酸性蛋白酶對酸肉發酵過程中菌群結構和風味品質的影響

李文杰，白艷紅,*，陳 曦*，米瑞芳，熊蘇玥，王守偉

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

傳統酸肉以豬肉為原料，采用自然發酵工藝生產，是侗族、苗族、布依族等少數民族的特色發酵肉制品，具有風味獨特和營養豐富等特點[1]。傳統酸肉通常采用自然接種的方式進行發酵，生產所采取的工藝、環境條件和地區差異可以篩選和富集不同類型和代謝特征的微生物群落，從而產生多種多樣的風味和功能組分。傳統酸肉中普遍存在的優勢細菌包括乳桿菌屬、片球菌屬、葡萄球菌屬和微球菌屬等，真菌則以酵母居多，包括漢遜酵母屬、畢赤酵母屬等[2]。酸肉發酵過程中，微生物和內源酶促使肌肉蛋白和脂肪發生降解，進而產生酯類、醇類、酸類、游離氨基酸、抗氧化肽等多種風味物質和營養物質[3-4]。

采用傳統自然發酵方法生產酸肉，發酵時間長，產品質量不穩定。發酵肉制品的風味和營養品質與肌肉蛋白分解和轉化密切相關，利用外源添加的蛋白酶加速肌肉蛋白分解轉化，可在不損失營養風味的前提下縮短發酵肉制品的生產周期。目前外源蛋白酶在發酵香腸中的應用研究報道較多。例如，酸性蛋白酶、風味蛋白酶和脂肪酶的添加可將發酵香腸的生產周期縮短50%～60%[5]；酸性蛋白酶、風味蛋白酶和酯酶的添加可以改善發酵香腸的質地、彈性和黏聚性，并提高產品的風味感官品質[6]；酸性蛋白酶的添加還可提高羊肉發酵香腸的紅度值，改善產品色澤及感官風味品質[7]。另外，中性蛋白酶和真菌蛋白酶的應用可促進具有抗氧化活性的小肽等化合物產生，從而提高發酵香腸提取物的抗氧化活性[8]。然而，目前尚無外源蛋白酶在酸肉生產中的應用研究報道。

因此，為闡明外源蛋白酶對酸肉發酵過程中菌群結構變化、理化特性和感官風味品質的影響，本研究通過高通量測序分析酸性蛋白酶對酸肉發酵過程中細菌和真菌群落結構的影響，同時利用氣相色譜-質譜等方法分析酸性蛋白酶對酸肉中揮發性風味物質、游離氨基酸等重要理化指標的影響，并對微生物和揮發性風味物質之間的相關性進行分析。本研究結果可為酶法發酵酸肉工藝提供參考依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬五花肉（肥瘦比3∶7） 北京中瑞食品有限公司；紅曲米 福建古田縣天鮮農產品有限公司；食鹽、葡萄糖 市售；食品用酸性蛋白酶（50 000 U/g）安琪酵母股份有限公司。

細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒 德國Qiagen公司；C5～C20系列正構烷烴標準溶液 美國Sigma公司；茚三酮顯色液、氨基酸混合標樣 日本和光純藥工業株式會社；氦氣（＞99.999%） 北京氦普北方氣體工業有限公司。

1.2 儀器與設備

TG-Wax MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、1310氣相色譜-TSQ 8000三重四極桿質譜聯用儀 美國Thermo Scientific公司；57330-U手動進樣器、50/30 μm聚二乙烯苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取針 美國Supelco公司；L-8900全自動氨基酸分析儀日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 酸肉的制作

原料肉預處理（切成3 cm×5 cm×0.5 cm的薄片）→加入8%紅曲米、5%食鹽、1%葡萄糖和不同比例的酸性蛋白酶混勻→攪拌均勻→裝壇、密封→25 ℃發酵[9]

3個實驗組：CG（對照組，不添加酸性蛋白酶）、E1（酸性蛋白酶25 U/g）和E2（酸性蛋白酶250 U/g）。每個實驗組酸肉總質量均為6 kg（每壇0.5 kg，共12 壇）。

