藍莓花青素生物合成相關基因表達與分子進化分析

鄭嘉偉，王蘭嬌，李大婧，柴 智，張曉曉，黃午陽,*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

花青素是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，存在于很多食品中。花青素對人類健康有積極的影響，具有抗氧化、抗癌、保護視網膜、降低血脂、抗衰老和改善腸道健康等重要功效[1]。藍莓含有豐富的花青素。因此有關藍莓花青素的研究也不斷深入，其中包括一些有關基因及其調控方面的研究。植物花青素生物合成途徑中的結構基因可以達到協同調控花青素生成的作用，在紅葡萄中與花青素合成有關的查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）、尿苷二磷酸-葡萄糖-類黃酮-3-葡萄糖基轉移酶（uridine diphosphate-glucoseflavonoid-3-glucosyl transferase，UFGT）等結構基因表達量均高于白葡萄[2]。CHS是花青素合成途徑中的第一位關鍵酶，能夠催化生成柚皮素查耳酮，并在查耳酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）、黃烷酮-3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）、二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）和花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）的連續作用下形成花青素[3-5]，而花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）是合成原花青素的關鍵酶，在形成花青素后經ANR的催化可生成原花青素，而不通過UFGT轉化較為穩定花色苷[6-7]，通過不同途徑分支消耗相同底物也是花青素合成的一種調控機制，可以說ANR基因在花青素的生物合成過程中起負調控作用，有研究表明，擬南芥在缺少ANR基因的情況下能夠促使花青素合成，使擬南芥的花青素含量提高[8]。當花青素合成遭到阻礙時，可以發現CHS、ANS和UFGT基因的表達水平大幅度降低[9]。植物中花青素含量受多方面因素影響。一方面，紫外線等外部環境會影響花青素生物合成基因的表達水平，紫外線可以誘導花青素積累在植物組織通過花青素生物合成基因激活，顯著提高花青素化合物的水平[10]。另一方面花青素合成需要兩類基因，一類是編碼直接參與花青素和其他類黃酮形成的酶的結構基因，另一類是控制結構基因轉錄的調控基因[11]。花青素的合成途徑屬次生代謝產物黃酮類的分支，盡管不同物種在花青素的構成成分和積累模式上有較大區別，但其合成時經歷的主要反應基本一致[12]。其合成路徑主要分為3個階段，第1、2階段為類黃酮代謝的反應，第3階段為各個花青素的形成階段。花青素的形成主要依靠CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、ANR等關鍵酶（圖1）。目前相關學者已從金魚草（Antirrhinum majus）、玉米（Zea mays）、楊梅（Myrica rubra）等眾多植物中得到了花青素合成所需酶類的基因[13-15]。

圖1 花青素的生物合成途徑Fig. 1 Anthocyanin biosynthesis pathway

轉錄因子又被稱為反式作用因子，它是真核生物當中所含的一種DNA結合蛋白，作用于啟動子區并與順式元件結合，對基因的表達具有調節作用[16]。轉錄因子在高等植物各組織器官中普遍存在，廣泛參與調控植物的生長發育，其作用方式多種多樣，但大多是與特定靶基因上游的特異性核苷酸序列相結合，調控下游的基因轉錄的一種蛋白。轉錄因子特異性地結合靶基因的啟動子、增強子等調控轉錄的區域，抑制或者促進轉錄，進而實現對具體代謝途徑或生命活動的調控[17]。在植物花青素合成中可能由一個或多個轉錄因子基因調控結構基因協同表達，研究表明花青素在合成過程中，主要由髓細胞組織增生病毒癌基因同源物（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，MYB）、bHLH、WD40轉錄因子及其MBW復合物分別或共同參與調控代謝途徑[18]，MYB基因已被證實是調控花青素生物合成的重要轉錄因子之一[19]。MYB基因家族很大，在植物的不同代謝途徑中能發揮不同的用途，它能夠參與植物表皮細胞的分化、輔助氣孔細胞運動、調控黃酮類化合物的生物合成以及抵抗真菌感染等作用。在參與花青素生物代謝過程時，MYB轉錄因子能夠通過調控花青素合成相關酶基因促進花青素的生成，如葡萄中VvMYBPA1能夠調控CHI基因的表達，VvMYBBA2能夠促進UFGT的表達[20]。同時在一些植物研究中發現其具有負調控作用[21]，有研究證實，在擬南芥中存在的AtMYB4轉錄因子能夠通過抑制C4H基因的合成達到負向調控植物對UV-B耐受性的作用[22]。Yao Gaifang等[23]發現該基因可調控花青素合成，且抑制其表達可促使紅皮梨中花青素生成。R2R3MYB調節劑通常是決定花青素積累的關鍵因素[24-25]。此外，R2R3MYB蛋白的c端序列很長，它專門控制花青素生物合成、偶聯和轉運花青素到液泡中[26]。花青素生物合成是一個復雜的體系，具體調控方式及作用機理還有待進一步研究。本研究通過分析不同品種藍莓花青素生物合成結構基因和轉錄因子基因表達量，進而探究其與花青素含量的相關性及系統發育，探索花青素生物合成的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8個品種藍莓樣品由江蘇省南京市中山植物園中國科學院植物研究所提供，產自浙江諸暨。

