新型天冬氨酸激酶突變株構建及酶學性質表征

樊占青，劉曉婷，魏 貞，王哲人，王亞南，高 欣，閔偉紅

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

甲硫氨酸（Met）是一種不能在體內合成而必須由外界獲取的人體必需氨基酸[1]，參與生物體內的新陳代謝和蛋白質合成，是多種代謝物質的合成前體[2]。目前微生物發酵法是最有前景生產Met的方法[3]，但是由于生物體內代謝路徑多樣復雜，各種代謝物質彼此調控，所以該方法尚未完全實現工業化生產[4]。在生物體內，天冬氨酸經過一系列代謝合成Met，而天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）是該代謝途徑中的第一關鍵限速酶[5]，其活性同時受賴氨酸（Lys）和蘇氨酸（Thr）的協同反饋抑制[6]，導致碳流競爭激烈，Met合成供應減少，使得最終代謝產物Met不能大量積累[7-8]。目前研究發現，不同生物體內AK具有不同的存在形式，擬南芥（Arabidopsis）AK具有5 種形式，包括3種單功能AKs（AKI、AKII和AKIII）和2 種雙功能AK-高絲氨酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase，HSDH）[9-10]；大腸桿菌中含有1 種單功能AKIII和2 種雙功能AK-HSDHI、AK-HSDHII[11-12]，此外，在一些生物體中也存在著更簡單的抑制機制，詹氏酵母和嗜熱菌中只含有一種形式的AK[13]。本課題組首次發現北京棒桿菌天冬氨酸激酶（Corynebacterium pekinenseaspartate kinase，CpAK）是一種新型單體別構酶，且仍受下游產物Lys和Thr的協同反饋抑制[5]。

由于CpAK在代謝途徑中被下游產物協同反饋抑制，導致下游產物天冬氨酸族氨基酸產量不能大量積累，因此通過削弱或解除反饋抑制提高最終代謝產物產量成為研究熱點。目前，基因敲除[14]、基因過表達[15-17]、定點突變[18-23]等基因工程技術是改造AK的主要技術手段，其中，定點突變技術的應用比較成熟廣泛。Han Caijing等[5]利用定點突變技術削弱了下游產物Lys對CpAK的反饋抑制，獲得酶活力提高11.32 倍的突變體A380I，為Met產量積累提供了理論依據。也有學者對抑制劑Lys和Thr周圍結合位點和底物結合位點的周圍關鍵殘基進行突變研究，得到了AK活力顯著提高且反饋抑制作用明顯減弱的突變株R169P、R169Y、T379L和M372I/T379W，為強化AK代謝途徑中下游產物碳流量的積累、構建高產Met工程菌株提供了理論依據和技術支持[16-17,24]。

目前文獻報道對AK的突變改造主要圍繞Lys和Thr抑制劑周圍關鍵位點[20-26]，而對催化活性中心ATP以及底物結合位點的研究相對較少。AK的一般抑制機制已從先前研究中得出結論：效應子結合誘導從底物-ATP結合的松弛狀態（R狀態，緊密構象）過渡到無效的緊張狀態（T狀態，開放構象），因此底物和ATP結合位點的構象變化均會阻礙催化作用[27]。Li Changcheng等[28]對銅綠假單胞菌AK催化域中ATP結合位點D182和R184進行雙突變改造，獲得酶活力降低60%的雙突變株D182/R184A，證明ATP結合口袋的改變對AK活力的重要性。本研究選擇AK催化中心ATP周圍5 ?范圍內關鍵殘基絲氨酸（Ser227）位點，進行四突變株的構建，篩選獲得高酶活力、性狀良好的突變株，并結合分子動力學模擬，對其機制進行分析，旨在為優化AK代謝途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質粒與培養基

北京棒桿菌E31（吉林農業大學發酵工程實驗室保藏）提供本實驗AK基因；重組大腸桿菌突變株（pET-28a-T379N/A380C/G171I-AK）由吉林農業大學發酵工程實驗室提供；表達宿主大腸桿菌BL21（DE3）購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

