸附時間60 min。當吸附完全后，磁性回收吸附劑和酶，加入一定量的100 mmol/L乙酸溶液，懸浮1 h，用以洗脫吸附劑上的HRP。通過以上兩步ATPS純化和d-PBA-GO@Fe3O4@PEI進一步分離純化HRP后，計算得到HRP的提取效率為（70.30±2.08）%，BSA和CYT的提取效率分別為（8.11±0.35）%和（7.07±0.75）%，成功實現HRP的選擇性分離。

2.6 辣根中HRP的分離純化

通過將構建的集成化方法用于從辣根粗提液中選擇性分離HRP，驗證該集成方法對HRP分離純化的有效性。結果表明，純化因子為1.92，比活力為28.93 U/mg，萃取回收率為（65.20±1.15）%。此外，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）證明純化效果。如圖5所示，辣根粗提液中存在許多蛋白質雜質。17R4-(NH4)2SO4ATPS提取后，蛋白質雜質減少，如SDSPAGE的第L道所示。當加入d-PBA-GO@Fe3O4@PEI進一步吸附分離后，洗脫液中有明顯的HRP條帶，證明該集成化方法在從辣根中分離和純化HRP方面顯示出良好的性能。

圖5 辣根粗提取物中提取HRP的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of horseradish peroxidase extracted from crude horseradish extract

2.7 純化后HRP的結構分析

用紅外光譜和圓二色譜分析純化后HRP的結構變化。HRP的二級蛋白質結構出現在1 649 cm-1和1 541 cm-1的酰胺帶上[30]。從圖6a可以看出，純化后HRP和商品化HRP的酰胺帶峰位置相同，純化后HRP和商品化HRP的其他峰位也基本相似。如圖6b所示，作為HRP的共同特征，208 nm和222 nm處的負峰是典型的α-螺旋結構，而大約196 nm處的正峰屬于β-折疊結構。通過對比二者的光譜結構，可以充分證明本實驗的集成化方法對HRP結構沒有影響。

圖6 純化后及商品化HRP的紅外光譜（a）和圓二色譜（b）圖Fig. 6 FT-IR spectra (a) and CD spectra (b) of purified HRP and commercial HRP

3 結 論

本實驗構建了17R4-(NH4)2SO4/K2HPO4/K3C6H5O7溫敏雙水相萃取體系，探討并優化了用于純化蛋白質的條件；模擬辣根中未知的物質和環境研究9種目標物在雙水相體系種的分配情況，發現采用17R4-(NH4)2SO4ATPS在辣根粗酶液中初步分離純化HRP可得到（75.43±1.26）%的提取效率。最后在粗提液中加入d-PBA-GO@Fe3O4@PEI磁性材料選擇性吸附HRP，純化后的HRP純化因子為1.92，比活力為28.93 U/mg，萃取回收率為（65.20±1.15）%，得到了較為滿意的純化結果。