藍莓花青素標準品Mv-3-O-gal、Mv-3-O-glc 美國Sigma-Aldrich公司；Dp-3-O-glc、Cy-3-O-gal、Cy-3-O-ara、Pt-3-O-gal、Pt-3-O-glc 北京索萊寶科技有限公司；Dp-3-O-ara、Pt-3-O-ara 上海吉至生化有限公司；Dp-3-O-gal、Pn-3-O-gal、Cy-3-O-glc 法國Extrasynthese公司；Mv-3-O-ara 上海甄準生物科技有限公司；乙腈（色譜純）美國Tedia試劑有限公司；磷酸（色譜純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441） 天根生化科技（北京）有限公司；cDNA合成試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Top Green qPCR SuperMix熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 北京全式金生物公司。

1.2 儀器與設備

AG梯度PCR儀 德國艾本德股份公司；Applied Biosystems Q3實時定量PCR儀 美國賽默飛世爾科技公司；NanoDrop One超微量紫外分光光度計 基因有限公司；Tg16-WS臺式高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；Tanon 2500全自動數碼凝膠成像系統 上海天能科技有限公司；DYY-2穩壓穩流電泳儀 上海越磁電子科技有限公司；Thermo Forma 900超低溫冰箱 上海甄明科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素含量的測定

藍莓花青素按前期報道的方法[27]提取后，提取物用0.22 μm聚偏二氟乙烯膜過濾，采用高效液相色譜法測定各品種藍莓果花青素提取物中各花青素含量，總花青素含量為各花青素含量的總和，包括?；幕ㄇ嗨?。1200高效液相色譜儀配置G1311A二元泵和G1315D二極管陣列檢測器，并采用C18色譜柱進行分離。以體積分數1.0%的磷酸緩沖液為流動相A，以100%乙腈為流動相B。流速0.6 mL/min，運行柱溫25 ℃，波長520 nm。

1.3.2 藍莓總RNA提取

將存于-80 ℃的樣品放入研缽中，與液氮一起迅速研磨成粉末；向475 μL裂解液中加入25 μLβ-巰基乙醇，隨后加入100 mg樣品粉末并立即旋渦劇烈振蕩混勻，之后參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書進行藍莓總RNA提取，以OD260nm/OD280nm比值檢驗RNA純度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.3.3 cDNA合成

將提取出的完整RNA稀釋后，用cDNA試劑盒合成反轉錄第一鏈cDNA，加入1 000 ng總RNA。

cDNA合成反應體系為2 μL的5×PrimeScriptRTMaster Mix（Perfect Real Time）、2 μL總RNA、6 μL RNase-Free ddH2O。反轉錄條件為：反轉錄（37 ℃反應15 min），反轉錄酶失活（85 ℃反應5 s），4 ℃冷卻。于冰上冷卻后，分裝并置-20 ℃冰箱存儲備用。

1.3.4 實時PCR（real-time PCR）測定

根據花青素生物合成通路選擇主要結構基因VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR、VcANS、VcANR和轉錄因子基因VcMYBPA1進行測定。內參基因準確平穩表達是real-time PCR結果的重要決定因素，一般選擇表達水平相對穩定的參考基因，如Actin、NCED1、GAPDH、EF-1α、UBQ、SAND等，本研究經real-time PCR實驗比對后，選擇已知的UBQ作為內參基因，所用引物見表1[28-29]。

表1 花青素合成相關基因引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of target genes involved in anthocyanin synthesis

