特異性水解αs1-酪蛋白過敏原IgE作用表位aa 83～105的蛋白酶篩選

劉 迪，呂曉哲，叢艷君,*，張倩倩，李鄰峰，梁 萌，高吉安，邱學(xué)宇

（1.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；2.北京友誼醫(yī)院皮膚科，北京 100050）

食物過敏已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的健康問題，其發(fā)病率不斷上升，影響了全球6%～13%的人口，其中約1/3由牛乳過敏引起[1-2]。我國最新流行病學(xué)調(diào)查表明，約有2.69%的嬰幼兒對牛乳過敏[3]。在過去十年中，世界范圍內(nèi)牛乳過敏的發(fā)病率不斷上升，其原因仍不清楚，推測與嬰兒用牛奶配方粉喂養(yǎng)的比例增加有關(guān)[4]。在食品領(lǐng)域，解決這一問題最主要的方法是通過食品加工方式（如熱處理、酶解、發(fā)酵等）破壞或修飾牛奶過敏原的結(jié)構(gòu)，開發(fā)低致敏嬰幼兒配方粉[5]。

牛乳αs1-酪蛋白引起過敏的本質(zhì)原因是B細(xì)胞作用表位的存在。Chatchatee等[6]以牛乳過敏患者血清為探針，識別牛乳αs1-酪蛋白作用表位，發(fā)現(xiàn)有9 個(gè)IgE和6個(gè)IgG抗體結(jié)合表位，其中序列aa 69～78和aa 173～194為優(yōu)勢IgE結(jié)合表位。Spuergin等[7]用牛乳過敏患者混合血清識別αs1-酪蛋白IgE作用表位序列為aa 19～30、aa 93～98和aa 141～150。部分水解乳蛋白質(zhì)水解物雖然已經(jīng)被應(yīng)用于嬰兒配方奶粉的生產(chǎn)，但是由于蛋白酶水解過敏原作用表位缺乏特異性，使得乳蛋白質(zhì)水解物依然具有致敏性[8-9]，此外，乳蛋白質(zhì)水解物會(huì)產(chǎn)生大量的苦味肽，因此篩選特異性水解過敏原作用表位的蛋白酶具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究綜合考慮國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的αs1-酪蛋白作用表位序列及課題組前期研究結(jié)論，以SEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSER為半抗原，偶聯(lián)牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）制備完全抗原后，免疫BALB/c小鼠，制備單克隆抗體，建立間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定方法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），篩選有效水解過敏原作用表位的蛋白酶，同時(shí)制備αs1-酪蛋白單克隆抗體作為對照。以期為新型低致敏性嬰兒配方奶粉的開發(fā)提供研究思路與參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

αs1-酪蛋白作用表位 杭州中肽生化有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 西隴化工股份有限公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 天根生化科技（北京）有限公司；羊抗鼠IgG 北京友誼中聯(lián)公司；96 孔酶標(biāo)板北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜 美國Millipore公司；Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考馬斯亮藍(lán)、吐溫-20、30%過氧化氫、三氯乙酸、乙腈、乙醇、三氟乙酸、N-乙酰半胱氨酸國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、β-巰基乙醇、BSA、二甲基亞砜、氨基黑、4-氯-1-萘酚、甘油、胃蛋白酶、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺、咖啡因、αs1-酪蛋白（純度≥70%） 美國Sigma公司；L-酪氨酸、福林試劑、乳酸鈉、鄰苯二甲醛、L-亮氨酸 上海源葉生物技術(shù)公司；乳酸 北京百靈威科技公司；堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 丹麥諾維信公司；蛋白酶M 日本天野酶制劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；SH-2磁力攪拌器 北京東方開物科學(xué)器材公司；BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；KHB ST-360酶標(biāo)儀 上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；DYY-7C型電泳儀、電熱恒溫水浴鍋 北京市六一儀器廠；PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 作用表位的合成、純化、鑒定及完全抗原的制備與鑒定

采用Fmoc固相肽合成法，將C-末端氨基酸連接到Wang樹脂上，采用常規(guī)Fmoc法進(jìn)行逐步縮合。合成結(jié)束后，用強(qiáng)酸將序列從固相載體上切割下來，經(jīng)HPLC純化，質(zhì)譜鑒定，冷凍干燥后備用[10]。