1.3.2 酸肉的微生物、pH值、游離氨基酸和揮發性風味物質測定

酸肉發酵時間共計21 d。除0 d樣品直接取樣外，發酵7、14、21 d每個實驗組隨機取3 壇樣品進行微生物群落、pH值、游離氨基酸和揮發性風味物質測定。

1.3.2.1 微生物群落檢測

每個實驗組取同一時間樣品3 份混勻，分別稱取混合樣品25 g，加入225 mL無菌生理鹽水，拍打均質后4 ℃振蕩30 min，靜置10 min后取上清液離心收集沉淀。參考細菌基因組提取試劑盒說明書步驟提取樣品細菌群落總DNA；參考真菌基因組提取試劑盒說明書步驟提取樣品真菌群落總DNA。DNA樣本經1%的瓊脂糖電泳檢測后，送至北京諾禾致源科技股份有限公司，分別采用341F和806R引物擴增細菌16S rRNA V3～V4區、ITS5-1737F和ITS2-2043R引物擴增真菌ITS1區。高通量測序采用基于Illumina HiSeq技術平臺的雙端測序法。測序數據經過處理后[10-11]，利用Uparse軟件以一致性97%作為標準劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），采用Silva數據庫進行比對[12]，利用QIIME軟件計算α多樣性指數。

1.3.2.2 pH值測定

參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》方法。

1.3.2.3 游離氨基酸測定

參考張蘇平等[13]的方法測定游離氨基酸含量，上機測定前經0.22 μm過濾器過濾。

1.3.2.4 揮發性風味物質測定

參照Montanari等[14]的方法并略做修改。稱取5 g酸肉，切碎后放于15 mL頂空瓶底部，加入3-辛醇（0.48 mg/mL）1 μL作為內標。將老化好的萃取針插入頂空瓶中，通過手柄推出石英纖維頭，使其暴露在頂空氣體中。將頂空瓶置于50 ℃恒溫水浴中萃取30 min后，將石英纖維頭推回針頭內并拔出，然后插入進樣口解吸5 min。

色譜條件：TG-Wax MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，氦氣流速1.0 mL/min；進樣口溫度230 ℃。升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min；以10 ℃/min升至50 ℃；再以4 ℃/min升至120 ℃；最后以12 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

質譜條件：離子源溫度280 ℃，電離方式為電子電離，電子能量70 eV；全掃描模式采集信號，掃描質量范圍35～400 u。

定性與定量分析：檢索NIST 11數據庫，結合C5～C20系列正構烷烴混標計算保留指數（retention index，RI），對揮發性組分進行定性分析，利用內標3-辛醇計算揮發性化合物的含量。根據定量結果和文獻中報道的閾值[15]，計算得到香氣活性值（odor activity value，OAV）。

1.3.3 感官評定

參考冉春霞等[16]的方法對成熟酸肉進行感官評定。由10 名發酵肉研究人員（男女各5 名）組成評價小組，按表1評分標準進行。

表1 酸肉感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of sour meat

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 酸性蛋白酶對酸肉發酵過程中細菌群落的影響

2.1.1 細菌群落測序數據質量和OTU分析

酸肉樣品所獲得的細菌序列條數平均值為78 391 條。如圖1所示，所有樣品的稀釋曲線都進入平臺期，說明測序深度基本覆蓋樣品中所有細菌，符合分析要求。

圖1 酸肉樣品細菌稀釋曲線（A）和OTU數分布（B）Fig. 1 Rarefaction curves for bacteria (A) and distribution of bacterial OTUs in sour meat samples (B)

按照97%相似度對所有序列進行聚類分析，共獲得686個OTU，涵蓋9 門241 屬。其中CG-0 d樣品的OTU數量最高，其他樣品的OTU數量相對較低，可見酸肉發酵過程中細菌群落組成發生了較大變化。