以cDNA為模板，根據試劑盒說明書進行操作，其中cDNA質量濃度為50 ng/μL，引物濃度為10 μmol/L。PCR程序為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環次數為40。反應結束后得到熒光值變化曲線和溶解曲線，以目的基因與內參基因Ct值之差計算基因的相對表達差異，參考2-ΔΔCt分析法[30]。

1.3.5 RNA濃度的計算

超微量紫外分光光度計用RNase-Free ddH2O調零后，取2 μL用RNase-Free ddH2O稀釋的藍莓RNA提取物測定其OD260nm值，并按照下式計算RNA質量濃度：

質量濃度/（ng/μL）=OD260nm×稀釋倍數×40

1.3.6 分子系統進化分析與數據處理

2 結果與分析

2.1 不同品種藍莓花青素生物合成相關基因的表達

2.1.1 相關結構基因相對表達量分析

選取8 種藍莓果實進行總花青素含量測定，如圖2所示?？梢钥闯鰣@藍、藍美1號、綠寶石總花青素含量處于較高水平，而海岸、燦爛以及奧尼爾處于較低水平，萊格西和比洛克西處于居中水平。

圖2 8個品種藍莓果實總花青素含量Fig. 2 Total anthocyanin contents of eight blueberry varieties

由表2可以看出，總花青素含量最高的為兔眼藍莓園藍，其總花青素含量高達（2 331.48±67.33）μg/g；其次為南高叢藍莓藍美1號和北高叢藍莓綠寶石，含量分別為（2 184.07±59.36） μg/g和（2 055.56±61.61） μg/g；而南高叢藍莓奧尼爾的總花青素含量最低，僅為（554.56±2.83）μg/g，與園藍相差4 倍多。

表2 8 種藍莓果實信息及總花青素含量Table 2 Fruit traits and total anthocyanin contents of eight blueberry varieties

對6個藍莓花青素合成途徑中重要結構基因進行real-time PCR檢測后，使用相對定量的方式分析其表達量，如圖3所示，每個基因均能夠在藍莓中正常表達，但相同基因在不同品種藍莓的表達量上存在明顯差異。VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR以及VcANS的表達量在不同品種間的差距較為接近，例如這5個結構基因均在奧尼爾中呈現出最高表達量，燦爛的表達量較高，而藍美1號的表達量均呈現最低狀態，其余品種之間的5個結構基因表達量存在較小浮動，但整體趨勢相似；除奧尼爾外，其余品種的VcCHS表達量均較為接近；比洛克西、燦爛和海岸的VcCHI表達量相對較高；萊格西、園藍和燦爛的VcF3H表達量相對較高；園藍和燦爛的VcDFR表達量相對較高；比洛克西、燦爛和海岸的VcANS表達量相對較高。而VcANR在不同品種藍莓間的表達量與其他5 種基因差異較大，其表達量最低的品種為綠寶石，表達量最高的品種為燦爛，萊格西、比洛克西、奧尼爾、藍美1號的表達量也相對偏高。

圖3 不同品種藍莓花青素合成各相關結構基因VcCHS（A）、VcCHI（B）、VcF3H（C）、VcDFR（D）、VcANS（E）、VcANR（F）相對表達量Fig. 3 Relative expression levels of VcCHS (A), VcCHI (B), VcF3H (C),VcDFR (D), VcANS (E), and VcANR (F) involved in the biosynthesis of anthocyanins in different blueberry varieties

綠寶石的總花青素含量高，雖然其VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因的表達量均偏低，但VcANR在不同品種藍莓間的表達量最低，推測與其他品種的藍莓相比，這5 種基因在綠寶石中主要貢獻產生花青素，而其他的類黃酮物質如查耳酮、黃酮醇、黃烷醇較少，且由于負調控基因VcANR極低，ANR催化花青素生成原花青素分支途徑被抑制，花青素總含量依舊較高；燦爛的VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因表達量均較為領先，基本處于所有品種藍莓中的第2位，但其總花青素含量卻僅為一般水平，推測是由于其VcANR基因表達量最高，而ANR基因對花青素合成具有負調控作用，其表達量越高，對花青素合成的影響越大，導致花青素向原花青素的方向轉化，致使燦爛的總花青素含量減少；奧尼爾的VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因表達量均呈現最高狀態，其VcANR基因表達量居于中等位置，但其總花青素含量在8 種藍莓中最低，這可能是VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR主要貢獻生成其他類黃酮物質，而且由于其含有一些VcANR基因使其花青素含量降低，但其VcANR基因表達量不足以使其花青素含量降低至此，可能還存在其他基因調控或影響因素導致其花青素含量大幅度減小。同樣，藍美1號VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因表達量均呈現最低狀態，而VcANR基因表達量最高，但總花青素含量在8 種藍莓中偏高，也可能是其他基因（如UFGT等）調控。