采用HPLC和質(zhì)譜進(jìn)行分析。色譜柱：C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%三氟乙酸溶液；B為80%乙腈溶液，并添加體積分?jǐn)?shù)為0.09%的三氟乙酸。采用體積分?jǐn)?shù)梯度洗脫程序：0～20 min，85%～65% A、15%～45% B；流速1.0 mL/min；檢測波長220 nm；柱溫20 ℃。質(zhì)譜條件[10]：采用電噴霧離子源；噴霧壓力15 psi；干燥氣溫度350 ℃；流速5 L/min；掃描質(zhì)量范圍m/z500～2 200。

利用戊二醛法將純化過的合成多肽與BSA偶聯(lián)，得到完全抗原[11]。利用紫外光譜掃描法測定完全抗原的偶聯(lián)比[11]。合成多肽、BSA及兩者偶聯(lián)后的完全抗原在紫外區(qū)均能產(chǎn)生明顯吸收峰。將合成多肽、BSA和完全抗原用PBS配成一定濃度溶液后，分別在190～1 100 nm全波長下進(jìn)行光譜掃描。通過比色法分別測定合成多肽（A）、BSA（B）和完全抗原（C）分別在A和B最大吸收峰波長（m、n）處的吸光度，即AAm、AAn、ABm、ABn、ACm、ACn。根據(jù)朗伯-比爾定律，按照公式A=kcl（A為吸光度；c為吸光物質(zhì)濃度/（mol/L）；l為樣品的吸收光程即吸收層厚度/cm；k為摩爾吸收系數(shù)/（L/（mol·cm）））計(jì)算A物質(zhì)與B物質(zhì)分別在其吸收峰波長處的摩爾分子消光值，即kAm、kAn、kBm、kBn。按式（1）計(jì)算A物質(zhì)和B物質(zhì)的摩爾分子比（即合成多肽與BSA的偶聯(lián)比）：

1.3.2 克隆抗體制備、亞型鑒定、效價(jià)測定及抗體特異性鑒定

委托外單位制備，總體步驟如下：SEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSER偶聯(lián)BSA制備完全抗原后，免疫BALB/c小鼠，4 次免疫后取小鼠脾細(xì)胞與NS-1骨髓瘤細(xì)胞相融合，篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行多次亞克隆，待細(xì)胞活性達(dá)到最佳狀態(tài)時(shí)，將雜交瘤細(xì)胞注射到BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)，等到可以明顯地觀察到小鼠腹部隆起時(shí)，收集腹水。同時(shí)制備αs1-酪蛋白的單克隆抗體作為對照。最后得到完全抗原的單克隆抗體和αs1-酪蛋白單克隆抗體。

采用小鼠IgG1、IgG2、IgG2a、IgE ELISA試劑盒鑒定亞型，按照使用說明書操作。采用間接ELISA測定單克隆抗體的效價(jià)。通過方陣法測定，抗原包被質(zhì)量濃度均為5 μg/mL，單克隆抗體依次按1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶160 000、1∶320 000、1∶640 000倍數(shù)稀釋。以未被免疫正常小鼠的腹水作為陰性對照。

采用免疫印跡法鑒定單克隆抗體的特異性[12]。首先進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離αs1-酪蛋白、脫脂牛乳、大豆分離蛋白，電轉(zhuǎn)印成功后，進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，進(jìn)而在膜上完成免疫印跡反應(yīng)，一抗為完全抗原和αs1-酪蛋白兩種蛋白對應(yīng)的單克隆抗體，二抗為HRP-羊抗小鼠IgG，以4-氯-1-萘酚為底物顯色液[13]。