2.1.2 細菌群落α多樣性分析

對不同樣品在97%一致性閾值下的細菌群落α多樣性進行統計（表2），所有樣品的覆蓋率均大于0.99，說明測序結果可信。其中CG-0 d樣品的Simpson指數和Chao1指數最高，這與Lü Jing等[18]對酸肉的研究結果類似，即0 d樣品的細菌多樣性在所有樣品中最高。這可能是由于發酵過程中乳桿菌等細菌逐漸占據優勢地位，從而降低了樣品中細菌豐富度。整個發酵過程中，其他樣品的細菌多樣性呈波動趨勢。

表2 酸肉樣品中細菌群落α多樣性Table 2 α-Diversity indexes of bacterial community in sour meat samples

2.1.3 細菌群落豐度分析

如圖2A所示，除0 d樣品，厚壁菌門（Firmicutes）是酸肉發酵過程中的優勢細菌門（95.38%～99.90%），這與其他研究報道一致[18-19]。在0 d樣品中，擬桿菌門（Bacteroidetes）是主要優勢菌門（40.61%），原因在于酸肉中添加了紅曲米。紅曲米是以稻米為原料經紅曲菌發酵而成，含有多種功能成分，包括紅曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸等[20]。為改善酸肉色澤和營養品質，本研究在酸肉中添加了紅曲米，而擬桿菌門是紅曲米中的優勢細菌[21]。

如圖2B所示，對于CG組酸肉，除0 d樣品，整個發酵過程中排名前3的優勢細菌菌屬為芽孢桿菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）和乳桿菌（Lactobacillus）。發酵7 d，CG組優勢細菌為芽孢桿菌（50.46%）和葡萄球菌（44.91%）；發酵14 d，乳桿菌成為優勢細菌（60.40%）；發酵結束時（21 d），優勢菌仍為乳桿菌（57.6%），這與之前的研究報道一致[2,22-23]。酸肉自然發酵前期，芽孢桿菌和葡萄球菌等細菌生長迅速，將環境氧氣消耗殆盡，之后厭氧和兼性厭氧乳桿菌成為優勢菌，促使環境pH值急劇下降；隨著pH值的下降，不耐酸的葡萄球菌和芽孢桿菌生長被抑制[22-23]，部分乳酸菌還能產生細菌素，進一步抑制葡萄球菌和芽孢桿菌生長[24]；發酵中期至結束，乳桿菌通常成為酸肉中的優勢細菌屬[19,25-26]。

圖2 酸性蛋白酶對酸肉發酵過程中細菌群落的影響Fig. 2 Effect of acidic protease on bacterial community in sour meatduring fermentation

蛋白酶的添加影響了酸肉發酵過程中乳桿菌、芽孢桿菌和葡萄球菌的相對豐度。發酵7 d，與CG組類似，E1和E2組酸肉中優勢細菌為芽孢桿菌（49.97%、68.30%）和葡萄球菌（44.37%、27.07%）；發酵14 d，與CG組不同，E1和E2組中葡萄球菌成為優勢菌屬（57.36%、86.21%），乳桿菌相對豐度僅為20.90%和3.17%；發酵結束時（21 d），E1組與CG組類似，其優勢細菌屬為乳桿菌，但E2組中乳桿菌豐度僅為3.90%，其優勢細菌為芽孢桿菌（64.55%）。因此，發酵中期至結束（14～21 d），隨著酶添加量的增加，乳桿菌相對豐度呈下降趨勢。原因可能是蛋白酶加快了肌肉蛋白的降解速率，產生了小肽、游離氨基酸和胺類等堿性物質[27]，提高了pH值，促進了芽孢桿菌和葡萄球菌的生長繁殖。阿爾祖古麗·阿卜杜外力等[28]研究發現，蛋白酶的添加可促進干腌羊火腿中葡萄球菌屬的生長；李文亞等[29]研究發現，蛋白酶的添加可促進蝦醬中芽孢桿菌的生長，與本研究結果一致。推測由于蛋白酶促進了芽孢桿菌和葡萄球菌相對豐度的上升，因此乳桿菌相對豐度有所下降。

