雪蓮菌中乳酸菌的益生特性

何杉杉，王曉蕊，彭禹熙，馬立娟，杜麗平

（天津科技大學生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

益生菌是寄生于宿主體內活的微生物，當達到一定數量后會對宿主健康產生有益作用的一類微生物。益生菌可通過調節免疫反應，促進有害物質的代謝以及產生抑菌物質和益生物質（如維生素、多糖等）等發揮益生作用[1]，也可以通過增強營養吸收改善腸道微生物平衡[2]。益生菌的益生特性包括腸道定植、抑菌[3]、抗氧化能力[4]和安全性等[5-6]。研究最多的益生菌主要是能在胃腸道中存活的雙歧桿菌和乳酸菌。乳酸菌是一類可以利用碳水化合物，并能產生乳酸的革蘭氏陽性、無芽孢的一類細菌總稱。乳酸菌是重要的發酵菌群，廣泛存在于傳統發酵食品中。趙圣明等[7]從發酵酸菜中篩選出疏水性、黏附性和自凝聚特性較好的植物乳桿菌A4，其作為輔助發酵劑可以明顯提高發酵乳的活菌數和黏度。孫寧等[8]從自然發酵酸筍中篩選出6 株耐酸、耐膽鹽性能好且抗氧化活性強的乳酸菌。鄭柳青[9]從嬰兒腸道中分離篩選出鼠李糖乳桿菌LR-ZB 1107-01的益生特性最好，并優化了菌株高密度培養條件使得活菌數達到了9.08×108CFU/mL。陳美瑄[10]從40 份母乳樣品中篩選出2 株益生特性好的乳酸菌分別為乳雙歧桿菌Probio-M8和鼠李糖乳桿菌Probio-M9，之后將2 株菌與基礎發酵劑（嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）復配發酵山羊乳，制備得到具有優良風味和口感的發酵乳。Yu Zhihui等[11]從發酵酸菜中篩選得到的植物乳桿菌S2-5和S4-1具有良好的益生特性，且能有效降低小鼠體內膽固醇含量。

雪蓮菌作為傳統發酵食品在西藏、青海地區有長期食用歷史[12-13]。雪蓮菌作為天然混菌發酵系統，在長期自然馴化過程中逐步形成由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等多種微生物組成的群落[14]，其中乳酸菌包括副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、鏈球菌和腸球菌等。課題組前期對雪蓮菌中的微生物進行分離，得到20 株乳酸菌，本研究對其耐酸能力、模擬胃腸液耐受能力、黏附能力、抗氧化能力和抑菌能力等益生特性進行研究，旨在從中篩選得到具有潛在益生特性的菌株，為其在益生產品中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20 株乳酸菌為本實驗室從雪蓮菌中分離得到，于-80 ℃條件下保存。

MRS培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、無水乙酸鈉5 g、酵母提取物5 g、檸檬酸三胺2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.1 g、吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5，115 ℃滅菌20 min。

LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌20 min。

胃蛋白酶、胰蛋白酶、豬膽鹽 上海源葉生物科技有限公司；抗生素 北京天壇藥物生物技術開發公司；脫脂棉羊血（無菌） 北京索萊寶科技有限公司；哥倫比亞血培養基 青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1200紫外分光光度計 上海美普達儀器有限公司；L530ZXJD-A1270培養箱、ZHJH-C1115B超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；Centrifuge 5430R離心機 德國艾本德有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株和培養條件

將乳酸菌菌株在MRS培養基中于37 ℃靜置培養24 h，活化3 代。

1.3.2 菌懸液的制備

將1.3.1節活化3 代的菌液離心，棄上清液，用pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗3 次，再加入PBS振蕩均勻制成懸浮液，調節菌體濃度至1.0×108CFU/mL（OD595nm＝1.0）。

1.3.3 乳酸菌的酸耐受性測定

按體積分數1%取菌懸液接種到MRS液體培養基中（用2 mol/L HCl溶液調節pH 3.0或2.5），37 ℃靜置培養24 h后，取100 μL涂布于MRS瓊脂板上，置于37 ℃培養24 h，觀察平板菌落生成情況。

1.3.4 乳酸菌在模擬消化液下的存活率

1.3.4.1 乳酸菌在模擬胃液下的存活率

選取耐pH 2.5的乳酸菌按1.3.2節制成菌懸液，取1 mL菌懸液與9 mL pH 3.0模擬胃液混勻，37 ℃靜置培養，分別在0、3 h后取樣梯度稀釋后涂布于MRS瓊脂平板上，按式（1）計算存活率[15]。選擇活菌數在106CFU/mL以上的乳酸菌進行后續實驗。