1.3.3 間接競爭ELISA抑制曲線的建立以及方法精確性和重復(fù)性確定

按照間接競爭ELISA程序，在優(yōu)化包被抗原和單克隆抗體最適工作濃度、酶標(biāo)二抗最適工作濃度的基礎(chǔ)上，建立間接競爭ELISA抑制曲線。將αs1-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按1 280、640、320、160、80、40、20、10、0 ng/mL梯度稀釋，以αs1-酪蛋白質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，以競爭抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以作用表位單克隆抗體和αs1-酪蛋白單克隆抗體為一抗，其中競爭抑制率通過OD值計(jì)算，如式（2）所示：

式中：B為各質(zhì)量濃度αs1-酪蛋白競爭抑制時(shí)的OD值；B0為無αs1-酪蛋白競爭抑制時(shí)的OD值。

隨機(jī)選擇10 個(gè)孔進(jìn)行零競爭抗原間接競爭ELISA檢測，計(jì)算450 nm波長處吸光度的平均值（D0）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），按照式（3）計(jì)算檢出限（limit of detection，LOD）：

在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出對應(yīng)抗原質(zhì)量濃度為此方法的LOD[14]。以批內(nèi)誤差和批間誤差評價(jià)該競爭抑制曲線建立方法的精確度和重復(fù)性。

1.3.4 水解液抗原殘留量的測定

將αs1-酪蛋白不同酶解液凍干粉，加入抗原稀釋液（pH 9.6的50 mmol/L碳酸鹽溶液），稀釋到抑制曲線線性范圍，應(yīng)用已經(jīng)建立的間接競爭ELISA，測定水解液的抗原殘留量。

1.3.5 水解液水解度、苦味值及分子質(zhì)量分布的測定

利用鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）法測定酶解物的水解度[15]，參考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》。水解度計(jì)算如式（4）所示：

式中：TX為水解產(chǎn)物的游離氨基含量/（μmol/mL）；TO為未水解樣品的游離氨基含量/（μmol/mL）；Toal為蛋白質(zhì)樣品中游離氨基的總量/（μmol/mL）。

苦味值測定采用感官評價(jià)法[16]。在評價(jià)本研究樣品之前，使用參考溶液對小組成員進(jìn)行口味強(qiáng)度校準(zhǔn)：咖啡因配制成0、3、6、9、12、15 g/L的溶液，其苦味值分別定義為0、2、4、6、8、10。評定員用蒸餾水漱口后，取酶解液1.0 mL左右置于口中，5～10 s后吐出，蒸餾水漱口，間隔30 s后再品評下一個(gè)樣品。以6 名品嘗者（均為不吸煙者）按照上面的基準(zhǔn)評分，最后得出平均值表示苦味程度。

水解物分子質(zhì)量分布采用HPLC法。色譜條件：色譜柱TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm），流動(dòng)相為乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V），在220 nm波長下檢測，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10.0 μL。以甘氨酸（相對分子質(zhì)量75）、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（相對分子質(zhì)量189）、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（相對分子質(zhì)量451）、桿菌肽（相對分子質(zhì)量1 432）、抑肽酶（相對分子質(zhì)量6 512）、細(xì)胞色素（相對分子質(zhì)量12 384）為標(biāo)準(zhǔn)品[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)都設(shè)置空白對照，且均做3 次平行、3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用微軟Excel 2010軟件進(jìn)行圖表制作，采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 作用表位的純化、鑒定以及完全抗原的鑒定

通過HPLC對合成后的作用表位SEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSER（aa 83～105）進(jìn)行純化，純度可達(dá)到92.664%，同時(shí)用質(zhì)譜法測定多肽的相對分子質(zhì)量，為2 781.1，如圖1所示，驗(yàn)證合成多肽的準(zhǔn)確性。

圖1 合成作用表位的HPLC（A）和質(zhì)譜（B）圖Fig. 1 HPLC chromatogram (A) and mass spectrum (B) of synthetic epitope

將合成作用表位、BSA和完全抗原分別在190～1 100 nm全波長下進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖2所示，蛋白BSA在278 nm波長處有最大吸收峰；合成作用表位在196 nm波長處有最大吸收峰；完全抗原在190～1 100 nm波長處具有合成作用表位和BSA的特征吸收峰，并且有相應(yīng)的光譜疊加情況。因此合成作用表位和BSA偶聯(lián)成功。根據(jù)公式計(jì)算合成作用表位與BSA的摩爾分子比即偶聯(lián)比為6.31。