2.2 酸性蛋白酶對酸肉發酵過程中真菌群落的影響

2.2.1 酸性真菌群落測序數據質量和OTU分析

酸肉樣品所獲得的真菌序列條數平均值為80 108 條。如圖3A所示，所有樣品的稀釋曲線均進入平臺期，說明測序深度基本覆蓋樣品中所有真菌，符合分析要求。

按照97%相似度對所有序列進行聚類分析，共獲得773個OTU，涵蓋8 門143 屬。由圖3B可知，整個發酵過程中酸肉樣本的真菌OTU數量變化較小。

圖3 酸肉樣品真菌稀釋曲線（A）和OTU數分布（B）Fig. 3 Rarefaction curves for fungi (A) and distribution of fungal OTUs (B) in sour meat samples

2.2.2 真菌群落α多樣性分析

對不同樣品在97%一致性閾值下真菌群落的α多樣性進行統計（表3），所有樣品的覆蓋率均大于0.99，說明測序結果可信。與細菌群落相比，酸肉發酵過程中真菌群落的Simpson指數和Chao1指數變化較小，原因在于紅曲米的添加使紅曲菌成為優勢菌，導致發酵過程中真菌組成變化較小。

表3 酸肉樣品中真菌群落α多樣性分析Table 3 α-Diversity indexes of fungal community in sour meat samples

2.2.3 真菌群落豐度分析

酸肉發酵過程中，門水平上排名前3的真菌分別為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）和擔子菌門（Basidiomycota）（圖4A），其中子囊菌門是包含紅曲菌的菌門。如圖4B所示，屬水平上排名前3的真菌分別為紅曲屬（Monascus）、毛霉屬（Mucor）和洛德酵母屬（Lodderomyces）。發酵過程中CG組酸肉真菌組成變化較大，發酵0 d優勢真菌為紅曲屬，原因在于添加了紅曲米；發酵7 d為酵母（洛德酵母屬和紅酵母屬占比48.76%），發酵14 d為紅曲屬（55.86%），發酵結束時（21 d）為毛霉屬（66.23%）。傳統酸肉發酵過程中的真菌主要為酵母[2]。因此，紅曲米的添加顯著影響了酸肉自然發酵過程中的真菌群落結構。

圖4 酸性蛋白酶對酸肉發酵過程中真菌群落的影響Fig. 4 Effect of acidic protease on fungal community in sour meat during fermentation

酸性蛋白酶的添加顯著降低了酸肉的真菌豐富度。與CG組相比，添加酸性蛋白酶的酸肉中真菌組成變化較小，優勢真菌均為紅曲屬（78.76%～97.94%）。目前尚無蛋白酶影響肉制品中紅曲屬生長的研究報道。推測蛋白酶的添加促進了小肽、游離氨基酸等堿性物質產生，提高了酸肉pH值，從而促進了紅曲屬生長，如劉巧琳等[30]發現相對較高的pH值有利于紅曲屬的生長。

2.3 酸性蛋白酶對酸肉發酵過程中理化指標的影響

2.3.1 酸性蛋白酶對pH值的影響

發酵過程中，所有酸肉的pH值均呈先略升高后顯著下降的趨勢（圖5）。發酵7 d，所有酸肉pH值無顯著差異；發酵結束時（21 d），E2組酸肉pH值顯著高于其他實驗組（P＜0.05）。對優勢菌屬和pH值進行Spearman相關性分析，結果表明乳桿菌和pH值呈顯著負相關（P＜0.05），這可能是由于乳桿菌可顯著降低酸肉的pH值[9]。發酵結束時，E2組乳桿菌豐度最低，因此其pH值最高。

圖5 酸性蛋白酶對酸肉發酵過程中pH值的影響Fig. 5 Effect of acidic protease on pH of sour meat during fermentation