式中：Nm和Nn分別表示模擬胃液或腸液消化前后活菌數/（CFU/mL）。

1.3.4.2 乳酸菌在模擬腸液下的存活率

取1 mL菌懸液與9 mL pH 3.0模擬胃液混勻，37 ℃靜置培養3 h后，取1 mL經模擬胃液消化后的菌液與9 mL pH 8.0模擬腸液混勻，37 ℃靜置培養，分別在0、4 h取樣，梯度稀釋后涂布于MRS瓊脂平板上，按式（1）計算存活率。

1.3.5 乳酸菌的體外黏附能力測定

1.3.5.1 疏水性測定

將乳酸菌懸液OD595nm調整為0.8～1.0。1 mL溶劑（正己烷、二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯）中加入3 mL乳酸菌懸液，在37 ℃反應10 min，進行溫度平衡，振蕩混勻，在37 ℃培養3 h。取1 mL水相溶液，用紫外分光光度計于595 nm波長處測定OD595nm。疏水性按式（2）計算[16]。

式中：ODi為培養0 h的OD595nm；ODj為培養3 h的OD595nm。

1.3.5.2 自聚集性測定

將乳酸菌懸液OD595nm調整為0.9～1。在37 ℃培養0 h時，測定菌懸液OD595nm，培養3 h后小心吸取溶液的上層相測定OD595nm。按式（3）計算自凝聚率[16]：

式中：ODi為培養0 h的OD595nm；ODj為培養3 h的OD595nm。

1.3.6 乳酸菌的抗氧化活性測定

1.3.6.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性

將2 mL OD595nm為0.9～1的乳酸菌懸液與1 mL 0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混勻，37 ℃于暗處反應30 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液，于517 nm波長處測定吸光度A1；空白組以等體積無水乙醇代替DPPH-無水乙醇溶液，對照組則以等體積蒸餾水代替樣品溶液，等體積的蒸餾水-無水乙醇混合液用于空白調零。DPPH自由基清除率按式（4）計算[17]：

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為對照組吸光度。

1.3.6.2 羥自由基清除活性

取5 mmol/L硫酸亞鐵溶液、5 mmol/L水楊酸乙醇溶液、3 mmol/L過氧化氫溶液各1 mL加入10 mL具塞試管中，加2 mL OD595nm為0.9～1的乳酸菌懸液，用蒸餾水補齊至刻度，37 ℃水浴中反應15 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液，于510 nm波長處測定吸光度，蒸餾水為空白對照[18]。羥自由基清除率按式（5）計算：

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.3.6.3 超氧陰離子自由基清除活性

取4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2，含2 mmol/L乙二胺四乙酸），25 ℃水浴反應20 min，加2.3 mL OD595nm為0.9～1的乳酸菌懸液和2.2 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻后，25 ℃水浴反應4 min，加1 mL 10 mol/L HCl溶液終止反應，6 000 r/min離心10 min，取上清液，于320 nm波長處測定吸光度，蒸餾水為空白對照[19]。超氧陰離子自由基清除率按式（5）計算。

1.3.6.4 還原能力的測定

采用鐵氰化鉀法[20-21]，取0.5 mL OD595nm為0.9～1的乳酸菌懸液，加0.2 mol/L PBS及1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液各0.5 mL，混合均勻。50 ℃水浴20 min，驟冷。加0.5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，4 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL，加超純水、0.1 g/100 mL三氯化鐵溶液各1 mL，混勻，靜置10 min，于700 nm波長處測定吸光度。用PBS代替菌懸液為空白對照，還原能力按式（5）計算。

1.3.7 乳酸菌的抗菌活性測定

利用雙層瓊脂擴散法測定菌株的抗菌活性[22]。3種食源性病原體包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌被用作指示菌。在滅菌平板中加入10 mL 2 g/100 mL水瓊脂培養基，待水瓊脂凝固后放入滅菌的牛津杯。在20 mL LB瓊脂培養基中加入106～107CFU/mL的指示菌，充分混勻后倒入平板內，待培養基凝固后，將牛津杯取出，在孔內分別加入8 株乳酸菌菌懸液180 μL，37 ℃培養24 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。