圖2 合成作用表位、BSA和完全抗原的紫外掃描光譜圖Fig. 2 UV absorption spectra of synthetic peptide, BSA and complete antigen

2.2 單克隆抗體的制備與鑒定

制備的抗體按照ELISA試劑盒說明書操作，鑒定其亞型為IgG1。用間接ELISA法測定作用表位單克隆抗體的效價(jià)，結(jié)果如表1所示。未被免疫的小鼠血清作為陰性對照，檢測時(shí)以O(shè)D抗體/OD對照＞2.1且OD抗體＞0.2判定檢測結(jié)果為陽性，OD抗體/OD對照＜2.1或OD抗體＜0.2判定檢測結(jié)果為陰性。在抗體稀釋倍數(shù)大于等于320 000時(shí)，OD抗體/OD對照大于2.1，但當(dāng)稀釋倍數(shù)為640 000時(shí)，抗體的OD值小于0.2，因此由作用表位制備的單克隆抗體效價(jià)可達(dá)到1∶320 000，同時(shí)測定αs1-酪蛋白抗體效價(jià)為1∶320 000。

表1 作用表位、αs1-酪蛋白單克隆抗體效價(jià)的OD值Table 1 OD values of monoclonal antibody titers of αs1-casein and epitopes

αs1-酪蛋白、脫脂牛乳、大豆分離蛋白的SDS-PAGE如圖3所示。泳道3為脫脂牛乳，條帶從上至下分別為乳鐵傳遞蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。泳道4為大豆蛋白，條帶從上至下分別為α’亞基、α亞基、β亞基、A3、11S酸性鏈、38 kDa、11S堿性鏈、14.4 kDa蛋白。

圖3 SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE profile

通過電轉(zhuǎn)印將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，然后用氨基黑染色觀察到清晰的圖譜，保證蛋白完全轉(zhuǎn)印到膜上。進(jìn)而對作用表位和αs1-酪蛋白的單克隆抗體特異性進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖4，作用表位和αs1-酪蛋白的單克隆抗體與αs1-酪蛋白、脫脂牛乳中的αs1-酪蛋白均發(fā)生了特異性免疫反應(yīng)，而與大豆分離蛋白沒有發(fā)生反應(yīng)。同時(shí)，為了排除假陽性反應(yīng)，用小鼠陰性血清進(jìn)行免疫印跡抑制實(shí)驗(yàn)，陰性小鼠血清與αs1-酪蛋白、脫脂牛乳、大豆分離蛋白均不發(fā)生反應(yīng)。

圖4 作用表位單克隆抗體、αs1-酪蛋白單克隆抗體和陰性血清的免疫印跡圖Fig. 4 Immunoblotting of monoclonal antibody against epitope or αs1-casein and negative sera

2.3 間接競爭ELISA的建立

當(dāng)一抗為作用表位的單克隆抗體，抗原質(zhì)量濃度為0～640 ng/mL時(shí)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，如圖5A所示，線性回歸方程為y=-9.22x+100.78（R2=0.989 1），LOD為10.49 ng/mL。當(dāng)一抗為αs1-酪蛋白的單克隆抗體時(shí)，抗原質(zhì)量濃度為40～1 280 ng/mL時(shí)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，如圖5B所示，線性回歸方程為y=-23.44x+135.77（R2=0.969 7），LOD為60.50 ng/mL。

圖5 作用表位單克隆抗體（A）和αs1-酪蛋白單克隆抗體（B）的間接競爭ELISA抑制曲線Fig. 5 Indirect competitive ELISA inhibition curves of monoclonal antibody against epitope (A) and αs1-casein (B)

以作用表位單克隆抗體作為一抗時(shí)，將αs1-酪蛋白設(shè)計(jì)5個(gè)質(zhì)量濃度梯度，每個(gè)質(zhì)量濃度3 次平行，3 次重復(fù)，ELISA在所用試劑、反應(yīng)條件和檢測設(shè)備完全相同的條件下進(jìn)行，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，以其孔間變異系數(shù)表示批內(nèi)誤差，變異系數(shù)在1.159%～4.406%范圍內(nèi)，說明方法精確性良好。在不同時(shí)間用不同酶標(biāo)板重復(fù)3 次。計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，以其批間變異系數(shù)表示批間誤差。變異系數(shù)在0.826%～4.362%范圍內(nèi)，說明方法重復(fù)性良好。