整體來看，花青素合成途徑的關鍵酶基因都對最終花青素的生成量起到一定作用，其中VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因負責催化生成花青素，對花青素合成起到明顯的正調控作用；而VcANR基因對花青素的合成有負調控作用，能夠將產生的花青素催化形成原花青素，最終使藍莓花青素含量降低。然而單憑這些基因的作用并不能解釋所有藍莓花青素含量與相關基因表達量的關系，仍需從多種角度做進一步研究。

從不同品種藍莓中各基因表達量對比可以看出，萊格西、比洛克西、藍美1號和燦爛中VcANR基因表達量最高，證明該基因在這些品種藍莓花青素合成中積極參與，而在奧尼爾、綠寶石中VcANR基因表達量最低，說明該基因在這兩種藍莓中的作用不十分明顯；園藍和綠寶石中VcF3H基因以及海岸中VcANS基因在其對應品種藍莓花青素的合成過程中參與性最強；萊格西、比洛克西、園藍和燦爛的VcCHS基因以及藍美1號和海岸的VcDFR基因在其對應品種藍莓花青素合成中的作用較弱。

整體來看，VcANR和VcF3H基因在藍莓花青素合成過程中基本能夠呈現出表達量較高的態勢，而VcCHS、VcANS和VcDFR基因通常表達量較低?？梢姴煌贩N的藍莓中各基因的表達情況及參與程度存在差異，使得不同品種的藍莓最終表現出不同的花青素含量。

2.1.2 相關調控基因相對表達量分析

本實驗部分品種藍莓的MYB表達量極低，也可能是由于不同藍莓植株間存在遺傳差異性或果實空間分布對環境信號的敏感度不同，一般來說，果實表面的光照分布也可能是影響MYB表達水平不明顯的因素，已有研究人員在蘋果中分離出調控果皮花青素合成的MdMYB1轉錄因子，并發現光照誘導對該基因表達量的影響很大[31]。

圖4為不同品種藍莓VcMYBPA1轉錄因子基因的相對表達量，其在所有品種中均存在表達，但品種間存在較大差異?？梢钥闯鰥W尼爾的VcMYBPA1基因表達量最高，其次為燦爛，約為奧尼爾的1/2；萊格西、比洛克西的表達量為中等水平；藍美1號、園藍和海岸的基因表達量較低，而綠寶石的VcMYBPA1基因表達量最低。藍莓VcMYBPA1基因表達量的整體趨勢與VcCHS基因表達量最為相似，可能在更大程度上通過調控VcCHS基因影響花青素的合成。

圖4 不同品種藍莓MYB調控基因相對表達量Fig. 4 Relative expression levels of MYB-regulated genes in different blueberry varieties

將圖4與圖2對比來看，VcMYBPA1基因表達量最高的奧尼爾，其花青素含量最低，VcMYBPA1基因表達量較高的燦爛，其花青素含量也僅為中等水平，造成這種現象可能是VcMYBPA1轉錄因子反饋抑制，對其產生負調控作用，使得花青素含量降低；VcMYBPA1基因表達量處于中間位置的萊格西、比洛克西，其花青素含量無明顯變化趨勢；而VcMYBPA1基因表達量較低的藍美1號、園藍、綠寶石和海岸的花青素含量卻相對偏高，尤其是園藍、藍美1號和綠寶石的花青素含量明顯高于其他品種，居前3位，可能是少量的VcMYBPA1對其產生正調控作用，促進花青素的生成。以此推測MYB轉錄因子能夠對花青素的生物合成產生促進作用還是抑制或限制花青素的合成，與MYB基因表達量有關，當MYB基因表達量過高時，其可能發揮負調控作用影響花青素的合成，使藍莓花青素含量降低；當MYB基因表達量處于中等水平時，其對花青素合成的調控作用不十分明顯；當MYB基因表達量較低時，其能夠發揮正調控作用促進花青素的合成，從而生成更多的藍莓花青素；這之間可能存在一定的平衡點，當MYB基因表達量超過平衡點時則發揮負調控作用，低于平衡點則有益于花青素的合成。