本實驗選用的培養基均為LB培養基。液體LB培養基：0.5%酵母浸粉、1% NaCl、1%蛋白胨。固體培養基則在液體培養基中加入2%的瓊脂粉，溶于蒸餾水中，適宜濃度的NaOH溶液將其pH值調至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.2 試劑

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）凝膠試劑盒、卡那霉素（kana）、丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）北京鼎國昌盛生物技術有限公司；DpnI消化酶、LaTaq酶TaKaRa（大連）公司；質粒DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；非變性鎳柱及柱料美國GE公司；本實驗所用引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成，基因測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 儀器與設備

梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Eppendorf AG公司；DYY-6C核酸電泳儀北京六一儀器廠；瓊脂糖凝膠成像儀 德國耶拿分析儀器股份公司；Z36HK臺式低溫高速冷凍離心機 德國Hermle公司；SE260蛋白電泳儀 美國GE公司；SPECTRA Max酶標儀 美國Molecular Devices公司；WFH-201BJ蛋白印跡半干轉膜儀 美國Bio-Rad公司；Scientz超聲細胞粉碎儀 寧波新芝生物公司。

1.3 方法

1.3.1 定點飽和突變

首先通過Primer 5.0軟件進行突變位點的引物設計，上游引物：5’-CTGGAACTTGCTGCTGTTGGCNNNAAG ATTTTGG-3’；下游引物：5’-GCGCAGCACCAAAATCT TNNNGCCAACAGC-3’。由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

根據質粒DNA抽提試劑盒說明書提取T379N/A380C/G171I-AK的質粒，以其為模板進行梯度PCR擴增全質粒基因，反應條件為：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min（18個循環）；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3.2 轉宿主大腸桿菌BL21

1.3.1節完成PCR擴增，將產物用1%瓊脂糖核酸電泳驗證擴增成功。PCR突變產物用DpnI酶消化，反應體系為20 μL，依次加入10×T Buffer 2 μL、PCR產物2 μL、DpnI酶0.3 μL，最后用ddH2O補足，金屬浴37 ℃恒溫2 h。

消化結束，將2～4 μL產物轉入120 μL大腸桿菌BL21感受態中，冰浴30 min，42 ℃金屬浴熱激90 s，繼續冰浴5 min后加入900 μL不含kana的LB液體培養基，37 ℃、170 r/min搖床擴大培養2 h，5 000 r/min離心5 min后棄掉800 μL上清液，用剩余上清重懸菌體，將其均勻涂布于LB固體培養基（含kana），37 ℃倒置培養12～16 h。

1.3.3 高通量篩選及測序驗證

挑取成功轉入的單菌落于含kana的LB液體培養基中，180 r/min、37 ℃擴大培養12 h，加入1 mmol/L IPTG，適宜溫度、130 r/min誘導表達8 h后進行高通量篩選，方法見參考文獻[5]，挑取酶活力顯著提高的突變株加入10 mL試管培養基（含kana）于搖床180 r/min、37 ℃過夜擴大培養。將擴大培養后的突變株以菌液為模板，用克隆引物（AK引物，上游引物5’-GAATTCCATATGGC CCTGGTCGTACAGAA-3’，下游引物5’-GGAATTCTTA GCGTCCGGTGCCTGCAT-3’）進行PCR擴增驗證，反應條件為：94 ℃預變性1 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循環30 次，4 ℃保存[20]。將PCR產物進行1%瓊脂糖核酸電泳驗證，挑取目的條帶明亮的菌株送到生工生物工程（上海）股份有限公司，進行全質粒基因測序驗證。