以αs1-酪蛋白的單克隆抗體作為一抗時(shí)，孔間變異系數(shù)在0.828%～5.191%范圍內(nèi)，批間變異系數(shù)在0.099%～4.849%范圍內(nèi)，說明方法精確性重復(fù)性均較好。

2.4 不同特性蛋白酶特異性水解αs1-酪蛋白過敏原作用表位分析

將未水解αs1-酪蛋白溶液稀釋到間接競爭ELISA抑制曲線的檢出范圍內(nèi)。按照間接競爭ELISA法程序，應(yīng)用作用表位單克隆抗體和αs1-酪蛋白單克隆抗體作為一抗，檢測抗原含量如表2所示。

表2 未水解αs1-酪蛋白溶液的抗原殘留量Table 2 Antigen contents of αs1-casein solution not hydrolyzed by protease

如圖6所示，6 種酶解液中抗原殘留量隨酶添加量的增加而減少。作用表位單克隆抗體和αs1-酪蛋白單克隆抗體所測的各酶解液中抗原殘留量的減少效果排序不同。當(dāng)作用表位單克隆抗體為一抗，6 種蛋白酶解液在相同的蛋白酶添加量時(shí)，抗原殘留量從大到小為蛋白酶M＞中性蛋白酶＞復(fù)合蛋白酶＞胃蛋白酶＞堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。當(dāng)αs1-酪蛋白單克隆抗體為一抗時(shí)，當(dāng)加酶量在2 000～3 500 U/g時(shí)，6 種蛋白酶解液抗原殘留量從大到小為胃蛋白酶＞堿性蛋白酶＞蛋白酶M＞復(fù)合蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。

圖6 作用表位單克隆抗體（A）和αs1-酪蛋白單克隆抗體（B）測定的水解液抗原殘留量Fig. 6 Antigen residues of hydrolysates measured using monoclonal antibody against epitope (A) and αs1-casein (B)

用感官評價(jià)法對各蛋白酶水解液的苦味值進(jìn)行測定，結(jié)果如圖7所示。酸性蛋白酶中的胃蛋白酶解液苦味值最高，可到達(dá)10.0。堿性蛋白酶苦味值較高，可達(dá)8.5。在中性蛋白酶中，復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶水解液的苦味值較高，均在7.0～8.0。而木瓜蛋白酶解液的苦味值在其中較低，為4.0～5.0，苦味值最低的是蛋白酶M水解物，在1.0～2.0。

圖7 不同種類蛋白酶水解αs1-酪蛋白的苦味值Fig. 7 Bitterness values of αs1-casein hydrolyzed by different proteases

用HPLC法對蛋白酶水解液的分子質(zhì)量分布情況進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖8所示。本研究代表性附上了木瓜蛋白酶水解物的分子質(zhì)量分布情況。以標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量的對數(shù)（lgMr）對保留時(shí)間（t）作圖得到相對分子質(zhì)量校正曲線方程：lgMr=-0.252 8t+7.098 4。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量在校正曲線上對應(yīng)的時(shí)間劃分各酶解液中不同分子質(zhì)量的分布情況。共劃分7 部分，每部分所占比例為標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)時(shí)間（t）之間的峰面積與總峰面積比例。