2.2 不同品種藍莓花青素生物合成相關基因分子進化與系統發育分析

對上述real-time PCR產物進行測序分析后，得到其反向互補序列，上傳至GenBank，并利用BLAST工具將其與數據庫中的同種基因進行比對，選擇一致性較高的基因采用NJ法構建分子進化樹，上傳基因和比對基因及其序列號如表3、4所示，根據其置信度辨別樣品藍莓基因與數據庫中基因的親緣關系。

表3 檢測藍莓樣品的基因序列號Table 3 GeneBank accession numbers of anthocyanin biosynthesisrelated genes in blueberry samples

表4 參比基因及其序列號Table 4 GeneBank accession numbers of reference genes

樣品藍莓為越橘屬植物，GenBank樣品名稱包括萊格西、比洛克西、奧尼爾、藍美1號、園藍、燦爛、綠寶石和海岸。如圖5系統發育樹和序列比對結果顯示，越橘屬（Vacciniumspp.）和油茶屬（Camellia）的ANR基因功能相近，而與其他物種親緣關系較遠。根據圖6也可知二者的蛋白結構域也較為相似，因此越橘屬的ANR基因可能是由油茶屬進化而來。ANR基因在越橘屬中保守性較高（93.38%），在相同譜系的不同種中均存在較為一致的保守序列。

圖5 ANR基因的系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of ANR gene

圖6 越橘屬（A）和油茶屬（B）ANR蛋白結構域Fig. 6 ANR protein domains of Vaccinium (A) and Camellia (B)

ANS（97.4%）、CHI（94.83%）、CHS（98.72%）、DFR（94.48%）、F3H（99.45%）在越橘屬中保守性均很高，但與其他物種之間存在較大差異，表明這些基因在物種分化后可能獨立進化，并在不同物種中趨于保守。植物轉錄因子MYB是近年來發現的一類與調控植物生長發育、生理代謝、細胞的形態和模式建成等生理過程有關的一類轉錄因子。結果顯示，本研究所測序的MYB蛋白序列屬于I類MYB基因家族成員1R-MYB/MYB-related[32]，越橘屬與油茶屬的MYB基因具有很近的親緣關系，該基因在越橘屬、油茶屬及櫟屬（Quercus）中均屬于同一個基因家族成員，可能由共同的祖先分化而來，并發揮相似功能。

3 結 論

本研究對藍莓花青素合成途徑中的關鍵結構基因VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR、VcANS、VcANR和轉錄因子基因VcMYBPA1進行real-time PCR測定得到其相對表達量。研究發現，以上所有基因在藍莓中均有表達，但不同品種的藍莓間存在較大差異，其中VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR和VcANS基因對花青素的合成有調控作用，能夠促進花青素的生成；但VcANR基因對花青素的合成有負調控作用，可使藍莓花青素含量降低；VcANR和VcF3H基因在藍莓花青素合成過程中普遍較為活躍，而VcCHS、VcANS和VcDFR基因則相對保守；MYB轉錄因子對花青素合成的調控作用相對復雜，與MYB基因的表達量有關，當MYB基因表達量過高時，可能發揮負調控作用降低藍莓花青素含量；當MYB基因表達量處于中等水平時，其對花青素合成的調控作用不顯著；當MYB基因表達量較低時，能夠促進花青素的合成。花青素的合成還與其他調控因子及影響因素有關，具體調控方式及作用機理還有待進一步研究。

此外，本研究系統測定不同藍莓品種花青素合成相關基因的序列并進行分子進化和系統發育分析。在藍莓花青素合成相關基因的進化過程中，其ANR基因與油茶屬ANR基因功能相似，并且二者的蛋白結構域也較相似，推測越橘屬植物與油茶屬是近源關系；藍莓MYB基因與油茶屬MYB基因的親緣關系也很近，且該基因在越橘屬、油茶屬及櫟屬中為同一基因家族成員，可能由共同的祖先分化而來；ANS、CHI、CHS、DFR和F3H基因在越橘屬中的保守性很高，與其他物種間存在較大差異，可見這些基因在物種分化后可能會發生獨立進化。藍莓花青素合成相關基因的系統發育分析，有助于了解基因的進化以及生物系統發生的內在規律，指導優質藍莓品種的選育?？傊?，藍莓花青素的生物合成受類別、品種、種植地區、基因調控等多方面因素的影響，本研究探索不同品種藍莓花青素生物合成相關基因表達量和分子進化，為開發優質藍莓品種花青素類功能性食品提供理論依據。