哈密瓜脫氫抗壞血酸還原酶基因的鑒定及冷脅迫表達分析

宋 文，張 琴，寧 明，周發科，楊新泉，單春會，唐鳳仙

（石河子大學食品學院，新疆特色果蔬貯藏加工教育部工程研究中心，新疆 石河子 832000）

哈密瓜（Cucumis melovar.saccharinus）屬于葫蘆科黃瓜屬甜瓜亞屬的一個品種，得名于清代康熙年間，古稱 “甘瓜”、“甜瓜”，維吾爾語稱“庫拱”[1-2]。新疆栽培哈密瓜已有4 000多年的歷史，不僅是我國甜瓜栽培歷史最悠久、種植面積最大、品種資源最豐富、品質最佳的地區，也是世界甜瓜種植基地之一，其在吐哈盆地獨特的地理、生態條件下，通過世代相傳的特殊栽培技術，形成了哈密瓜特有的品質[2]。新疆哈密瓜不僅美味可口，而且營養豐富，富含糖分、果膠物質、纖維素、蘋果酸、維生素以及鈣、磷、鐵等元素，適宜于腎病、胃病、咳嗽痰喘、貧血和便秘患者。作為我國新疆地區主要的經濟作物之一，哈密瓜對當地經濟發展起重要作用。由于新疆地域遼闊、交通運輸不便，因此低溫貯藏是使用廣泛的果蔬保鮮方式之一[3]。然而長時間的低溫貯藏會導致哈密瓜發生冷害，加快哈密瓜表皮的凹陷、褐變以及腐爛，從而影響經濟效益[4]。因此從分子生物學角度研究哈密瓜的耐冷機制對提高哈密瓜耐冷性具有重要意義。

冷脅迫是影響植物生長發育的主要環境因素之一，會刺激植物在體內產生并積累活性氧、丙二醛、過氧化氫等有毒物質，破壞細胞質膜，引起細胞內代謝紊亂，最后導致細胞與組織的死亡，從而影響植物的生長[5-6]。植物在進化過程中產生了一系列復雜的保護機制適應環境脅迫對其產生的影響，其中谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）抗氧化系統屬于植物體內氧自由基清除體系的主要防御措施之一[7]。

谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）是一種多功能酶，可以催化GSH和疏水及親電底物的共價結合，形成共軛物，隔離在液泡或轉移到質外體，從而對內源和外來有害物質進行降解，以達到降低細胞損害程度的作用[8-9]。典型的GST蛋白含有兩個功能位點：一個是N-末端結構域中的GSH結合位點（G-位點），另一個是C-末端共底物結合結構域（H-位點）[10]。通常GST被分為7 類，包括Tau（GSTU）、Phi（GSTF）、Lambda（GSTL）、Theta（GSTT）、Zeta（GSTZ）、四氯氫醌脫鹵素酶（tetrachlorohydroquinone dehalogenase，TCHQD）和脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）[11]。作為植物特有的一類GST，DHAR可將GSH作為還原劑，催化脫氫抗壞血酸（dehydroascorbic acid，DHA）還原為抗壞血酸（ascorbic acid，AsA），從而保護植物組織免受活性氧的損害[12]。

前期研究發現，與不耐冷型哈密瓜相比，耐冷型哈密瓜GST相關差異蛋白在冷脅迫初期顯著上調表達[3]。本研究在生物信息學的基礎上對哈密瓜DHAR基因（CmDHAR）進行鑒定分析，隨后利用實時反轉錄聚合酶鏈式反應（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，real-time RT-PCR）技術分析冷脅迫下的基因表達情況，以期為進一步揭示DHAR基因在哈密瓜抵御冷脅迫過程中參與的反應機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

耐冷型哈密瓜“伽師瓜-310”（JS）與不耐冷型哈密瓜“金皇后-308”（GE）果實，2019年7—9月采購自新疆石河子121團農場。樣品成熟度為八成熟、大小均勻、無機械損傷及病蟲害。采后套泡沫網套直接置于（0.5±0.5）℃冷庫中貯藏0、6、12、18、24 d，從果實赤道周圍3個位置的外表皮內層1～2 mm處采集果肉1.2～1.5 g并立即用液氮冷凍，隨后保藏于-80 ℃超低溫冰箱。每個品種每次實驗選取3個果實，進行3 次生物學重復。