木瓜蛋白酶水解物中＜75 Da的組分所占比例隨酶添加量的增大而增大，在11.1%～12.7%之間。75～189 Da組分隨酶添加量變化不明顯，在1.4%～1.7%。189～451 Da組分所占比例隨酶添加量的增大顯著增大（P＜0.05），在37.8%～48.7%之間，并且是整個(gè)酶解物中占比最大的一部分。然而木瓜蛋白酶水解物中451～1 432 Da組分所占比例隨酶添加量的增大而減小，變化范圍在33.1%～37.4%之間。1 432～6 512 Da組分所占比例隨酶添加量的增大顯著減小（P＜0.05），在3.8%～10.1%之間。6 512～12 384 Da組分在酶解物液中所占比例很小，并隨加酶量增大而減小，占比范圍在0.21%～1.4%之間。最后，＞12 384 Da組分在酶解液中占比非常小，在0.04%～0.23%。總之，隨加酶量的增多，木瓜蛋白酶水解液中分子質(zhì)量＜451 Da組分所占的比例隨之增大，分子質(zhì)量＞451 Da的組分占比隨之減小。

同時(shí)，利用OPA法測定各蛋白酶水解物的水解度，結(jié)果如圖9所示。一般認(rèn)為，輕度水解蛋白的水解度為10%以下，深度水解蛋白的水解度為20%以上。酸性蛋白酶中胃蛋白酶的水解度最低，屬于輕度水解。堿性蛋白酶水解度較低，在加酶量低于3 500 U/g時(shí)，均為輕度水解。木瓜蛋白酶在1 500～3 500 U/g時(shí)，水解度在10%～15%之間，蛋白酶M為深度水解，中性蛋白酶在1 500～3 500 U/g水解度比較穩(wěn)定，在10%左右。復(fù)合蛋白酶水解度隨添加量增加呈上升趨勢，在3 500 U/g時(shí)，水解度為13%。

圖9 不同種類蛋白酶水解αs1-酪蛋白的水解度Fig. 9 Degrees of hydrolysis of αs1-casein hydrolyzed by different proteases

3 討 論

本課題組前期隨機(jī)合成αs1-酪蛋白重疊15肽，用牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgE作用表位為aa 6～20、aa 11～25、aa 21～35、aa 26～40、aa 91～105、aa 126～140、aa 141～155、aa 171～185、aa 186～200[13,18]。圍繞這些致敏區(qū)域，同時(shí)考慮偶聯(lián)載體后序列盡可能的暴露，確定aa 83～105（SEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSER）序列為本研究的目標(biāo)作用表位，應(yīng)用DNAStar軟件的Protean 程序預(yù)測序列的親水性均大于0，表示這個(gè)序列有比較高的親水性能；同時(shí)序列中的表面可及性絕大部分大于1，表示易發(fā)生折疊同時(shí)暴露在外面；抗原指數(shù)均大于0，則表示這個(gè)序列形成表位的可能性很高[19]，驗(yàn)證了其可行性。

BSA、匙孔血藍(lán)蛋白是常用的制備完全抗原的偶聯(lián)載體，其中，BSA因其理化性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)廉易得、無致敏性，在不同pH值和離子強(qiáng)度以及在含某些有機(jī)溶劑的情況下仍保持較大的溶解度[20]，因此作為本研究的偶聯(lián)載體。

本研究用αs1-酪蛋白作用表位的完全抗原免疫BALB/c小鼠，成功制備出單克隆抗體，同時(shí)制備αs1-酪蛋白全蛋白單克隆抗體作為對照，利用αs1-酪蛋白抗原表位制備的單克隆抗體效價(jià)高、特異性強(qiáng)、與大豆蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)。利用此抗體建立的間接競爭ELISA優(yōu)勢明顯，LOD為10.49 ng/mL，且其檢測方法精確性、重復(fù)性較好，能夠有效用于檢測牛乳過敏原，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。

酶解法是采用特定蛋白酶在最適溫度和pH值下對蛋白質(zhì)進(jìn)行的酶解反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，對氨基酸破壞少，而且隨著制酶工藝不斷成熟，蛋白酶種類逐漸豐富，成本降低，故酶解法是最常用的降低致敏蛋白的方法[21]。Ahmad等[22]用胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶及不同pH值（pH 2.2和pH 5.5）下的胃蛋白酶對水牛αs1-酪蛋白進(jìn)行水解，間接ELISA檢測到這幾種酶分別將抗原性降低85%、63%、60%和38%。但是如果蛋白酶水解過敏原未能完全破壞作用表位，則蛋白質(zhì)水解物依然具有致敏性，部分水解配方粉或深度水解配方粉已經(jīng)市場銷售，但是由于含有過敏原殘留物，仍可引起過敏反應(yīng)[23-24]。同時(shí)水解乳蛋白配方粉也具有較多的優(yōu)勢，在相同濃度以及相同氨基酸組成的條件下，人體對肽的吸收，尤其是小肽（二肽、三肽）速度比游離氨基酸快[25]。水解乳蛋白嬰兒配方粉由于蛋白質(zhì)來源、水解程度、蛋白酶種類、輔助加工技術(shù)（如非熱加工）和肽譜不同而有差異，篩選特異性水解過敏原作用表位的蛋白酶是關(guān)鍵[16]。