1.3.4 AK分離純化及蛋白電泳驗證

測序驗證成功的突變株以2%接種量于試管培養基活化12 h，吸取2 mL活化的菌液加入到100 mL LB液體培養基培養1.5～2 h后，加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導表達8 h，于低溫高速冷凍離心機8 000 r/min離心，將上清液舍棄后收集菌體。參照朱云明等[29]實驗方法制備粗酶液及純化酶樣。用SDS-PAGE和Western Blot對粗酶樣及純化樣進行驗證，方法參考文獻[30]。

1.3.5 AK活力測定及動力學分析

AK活力以單位時間內單位質量的AK催化反應速率表示，單位為U/（mg·min），酶活力表示為1 000×A540nm。以L-天冬氨酸（L-Asp）為底物，在1 mL反應體系中加入酶樣純化液，1 mL反應體系為800 mmol/L KCl、10 mmol/LL-Asp、100 mmol/L Tris-HCl、800 mmol/L NH4OH、10 mmol/Lβ-巰基乙醇、10.4 mmol/L ATP、1.6 mmol/L MgSO4[25]，保持反應體系以及其他測定條件不變，改變底物濃度（0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16 mmol/L）反應30 min后，于540 nm波長處測其吸光度A540nm，通過Hill方程進行非線性擬合計算AK活力。

1.3.6 AK酶學性質分析

1.3.6.1 最適溫度

反應條件及反應體系不變，改變反應溫度（15、20、25、26、28、30、35、40、45、50 ℃），反應30 min后終止反應，測定酶活力，每個溫度檢測3 組平行，最高酶活力定義為100%。

1.3.6.2 最適pH值

反應條件及反應體系不變，改變反應體系中Tris-HCl緩沖液pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0），反應30 min后終止反應，測定酶活力，每個pH值檢測3 組平行，最高酶活力定義為100%。

1.3.6.3 穩定性

反應體系不變，選擇最適溫度和最適pH值，將酶樣純化液加入體系中，130 r/min搖床反應，間隔1 h取樣一次測酶活力，每組樣品檢測3 組平行，將0 h酶活力定義為100%。

1.3.6.4 底物抑制劑對AK活力的影響

反應體系不變，分別加入不同濃度（終濃度分別為0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L）的底物抑制劑，分別為Lys、Thr、Met、Lys+Thr、Lys+Met、Thr+Met、Lys+Thr+Met，測定抑制劑對AK活力的影響，對照組加入等量蒸餾水每組樣品檢測3 組平行，將對照組相對酶活力定義為100%。

1.3.7 分子動力學模擬分析

以3aaw和2hmf為結構模板，同源模建獲得AK三維結構，建模后丟失的原子通過VMD方法補充，同時通過局部的結構檢查確定His的質子態；借助VMD的solvate plugin程序添加水溶液環境，并添加Na+或Cl-平衡體系，力場參數使用charmm36。將篩選出的高酶活力突變株T379N/A380C/G171I/S227D進行不少于110 ns的NPT自由模擬（分子動力學），分析其酶活力提高機制。

在前期實驗室構建的PDB結構文件基礎上，通過Discovery Studio軟件分析Ser227位點突變前后與ATP及周圍殘基的作用力及殘基間距離的變化。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 ATP結合位點的篩選

通過Discovery Studio軟件對AK模型分析，Ser227位點是ATP附近5 ?范圍內的關鍵殘基；并且利用Clustal X軟件進行同源序列比對，Ser227位點是保守位點，如圖1所示。Han Caijing等[5]對CpAK突變體A380I進行100 ns分子動力學模擬，表明突變使A380I提高了ATP結合口袋處殘基Ieu220～Glu270的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值，與ATP交互作用變強，同時突變使ATP（N5）- Ser227（OG）中氫鍵占用率從31.74%增加到39.14%，ATP和CpAK之間氫鍵的占用比增多，增加了ATP和CpAK之間的結合，從而增強了CpAK的催化活性。因此本研究選擇Ser227位點，設想通過飽和突變使其與ATP形成氫鍵，增強ATP與CpAK的結合，達到提高AK活力的預期效果。