Plant DHAR ELISA檢測試劑盒、Plant AsA ELISA檢測試劑盒 上海優選生物科技有限公司；UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

WD-2102A多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機 安徽中科中佳儀器有限公司；ZXRD-7080恒溫鼓風干燥箱 河北潤創科技開發有限公司；LightCycler480 II型熒光定量PCR儀瑞士Rotkreuz公司；FA201S萬分之一分析天平 上海天平儀器廠。

1.3 方法

1.3.1CmDHAR基因生物信息學分析

從哈密瓜數據庫Cucurbit Genomics Database（http://cucurbitgenomics.org）中獲取哈密瓜（Melon（DHL92）genome 3.5.1）的氨基酸序列及結構文件。從擬南芥（Arabidopsis thaliana）數據庫TAIR（https://www.arabidopsis.org）獲取擬南芥DHAR（AtDHAR）的氨基酸序列及結構文件。從EnsemblPlants（http://plants.ensembl.org/index.html）獲取水稻（Oryza sativa Japonica）DHAR（OsDHAR）的氨基酸序列及結構文件。隨后通過與擬南芥和水稻DHAR氨基酸序列進行多序列比對、篩選，鑒定得到了哈密瓜的DHAR基因。

通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中的Protein BLAST工具鑒定篩選獲得CmDHAR的可靠性。利用在線工具CD-search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）鑒定CmDHAR基因的保守功能域；利用ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）對CmDHAR成員編碼蛋白的分子質量、等電點和氨基酸長度進行分析；使用Softberry（www.softberry.com）對CmDHAR成員進行亞細胞定位；使用Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進行多序列比對分析；使用MEGA7軟件，采用鄰比法（Neighborjoining，NJ）構建物種間系統進化樹；使用MCScanX和TBTools（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）完成共線性分析[13]；使用MEME（http://meme-suite.org）對CmDHAR功能基序進行分析；使用PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對CmDHAR順式作用元件進行預測；使用STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl）對CmDHAR與哈密瓜其他GST家族蛋白之間的相互作用進行分析；SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）用于對CmDHAR的蛋白質三級結構進行預測；使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）軟件對CmDHAR進行分析[14]。

1.3.2 CmDHAR活力及AsA含量測定

設置標準品孔和樣本孔后按照ELISA檢測試劑盒使用說明書進行操作，在450 nm波長下使用酶標儀測定OD值，通過標準曲線計算樣品CmDHAR活力及AsA含量。

1.3.3 哈密瓜總RNA提取

采用UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒分別從哈密瓜表皮內層1～2 mm處的果肉提取總RNA。使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 Real-time RT-PCR序列Table 1 List of primer sequences used for real-time RT-PCR

1.3.4CmDHAR基因的real-time RT-PCR驗證

以GAPDH（LOC103484230）為內參基因，選取CmDHAR基因，通過real-time RT-PCR對其在冷脅迫下的基因表達水平進行測定。利用SYBRGreen染料法在ABI2700系統上開展real-time RT-PCR檢測。反應條件如下：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s；60 ℃退火30 s，65 ℃延伸25 s（40 個循環），進行3 組生物學重復，基因的表達量采用2-ΔΔCt方法計算。

1.4 數據分析

使用Excel 2016、SPSS 19.0和Origin軟件進行數據處理和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 CmDHAR基因的基本信息

將篩選獲得的2個CmDHAR基因，根據GST系統命名法分別命名為CmDHAR1（MELO3C020204T1）與CmDHAR2（MELO3C023826T1）。由表2可知，2個CmDHAR基因編碼蛋白氨基酸的長度分別為CmDHAR1（297 aa）與CmDHAR2（206 aa），等電點分別為CmDHAR1（8.67）與CmDHAR2（5.99），分子質量分別為CmDHAR1（33 082.9 Da）與CmDHAR2（22 891.6 Da）。亞細胞定位結果表明，2個CmDHAR基因主要位于葉綠體中。染色體定位顯示CmDHAR1位于哈密瓜6號染色體，CmDHAR2位于哈密瓜10號染色體。此外，CD-search結果表明，2個哈密瓜CmDHAR均包含可以結合GSH的GST-N末端功能結構域（CmDHAR1：1～297；CmDHAR2：3～203）。

表2 哈密瓜及其他物種DHAR基因基本信息Table 2 Physicochemical properties of DHAR genes in Hami melon and other species