從6 種蛋白酶的水解位點(diǎn)分析，胃蛋白酶水解位點(diǎn)為芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸）羧基端和氨基端，亮氨酸、精氨酸羧基端；木瓜蛋白酶水解位點(diǎn)為賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸羧基端；堿性蛋白酶-地衣芽孢桿菌水解位點(diǎn)為絲氨酸、甘氨酸、芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）的肽鍵；中性蛋白酶-枯草芽孢桿菌涉及疏水氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸和蛋氨酸）的肽鍵；復(fù)合蛋白酶-枯草芽孢桿菌為廣泛特異性；蛋白酶M水解天冬氨酸和谷氨酰胺肽鍵[26-28]。αs1-酪蛋白作用表位氨基酸序列為絲氨酸-谷氨酸-谷氨酸-異亮氨酸-纈氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-絲氨酸-纈氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-賴氨酸-組氨酸-異亮氨酸-谷氨酰胺-賴氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-脯氨酸-絲氨酸-谷氨酸-精氨酸，可見，除胃蛋白酶，其他5 種蛋白酶都有可能特異性水解作用表位，但是從抗原殘留量數(shù)據(jù)來看，以作用表位單克隆抗體為一抗時(shí)，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解液中抗原殘留量較小，說明蛋白酶水解位點(diǎn)不是有效判斷蛋白酶特異性水解作用表位的依據(jù)，這可能與復(fù)雜的蛋白酶水解體系有關(guān)系。并且各種蛋白酶水解液中抗原殘留量的規(guī)律還需要進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。本研究探索了篩選特異性水解αs1-酪蛋白過敏原單一作用表位的方法，實(shí)際上，αs1-酪蛋白有多條B細(xì)胞作用表位，需要進(jìn)一步分析水解其他作用表位的有效蛋白酶，再綜合考慮制定徹底特異性水解αs1-酪蛋白過敏原作用表位的方法。

蛋白酶水解乳蛋白過敏原降低致敏性的同時(shí)，也產(chǎn)生了苦味肽，如何有效脫苦是課題組下一步的研究內(nèi)容。研究表明，乳酸菌發(fā)酵過程中的水解作用不僅降低了乳蛋白的抗原性，并且水解物口感良好，富集有較多生物活性物質(zhì)[29-30]。鼠李糖乳桿菌GG添加到適度水解配方粉中時(shí)有明顯的益處，降低了特應(yīng)性皮炎的嚴(yán)重程度，減少了腸道炎癥，更快地誘導(dǎo)了患有牛乳蛋白過敏嬰兒的耐受性，并改善了過敏性結(jié)腸炎的恢復(fù)[31-32]。因此建議將乳酸菌或益生菌應(yīng)用于配方粉生產(chǎn)，輔助脫敏的同時(shí)提高產(chǎn)品適口性。

4 結(jié) 論

通過固相合成法合成αs1-酪蛋白致敏作用表位SEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSER，再以作用表位的完全抗原免疫BALB/c小鼠，成功制備單克隆抗體，在優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，繪制競爭抑制曲線，建立間接競爭ELISA，該方法優(yōu)勢明顯，LOD為10.49 ng/mL，且其檢測方法精確性、重復(fù)性較好，能夠有效用于檢測牛乳過敏原。初步篩選到木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶可有效水解αs1-酪蛋白致敏作用表位。本研究結(jié)果可為生產(chǎn)新型低致敏嬰兒配方奶粉提供技術(shù)支持和新思路。