圖1 ATP結合位點的篩選Fig. 1 Screening of ATP binding sites

2.2 突變株構建

以T379N/A380C/G171I（含有質粒pET-28a-AK）為模板，在Ser227引物作用下PCR擴增進行定點飽和突變。PCR產物經1%核酸電泳驗證結果如圖2A所示，在7 000 bp處有明亮條帶，初步證明成功突變。取定量PCR產物經DpnI酶消化后轉入大腸桿菌感受態細胞（BL21）中，經過高通量篩選后獲得高酶活力突變株。將突變株活化后進行菌液PCR驗證，如圖2B所示，在1 000～2 000 bp處有明亮單一條帶，與目的基因CpAK長度1 266 bp相符，進一步證明目的基因成功大量復制。將篩選的高酶活力突變株送去測序，結果如圖2C所示，Ser227位點由殘基Ser突變為殘基Asp，最終證明突變株T379N/A380C/G171I/S227D構建成功。

2.3 SDS-PAGE和Western Blot驗證

圖3 SDS-PAGE（A）及Western Blot（B）結果Fig. 3 Results of SDS-PAGE (A) and Western Blot (B)

WT菌株和突變株經IPTG誘導表達目的蛋白，分別進行非變性鎳柱純化，將得到的粗酶樣和純化樣進行SDS-PAGE和Western Blot驗證，結果如圖3所示。在48 kDa處有明顯條帶，證明AK蛋白表達成功。Western Blot驗證結果表明，AK蛋白與抗體（His-tag27E8 Mouse mAb）特異性結合，純化樣是單一AK蛋白。

2.4 酶動力學分析

以不同濃度L-Asp為底物，對WT和突變株進行酶動力學分析，測定其酶活力。測定結果用Origin 9.0軟件進行非線性擬合，根據Hill方程V=VmaxSn/（Kn+Sn）得到WT和突變株的最大催化速率Vmax。動力學結果見圖4、表1，該突變株T379N/A380C/G171I/S227D的Km值減小為1.35 mmol/L，底物親和力增大，利于AK與底物的結合，從而提高其催化效率；Vmax值為242.05 U/（mg·min），較T379N/A380C/G171I（187.88 U/（mg·min））提高到1.28 倍，較WT AK（ 3.01 U/（mg·min））提高到80.41 倍，表明突變后AK的催化活力顯著提高。

圖4 WT和突變株的動力學分析Fig. 4 Kinetic analysis of WT and mutant strains

表1 WT AK和突變株的動力學參數Table 1 inetic parameters of WT AK and mutant strains

2.5 酶學性質表征

2.5.1 最適溫度

圖5 WT和突變株的酶學性質表征Fig. 5 Characterization of enzymatic properties of WT and mutant strains

由圖5A可知，WT AK最適催化溫度25 ℃，T379N/A380C/G171I AK最適催化溫度28 ℃，該突變株T379N/A380C/G171I/S227D最適催化溫度30 ℃，較WT和T379N/A380C/G171I分別提高5 ℃和2 ℃，表明突變增強了AK的耐熱性，有效提高了AK的最適溫度。當溫度高于30 ℃后，該突變株的酶活力仍然較高于WT和T379N/A380C/G171I，說明多次突變有利于AK的耐高溫性能的優化。

2.5.2 最適pH值

由圖5B可知，WT AK最適pH值為8.0，T379N/A380C/G171I AK最適pH值為9.0，該突變株T379N/A380C/G171I/S227D最適pH值為8.5。與T379N/A380C/G171I相比，該突變株最適pH值降低0.5，耐酸性提高，同時，pH值耐受范圍變大，這可能是Ser227位點由中性氨基酸Ser突變為酸性氨基酸Asp的緣故。在pH值為10時，該突變株的酶活力仍然保持在32%，較高于WT和T379N/A380C/G171I。