2.3.2 酸性蛋白酶對游離氨基酸的影響

如圖6A所示，酸性蛋白酶的添加影響了酸肉發酵過程中游離氨基酸總量。整個發酵過程中，所有酸肉的游離氨基酸總量均呈上升趨勢。蛋白酶加速了肌肉蛋白水解，促進了游離氨基酸總量的增加，這與文獻[31]報道一致。游離氨基酸可作為風味前體物質，被乳酸菌、葡萄球菌等微生物轉化為醇、醛、酸等風味物質[32]。發酵結束后（21 d），所有實驗組酸肉的游離氨基酸總量差異顯著（P＜0.05），氨基酸總量隨蛋白酶添加量的增加而增加。如圖6B所示，整個發酵過程中，所有酸肉的必需氨基酸總量呈上升趨勢。發酵結束時（21 d），酸肉必需氨基酸總量也隨蛋白酶添加量的增加而增加。必需氨基酸對人體維持生命至關重要，因此蛋白酶通過促進游離氨基酸的釋放，提高了酸肉的營養價值。

圖6 酸性蛋白酶對酸肉發酵過程中游離氨基酸含量的影響Fig. 6 Effect of acidic protease on free amino acid contents in sour meat during fermentation

2.4 酸性蛋白酶對酸肉發酵過程中揮發性風味物質的影響

酸性蛋白酶的添加提高了酸肉中揮發性風味物質的種類和含量。如表4所示，所有酸肉中共檢出54 種揮發性風味物質，包括酸類8 種、醇類12 種、醛類7 種、酯類13種、酮類6 種、含硫/含氮類2 種和芳香族類6 種。其中CG-0 d組揮發性風味物質種類最少（23種）；E1-21d、E2-21 d組的揮發性風味物質最多，分別為41 種和39種。成熟酸肉揮發性風味物質總量隨蛋白酶添加量的增加而增加，E1-21 d、E2-21 d組酸肉中揮發性風味物質總量分別為CG-21 d組酸肉的3.17 倍和3.97 倍。蛋白酶的添加促進了酸肉發酵過程中醇類的產生。與發酵7、14、21 d的CG組相比，發酵7、14、21 d的E1和E2組酸肉中乙醇、苯乙醇、戊醇、1-辛烯-3-醇等醇類含量有所提高，其中苯乙醇含量的增加是因為蛋白酶的添加促進了酸肉的氨基酸代謝，乙醇含量的增加可能是微生物代謝消耗酸肉中添加的葡萄糖，促進了碳水化合物的分解[33]。整個發酵過程中，E1和E2組的乙酸含量均較CG組顯著提高（P＜0.05）。成熟酸肉（21 d）中3-甲基丁酸含量隨著蛋白酶添加量的增加呈上升趨勢，可能是由于蛋白酶促進游離氨基酸產生，進而內源酶和微生物代謝氨基酸產生3-甲基丁酸[34]。

表4 酸肉發酵過程中揮發性風味物質含量Table 4 Contents of volatile compounds in sour meat during fermentation μg/kg

酯類物質種類數隨著發酵時間的延長而增加，如L-乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和庚酸乙酯僅在成熟酸肉（21 d）中檢測到。發酵結束后，僅在E1和E2組中檢測出乙酸乙酯、丁酸乙酯和庚酸乙酯。此外，E1和E2組成熟酸肉中3-甲基丁酸乙酯含量也較CG組顯著提高（P＜0.05），這可能由于蛋白酶促進了部分醇類和酸類物質形成，醇和酸發生酯化反應促進酯類產生[35]。酯類尤其是乙酯類物質通常能賦予發酵肉果香味、奶油香味等良好風味[36]。

蛋白酶的添加促進了發酵過程中酮類物質產生。整個發酵過程中E2組的3-羥基-2-丁酮顯著高于CG組（P＜0.05）。發酵結束后，僅在加酶組中檢測到3-戊烯-2-酮和2,4-戊二酮。另外，蛋白酶也促進了苯甲醛等醛類物質含量的提高。與本研究結果類似，封莉[37]發現在香腸中添加蛋白酶可促進酮類物質的產生，Yang Jing等[38]發現酸鲊魚中添加蛋白酶可將苯甲醛含量提高2.16 倍。