2.2 CmDHAR系統進化與多序列比對分析

基于NJ構建的系統進化樹顯示，CmDHAR1與Q8LE52AtDHAR2為直系同源基因；CmDHAR2與Q9FWR4AtDHAR1為直系同源基因。結果表明，相比于OsDHAR，CmDHAR與AtDHAR之間的同源性更高（圖1）。

圖1 CmDHAR的系統進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of CmDHAR

基于系統進化樹分析，將CmDHAR的氨基酸序列與AtDHAR和OsDHAR的氨基酸序列進行多序列比對分析。圖2表明，CmDHAR基因與AtDHAR和OsDHAR基因之間的氨基酸序列保守性較高，說明CmDHAR與AtDHAR和OsDHAR在抵御脅迫過程中具有類似的功能[15-16]。此外，在CmDHAR的蛋白中還找到了12個GSH結合位點（G-site）與9 個磷酸化位點。

圖2 哈密瓜與其他DHAR的蛋白氨基酸序列比對分析Fig. 2 Multiple sequence alignments of DHAR from Hami melon and other species

2.3 CmDHAR基因結構分析

由圖3可知，CmDHAR基因包含6個外顯子與6個保守基序，這與Q8LE52AtDHAR2和水稻DHAR的基因結構相似，再次證明DHAR基因的高度保守性，說明它們在功能上具有一定的相似性[17]。除了CmDHAR2，其他DHAR均包含motif 5，表明在進化過程中CmDHAR2缺失了這段氨基酸序列，也說明CmDHAR在進化過程中會存在一定的差異[18]。

圖3 哈密瓜與其他植物DHAR的基因結構（A）與功能基序（B）預測Fig. 3 Gene structure (A) and motif (B) prediction of DHAR in Hami melon and other plants

PlantCare預測結果表明CmDHAR基因包含10 種順式作用元件（表3），它們可以分為3 大類：脅迫相關作用元件（WUN-motif、MBS與W box）、植物激素作用元件（TCA-element、TGA-element、TGACG-motif與CGTCA-motif）及光反應作用元件（GT1-motif、I-box與MRE）[19-20]。CmDHAR1包括TGA-element、TGACG-motif、CGTCA-motif等植物激素作用元件與光反應作用元件GT1-motif和MRE。有研究表明植物激素、光合作用等在調節植物生長發育、抵御脅迫方面起到關鍵作用[5,21]。CmDHAR2包括脅迫相關作用元件WUN-motif、MBS和W box，植物激素作用元件TCA-element及光反應作用元件I-box。其中WUN-motif作用元件與抵御冷脅迫相關[22]，MBS作用元件是抗逆因子MYB的結合位點[23]。綜上所述，推測CmDHAR在抵御脅迫方面發揮著重要作用。

表3 哈密瓜CmDHAR基因順式作用元件Table 3 Cis-elements of CmDHAR genes in Hami melon

2.4 CmDHAR共線性分析

為進一步了解DHAR的進化關系，利用MCScanX和TBtools軟件對葫蘆科植物的DHAR基因進行共線性分析。圖4說明CmDHAR基因與其他葫蘆科植物中的DHAR基因之間存在明顯的共線性關系。哈密瓜與西瓜存在1 對同源基因對，與黃瓜存在2 對同源基因對，與西葫蘆、筍瓜和南瓜之間各存在3 對同源基因對，說明在物種進化過程中，哈密瓜與西葫蘆、筍瓜和南瓜更為接近。此外，CmDHAR2與其他5個物種至少存在1 對同源基因對，推測CmDHAR2在這6個物種分化前已經存在，也證明CmDHAR2在進化過程中十分重要。

圖4 哈密瓜與其他物種DHAR的共線性分析Fig. 4 Synteny analysis of DHAR from Hami melon and other species

非同義突變頻率（Ka）與同義突變頻率（Ks）的比值結果表明，8 對同源基因對的Ka/Ks＜1，說明它們在進化過程中發生了純化選擇，避免了對自身不利的變異（表4）[24-25]。基因倍增時間估算結果表明，這8 對同源基因對倍增的時間大約發生在0.65～3.5百萬年前。

表4 哈密瓜及其他物種DHAR基因復制分析Table 4 Duplication analysis of DHAR genes in Hami melon and other species