2.5.3 AK穩定性

相對酶活力下降到最初活力50%所用時間為酶的半衰期。選擇最適溫度和最適pH值，分別研究WT和突變株的穩定性。如圖5C所示，WT AK的半衰期為4.9 h，而T379N/A380C/G171I AK的半衰期為3.1 h，該突變株T379N/A380C/G171I/S227D的半衰期為3.9 h。與WT AK相比，該突變體AK在反應初（0～3 h）和反應末（7～10 h）相對酶活力顯著高于WT AK。與T379N/A380C/G171I AK相比，該突變株AK半衰期延長0.8 h，且相對酶活力幾乎始終高于T379N/A380C/G171I AK。

2.5.4 底物抑制劑對AK活力的影響

由表2可知，WT AK受Thr和Lys兩種抑制劑的協同反饋抑制，而Met對其抑制作用相對較弱。隨著Thr和Lys濃度的增加，抑制作用明顯增強，當Lys濃度增加到10 mmol/L時，對WT AK的抑制率大約達到39%。當兩種抑制劑組合濃度為10 mmol/L時，WT AK抑制率最高為45.04%。當3種抑制劑組合濃度為10 mmol/L時，WT AK 抑制率僅比Lys+Thr組合時高4.15%，再次說明AK受Met抑制作用相對較弱，而主要受Thr和Lys的抑制，這與先前Yoshida等[31]研究一致。突變后，AK的被抑制作顯著減弱，甚至被明顯激活。在10 mmol/L Thr+Met、Lys+Met和Thr+Lys+Met不同組合的情況下，AK的催化活性被顯著激活，T379N/A380C/G171I AK的相對酶活力分別為98.81%、100.14%和108.46%，而該突變體相對活力提高更為顯著，分別為109.37%、121.25%和143.35%，且呈現明顯的濃度計量依賴，這與2.4節動力學分析結果（Km減小，Vmax增大）相對應，進一步證明本研究位點Ser227是影響AK活力的關鍵殘基位點，為后期工程菌的構建提供理論依據。

表2 不同底物抑制劑條件下WT和突變株的相對酶活力Table 2 Relative enzyme activity of WT and mutant strains under different substrate inhibitor conditions%

2.6 突變體的空間結構分析

以構建的AK模型為基礎，通過Discovery Studio軟件對Ser227位點突變前后與ATP和其周圍殘基的作用力以及距離變化進行分析。如圖6A、B所示，突變前Ser227殘基與ATP及周圍氨基沒有直接作用，突變后，S227D殘基側鏈向ATP延伸，與ATP和I229殘基產生氫鍵，氫鍵占有率增加，連接更加緊密，更容易促進催化反應發生，這與Han Caijing等[5]研究報道一致；如圖6C、D所示，突變前Ser227殘基與ATP距離為2.953 ?，突變后距離縮短為2.562 ?。突變后，距離縮短，作用力增強，從而提高酶活力。

圖6 Ser227位點突變前后成鍵變化Fig. 6 Bonding changes before and after mutation at Ser227

2.7 分子動力學模擬

對該突變體T379N/A380C/G171I/S227D AK+Asp+ATP+Lys+Thr復合物進行分子動力學模擬研究，揭示其活性提高機制。如圖7A所示，復合物主鏈C骨架RMSD平均值為0.90 nm，體系在19 ns處達到平衡界點，之后一直平衡穩定于0.9 nm左右，說明體系在整個模擬過程中始終保持穩定狀態[32]。Rg是在模擬過程中根據整個蛋白體積和性狀計算出的蛋白回旋半徑，反映了體系在模擬過程中的柔韌性，如圖7B所示，復合物在整個模擬過程中基本平穩，平均Rg收斂于26.66 ?，整個體系柔韌性良好，這可能是由于突變使得蛋白結構發生重排趨于穩定狀態。蛋白表面溶劑可及表面積（solvent accessible surface area，SASA）是描述蛋白質親疏水性的重要參數[33]，對蛋白的空間構象及其穩定性具有重要意義，由圖7C可知，復合物的模擬軌跡沒有較大波動，一直保持平穩，整個模擬過程平均SASA值為222.56 nm2，表明突變使得T379N/A380C/G171I/S227D 的親水性增強，蛋白表面溶劑的親和能力增強，從而影響其催化活性，這可能是由于突變后Asp殘基側鏈像ATP延伸，同時形成氫鍵。以上3個參數都是在蛋白質整體上進行分析研究，而均方根波動（root mean square fluction，RMSF）是從整個模擬催化過程單個氨基酸殘基的相對波動情況進行分析[34]。由圖7D可知，整個模擬過程中，復合物體系都表現出很好的靈活性，利于催化反應。