1.3.8 乳酸菌的安全性評價

1.3.8.1 抗生素敏感性

將100 μL 106～107CFU/mL乳酸菌菌株均勻涂布于MRS培養基，將抗生素紙片貼在表面。37 ℃培養24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，并將結果與美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標準2012進行比較，評估抗生素敏感性[23]。

1.3.8.2 溶血活性

將乳酸菌在添加5%無菌脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂表面劃線，37 ℃培養24～48 h。根據不同的光暈評估平板的溶血活性。沒有明確的透明區域被確定為非溶血性[24]。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 雪蓮菌中乳酸菌的酸耐受性

耐酸性是選擇益生菌菌株的重要標準。益生菌進入消化道后首先會遇到惡劣的胃腸道環境，它們必須能夠在酸性環境下生存。人體胃液的pH值處于不斷變化的過程中，通常維持在pH 3.0左右。大多數候選菌株的體外實驗已經發展為能夠耐受pH 3.0以下的低pH值條件[25]，因此，本實驗選擇pH 2.5和3.0作為篩選候選益生菌菌株的耐酸性指標。由表1可知，從雪蓮菌中分離出的20 株乳酸菌除FQ菌株，其余19 株菌株都能在pH 3.0下存活，但是只有11 株菌株能在pH 2.5的酸性條件下生長。

表1 雪蓮菌中乳酸菌在pH 2.5和pH 3.0條件下生長情況Table 1 Growth status of lactic acid bacteria isolated from Tibetan kefir grains at pH 2.5 and 3.0

2.2 雪蓮菌中乳酸菌在模擬胃液中的存活率

選取能在pH 2.5酸性條件下生長的11 株乳酸菌用于測定模擬胃液的存活率。由圖1可知，11 株乳酸菌在pH 3.0模擬胃液中處理3 h后，菌株均具有一定的耐受能力，但是差異較大。菌株BG-1、B5-27、RG、GG-2、GG-1、KF2-5在模擬胃液中存活率較高，均大于100%。CQ-2、NC-1、BG-2、B5-29存活率中等，MQ-1存活率最低為1.67%，但活菌數仍高于106CFU/mL。

圖1 模擬胃液中乳酸菌活菌數的測定結果Fig. 1 Viable counts of LAB cultured in simulated artificial gastric fluid

2.3 雪蓮菌中乳酸菌在模擬腸液中的存活率

由圖2可知，經耐酸性篩選出的11 株乳酸菌，在pH 3.0模擬胃液中處理3 h后繼續用pH 8.0的模擬腸液處理4 h，除菌株B5-27、B5-29和MQ-1，其余8 種菌株均具有一定的耐受能力。菌株BG-2在模擬腸液中存活率較高，為119.56%。其余8 株菌株經模擬胃腸液消化后存活率由大到小依次為GG-1、BG-1、CQ-2、NC-1、B5-29、KF2-5、GG-2、RG，活菌數均高于106CFU/mL。

圖2 模擬腸液中乳酸菌活菌數的測定結果Fig. 2 Viable counts of LAB cultured in simulated artificial intestinal fluid

2.4 雪蓮菌中乳酸菌的自凝聚性

選擇經模擬胃腸液消化后活菌數仍在106CFU/mL以上的8 株乳酸菌菌株進行后續益生特性分析。自凝聚指細胞之間的聚集，與沒有自凝聚性的微生物相比，具有自凝聚性的微生物細胞在惡劣環境（如人類胃腸道）中具有競爭優勢[26]。自凝聚的形成使中心細胞屏蔽了外界有害環境[27]。由圖3可知，菌株RG和GG-2有較高的自凝聚性，自凝聚率分別為65.70%和63.67%。BG-1和GG-1自凝聚率分別為37.47%和35.59%，NC-1、KF2-5、BG-2和CQ-2自凝聚率分別為32.33%、30.28%、28.61%和23.99%。

圖3 雪蓮菌中乳酸菌的自凝聚性Fig. 3 Auto-aggregation capacity of LAB

2.5 雪蓮菌中乳酸菌的疏水性

疏水性對于益生菌黏附在胃腸道上皮細胞上至關重要，菌株可以提供預防性和治療性的益生作用[28]。由圖4可知，BG-2、GG-2、KF2-5和RG對乙酸乙酯有較高的疏水性，分別為76.95%、73.01%、65.45%和64.66%。BG-1和RG對乙醚（47.90%和36.59%）和二氯甲烷（32.36%和32.61%）的疏水性處于中等水平。8 株乳酸菌對乙醚的疏水性都處于中等水平，對正己烷和二氯甲烷的疏水性都處于較低水平。