2.5 CmDHAR的蛋白互作分析

蛋白質之間通過相互作用在生物體內行使其相應的生物學功能[26]。蛋白-蛋白網絡互作分析結果表明（圖5），CmDHAR成員與其他哈密瓜GST成員之間相互作用效果明顯。因此推測，在響應脅迫過程中，DHAR可以有效調節其他家族蛋白共同發揮作用，參與一系列生化反應幫助哈密瓜抵御脅迫。CmDHAR與其他哈密瓜GST家族蛋白的具體互作機制將在日后進行深入研究。

圖5 CmDHAR及其他GST家族蛋白之間互作網絡圖Fig. 5 Protein-protein interaction networks of CmDHAR with other CmGST members in Hami melon

2.6 CmDHAR三級模型的預測

蛋白質二級結構預測結果表明CmDHAR主要包括α-螺旋、無規卷曲、延伸鏈和β-轉角4 種構象，其中在CmDHAR1中：α-螺旋（43.10%）、無規卷曲（42.76%）、延伸鏈（10.44%）和β-轉角（3.70%）；在CmDHAR2中：α-螺旋（45.63%）、無規卷曲（38.83%）、延伸鏈（9.71%）與β-轉角（5.83%）。

基于同源建模法，在SWISS-MODEL中以毛果楊DHAR（ID：5mye.1.A；5n9u.1.A）為模板[27]，分別預測了CmDHAR1與CmDHAR2的蛋白三級結構，其中CmDHAR2與5n9u.1.A的序列相似性為73.53%，GMQE為0.80，QMEAN為-2.69，說明模板能較好地擬合CmDHAR2的三維結構[28]。ProQ三級模型質量評估結果表明CmDHAR2的LGscore為4.375，MaxSub為0.366，證明模型預測的可靠性較高[29]。圖6表明，CmDHAR2蛋白主要由α-螺旋（紫色）、無規卷曲（白色）、延伸鏈（黃色）和β-轉角（青色）構成。在CmDHAR2蛋白中找到了12個GST-N末端功能結構域的GSH結合位點（G-site），包括20C、22F、25R、44L、47K、58G、59K、60V、61P、72D、73S與202K。其中，20C、22F、25R、72D和73S 位于α-螺旋；58G、59K 與202K位于無規卷曲；60V與61P 位于延伸鏈；44L與47K位于β-轉角。22F參與疏水互作；25R、60V、61P、72D與73S構成氫鍵；47K構成鹽橋。這12個G-sites均位于CmDHAR2蛋白的表面，有利于CmDHAR2與GSH的結合[19]。

圖6 CmDHAR2蛋白質三級模型預測Fig. 6 Deduced 3D structure of CmDHAR2

2.7 CmDHAR基因響應冷脅迫的表達分析

由圖7可知，低溫貯藏對GE的影響更大。在冷藏第12天時，GE表皮開始出現褐變并產生凹陷，隨著貯藏時間的延長，GE的冷害程度越來越嚴重。相比于GE，JS在第18天表皮開始產生凹陷，受冷害影響的程度較小。由此可知，在響應低溫脅迫時，JS與GE內部抵御氧化脅迫體系的差異性決定了它們在貯藏過程中品質變化的差異性。

圖7 低溫貯藏過程中哈密瓜外觀狀態Fig. 7 Appearance of Hemi melon fruits after cold storage

DHAR與AsA循環系統在植物抵御氧化脅迫過程中具有重要作用[30]。從圖8可以看出，隨著貯藏時間的延長，耐冷型JS和不耐冷型GE果實中CmDHAR活力呈現先上升后下降的趨勢。在0～12 d，JS中的CmDHAR活力均高于GE，且在第12天時差異極顯著（P＜0.01），隨后酶活力逐漸降低。在GE中，CmDHAR活力在第18天達到最高值，隨后活力下降（圖8）。AsA含量隨貯藏時間延長逐漸降低，但其在JS中的含量高于GE，說明在響應低溫脅迫過程中，AsA扮演著重要角色[31]。結果表明，CmDHAR活力快速、高水平的表達有利于提升哈密瓜對低溫環境的適應能力，從而降低冷害的損傷，能夠較好地維持哈密瓜的商品價值[32]。

圖8 低溫貯藏過程中CmDHAR活力和AsA含量的變化Fig. 8 Effect of cold storage on CmDHAR activity and AsA content in Hemi melon