2.5 酸肉中優勢微生物與關鍵揮發性風味物質的相關性分析

通過OAV可以比較各種揮發性物質的呈香能力，OAV大則表明該物質對酸肉的風味貢獻較大，是酸肉的關鍵風味物質。如表5、圖7所示，酸肉中OAV大于1（即OAV對數值大于0）的關鍵風味物質共有17 種，分別為1-辛烯-3-醇、3-羥基-2-丁酮、3-戊烯-2-酮、3-甲基丁酸、丁酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己醛、

圖7 酸肉發酵過程中揮發性風味物質OAV熱圖Fig. 7 Heatmap for the odor activity values of volatile compounds in sour meat during fermentation

表5 酸肉發酵過程中的揮發性風味物質Table 5 Volatile flavor compounds in sour meat during fermentation

苯乙醛、2,4-癸二烯醛、反-2,4-癸二烯醛和反-2-辛烯醛。這些物質可賦予酸肉蘑菇香、青香、甜香、奶香味等，從而提升酸肉的風味品質[19]。

對酸肉中平均相對豐度大于1%的微生物和關鍵風味物質之間進行Spearman相關性分析，如圖8所示，與關鍵風味物質呈顯著相關的優勢菌屬為乳桿菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬。乳桿菌屬與1-辛烯-3-醇呈顯著負相關（P＜0.05），這可能是由于酸肉中自然接種的部分乳桿菌可以抑制脂質氧化，從而抑制了1-辛烯-3-醇產生，具體原因有待進一步研究。芽孢桿菌屬與1-辛烯-3-醇呈顯著正相關（P＜0.05），這可能是由于芽孢桿菌有利于發酵肉中這些物質的形成，例如黃雨霞等[39]研究發現，接種芽孢桿菌L-H7后，發酵香腸中1-辛烯-3-醇相對含量由未檢測到增加到1.71%。葡萄球菌與3-羥基-2-丁酮呈顯著正相關（P＜0.05）。這可能是由于葡萄球菌的蛋白酶和脂肪酶活性有利于發酵肉制品中醇和酮類揮發性風味物質的形成[32]。紅曲菌等真菌與關鍵風味物質之間無顯著相關性。

圖8 酸肉中平均相對豐度大于1%的微生物和關鍵風味物質的相關性Fig. 8 Correlation between microorganisms with an average relative abundance greater than 1% in sour meat and key flavor substances

2.6 酸性蛋白酶對成熟酸肉感官品質的影響

酸性蛋白酶的添加提高了酸肉的總體感官品質。如表6所示，E1、E2組的氣味、滋味和總體可接受性評分顯著高于CG組（P＜0.05），這是由于蛋白酶的添加促進了蛋白質的降解，提高了酸肉中醇、酯、醛等揮發性風味物質的種類和含量，賦予了酸肉更濃郁的發酵香味。加酶組中，E2組的總體可接受性評分顯著高于E1組（P＜0.05），說明適量添加蛋白酶（250 U/g）有助于提高酸肉的感官品質。

表6 酸性蛋白酶對成熟酸肉感官品質的影響Table 6 Effect of acidic protease on the sensory quality of mature sour meat

3 結 論

添加蛋白酶的酸肉在微生物群落、游離氨基酸含量、揮發性風味和感官品質等方面都具有較大的差異。蛋白酶的添加提高了發酵過程中芽孢桿菌和葡萄球菌的相對豐度，降低了乳桿菌的相對豐度，并降低了真菌豐富度。蛋白酶促進了酸肉游離氨基酸總量和必需氨基酸含量的提高，有利于提升酸肉的風味和營養品質。在所有酸肉樣品中共檢測到54 種揮發性風味物質，蛋白酶的添加提高了成熟酸肉中揮發性風味物質的種類和含量，尤其是醇類、酸類、酯類和醛類物質。適當添加蛋白酶還可提高酸肉感官品質。目前，尚無外源蛋白酶在酸肉中應用的研究報道。本研究通過對酸肉微生物群落、游離氨基酸、感官風味品質進行分析，判斷出較為適宜的蛋白酶添加量，可為酸肉生產提供一定的參考。