圖7 T379N/A380C/G171I/S227D AK復合物分子動力學模擬分析Fig. 7 MDS analysis of T379N/A380C/G171I/S227D AK complex

3 討 論

大量研究報道對AK的抑制劑結合位點進行突變，可以有效減弱或解除抑制作用，顯著提高酶活力。Gao Yunna等[24]對抑制劑Lys周圍結合位點M372和T379關鍵殘基進行定點突變，獲得酶活力提高16.51 倍的雙突變體M372I/T379W AK，并通過分子動力學模擬對其機制進行分析。Min Weihong等[19]等通過虛擬篩選獲得一個底物結合和催化反應的關鍵殘基位點R169，通過定點突變技術，改造其空間結構，得到了酶活力提高4.71 倍的突變株R169Y。表明底物結合和催化反應位點的改造對AK活力提高有重要影響。魏貞等[35]研究通過對ATP周圍結合位點Y198和D201進行定點飽和突變，獲得性能優良、酶活力提高18.26 倍的雙突變株Y198N/D201M AK。因此本研究在前期研究的基礎上，繼續對ATP結合位點進行突變改造，獲得酶活力顯著提高的突變體，進一步表明ATP結合位點的重要性。

本研究推測T379N/A380C/G171I/S227D酶活力提高的原因是T379N/A380C/G171I突變株基礎上繼續突變，引起ATP結合口袋重排，同時Ser227位點與ATP由非鍵作用變為直接氫鍵作用力，致使AK與ATP和底物結合更緊密，反應體系更加穩定，導致在催化過程中競爭性抑制劑不足以與底物ASP以及ATP競爭，從而減弱或解除抑制作用，顯著提高AK催化活力，使得碳流競爭減弱，更多的流向下游代謝途徑，進而達到高產下游代謝產物的目的，為后期構建高產蛋氨酸工程菌提供理論支持。

4 結 論

本研究對CpAK中催化域ATP周圍關鍵殘基Ser227位點進行定點飽和突變，以達到減弱或解除抑制，酶活力顯著提高并獲得優良多突變株的目的。通過軟件Primer Premier 5 進行突變引物設計，以T379N/A380C/G171I AK為模板，經1%核酸電泳驗證，成功構建突變株T379N/A380C/G171I/S227D。并將其轉入宿主大腸桿菌BL21表達，經SDS-PAGE和Western Blot驗證AK成功表達。動力學分析結果表明，該突變株的Vmax較T379N/A380C/G171I提高到1.28 倍，較WT AK提高到80.41 倍，酶活力顯著提高，并且與底物的親和力也明顯增大，有利于與底物的結合。酶學性質研究表明：該突變株T379N/A380C/G171I/S227D的最適反應溫度增至30 ℃，較WT和T379N/A380C/G171I分別提高5 ℃和2 ℃；最適pH值為8.5，較T379N/A380C/G171I（pH 9.0）減小0.5；半衰期為3.9 h，較T379N/A380C/G171I延長0.8 h；且在不同濃度、不同組合抑制劑存在時，該突變株表現出明顯的激活作用，抑制效果減弱顯著，相對酶活力最高達143.35%，這與動力學結果相符。同時分子動力學模擬從個體和單個氨基酸殘基的變化，其中包括氫鍵的形成以及復合物系統中的分子間作用力，對酶活力提高進一步說明，為構建高產工程菌提供參考。