利用real-time RT-PCR驗證哈密瓜CmDHAR1與CmDHAR2基因在冷脅迫下的表達情況（圖9）。隨著貯藏時間的延長，CmDHAR1和CmDHAR2均為上調表達。與GE相比，CmDHAR1與CmDHAR2在JS中的相對表達量更高，說明CmDHAR基因在響應冷脅迫過程中的重要性，它的大量表達可以延緩冷害發生[33]。

圖9 低溫貯藏過程中CmDHAR基因表達的變化Fig. 9 Effect of cold storage on the expression levels of CmDHAR genes

2.8 CmDHAR GSEA

基于基因表達結果，使用GSEA對CmDHAR進行功能注釋，結果表明CmDHAR的高表達與結構分子活性、大分子復合物、細胞膜封閉內腔以及抗氧化活性等生物學功能顯著關聯（圖10）。GSEA結果說明在冷脅迫下，CmDHAR可以通過參與上述生物學過程調節生化反應，從而響應冷脅迫。

圖10 CmDHAR 基因GSEA功能富集結果Fig. 10 GSEA analysis of CmDHAR genes

3 討 論

DHAR屬于GST中的一類抗氧化酶，具有谷胱甘肽依賴性硫醇轉移酶和DHAR活性，是AsA循環系統的關鍵組成部分，參與氧化還原穩態，可以清除氧化應激下產生的活性氧自由基[34-35]。Noshi等[36]研究發現AtDHAR1在擬南芥抵御光氧化脅迫中起關鍵作用。Dixon等[35]認為AtDHAR參與氧化還原反應，并且在清除活性氧自由基過程中發揮重要作用。Ushimaru等[37]將水稻中OsDHAR1基因提取并在擬南芥中進行表達，結果發現與野生品種（空白對照組）相比，導入OsDHAR1基因的擬南芥耐鹽性有所提高。Yin Guangkun等[38]研究發現OsDHAR1活力的下降會導致水稻更容易受到活性氧的損害。Loi等[30]對馬鈴薯進行外源施加霉菌毒素處理，實驗結果表明處理組的DHAR、DHA及GSH含量有所提升，表明馬鈴薯DHAR在參與響應氧化脅迫的過程中發揮重要作用。

本研究對2個CmDHAR基因進行鑒定并研究了冷脅迫下的酶活力及基因表達水平，確定了CmDHAR基因在響應冷脅迫過程中扮演重要角色。根據CmDHAR在染色體的分布位置將其分別命名為CmDHAR1和CmDHAR2。CmDHAR1位于哈密瓜6號染色體，CmDHAR2位于哈密瓜10號染色體。系統進化樹結果表明CmDHAR基因與AtDHAR基因的同源性更高。多序列比對結果表明CmDHAR基因的GST-N末端功能結構域在進化過程中序列保守性較高，因此更有利于G-site與GSH的結合[39-40]。CmDHAR基因與擬南芥和水稻中參與抗氧化過程的DHAR基因的氨基酸序列保守性較高，說明CmDHAR基因在抵御脅迫過程中具有相似的功能。基因結構分析結果表明CmDHAR包含6個外顯子、6個保守基序、3大類順式作用元件，由于結構上是保守的，再次證明CmDHAR與擬南芥和水稻DHAR具有相似的功能[15-16]。共線性分析說明在葫蘆科植物中，哈密瓜與西葫蘆、筍瓜和南瓜在物種進化過程中更為接近，同源基因對倍增的時間大約發生在0.65～3.5百萬年前。蛋白互作分析表明CmDHAR成員與其他哈密瓜GST成員之間聯系緊密，說明CmDHAR在調節各類蛋白共同發揮作用方面發揮重要作用[23,41]。蛋白質三級結構預測結果表明CmDHAR2主要由α-螺旋、無規卷曲、延伸鏈和β-轉角等結構構成。鑒定到的12個GSH結合位點位于蛋白質表面，這在結構上更有助于CmDHAR2與GSH的結合。冷脅迫下，耐冷型JS中的CmDHAR活力、AsA含量及CmDHAR基因表達量明顯高于不耐冷型GE。GSEA功能富集分析顯示CmDHAR通過參與一系列生物學過程響應冷脅迫，表明其在哈密瓜響應冷脅迫的機制中十分重要。未來將會對CmDHAR基因在冷脅迫過程中的具體代謝及調控機制做進一步研究。