圖4 雪蓮菌中乳酸菌菌株的疏水性Fig. 4 Hydrophobicity of LAB

2.6 雪蓮菌中乳酸菌的抗氧化活性

由圖5可知，8 株乳酸菌的DPPH自由基清除活性差異較大，菌株RG的DPPH自由基清除活性較高，為72.93%，BG-2、KF2-5和NC-1處于中等水平，分別為34.24%、32.13%和43.23%，BG-1、GG-1、GG-2和CQ-2均小于30%。8 株乳酸菌的羥自由基清除活性均大于36%，KF2-5的羥自由基清除活性最高，達60.39%，其余7 株乳酸菌羥自由基清除活性均在36%～56%。8 株乳酸菌的超氧陰離子自由基清除活性均較差，僅KF2-5和RG大于30%，其余6 株菌株均小于30%。但是8 株乳酸菌的還原能力都較強，均大于61%，RG還原能力最強，達到115.48%。

圖5 雪蓮菌中乳酸菌菌株的抗氧化活性Fig. 5 Antioxidant activity of LAB

2.7 雪蓮菌中乳酸菌的抑菌性

乳酸菌可以抑制病原菌的生長繁殖，有助于胃腸道環境健康[29]。8 株乳酸菌對3種指示菌的抑菌結果如表2所示。8 株乳酸菌對3種病原菌均有一定的抑制作用。8 株菌株對大腸桿菌的抑制效果較金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌高，其中菌株KF2-5和RG對3種病原菌抑制效果均最好。綜上，KF2-5和RG具有較好的益生特性。

表2 雪蓮菌中乳酸菌菌株的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of LAB

2.8 雪蓮菌中乳酸菌的安全性

2.8.1 抗生素敏感性

耐藥性是乳酸菌在應用安全方面的重要問題[30]。抗生素雖然具有抑菌作用，但是也會使人體產生耐藥性，導致腸道菌群紊亂[31]。根據CLSI標準2012對KF2-5和RG菌株進行抗生素敏感性評價，結果見表3。KF2-5和RG對紅霉素、卡那霉素、氯霉素和四環素均敏感。KF2-5對鏈霉素和慶大霉素中度敏感，RG對環丙沙星、青霉素和頭孢曲松中度敏感。KF2-5對環丙沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟和萬古霉素耐藥，RG對鏈霉素、慶大霉素、頭孢噻肟和萬古霉素耐藥。據報道很多乳酸菌對鏈霉素、萬古霉素的耐藥性是先天固有的，且這種耐藥性一般不會轉移傳遞給致病菌[32]。

表3 雪蓮菌中乳酸菌菌株的抗生素敏感性Table 3 Antibiotic susceptibility of LAB

2.8.2 溶血活性

由圖6可知，KF2-5和RG菌株均沒有溶血現象，說明這2 株乳酸菌均是安全的，可以為之后進一步發酵提供安全性保障。

圖6 雪蓮菌中乳酸菌菌株的溶血活性Fig. 6 Hemolytic activity of LAB

3 討 論

本研究從實驗室已有雪蓮菌中分離得到的20 株乳酸菌中篩選出8 株具有胃腸液耐受性能力的乳酸菌，進一步對其益生特性研究，得到2 株具有潛在益生特性的乳酸菌。

目前關于益生菌的研究受到越來越多的關注，然而胃腸道系統復雜，益生菌進入胃腸道后首先要能夠耐受胃腸道的惡劣環境[33]，同時應具有良好的腸道黏附性能才能定植于腸道，進而發揮其益生作用，因此益生菌應該同時具有胃腸液耐受性能力與腸道黏附能力，自凝聚性和疏水性是表征益生菌腸道表皮黏附能力的重要指標。目前，從傳統發酵食品中篩選益生菌是一個研究的熱點。Gunyakti等[23]從發酵食品、水果、蔬菜中篩選得到戊糖片球菌CHIG、NAG1和植物乳桿菌V3F對低pH值和高膽鹽均有較好的耐受性。Yu等[34]從泡菜中篩選到魏斯氏菌D29具有較強的耐酸和耐膽鹽能力。本研究篩選得到8 株對胃腸液耐受性較好的乳酸菌，這些菌經過模擬胃腸液消化后活菌數均能達到106CFU/mL以上。

自凝聚性和疏水性是細菌黏附在腸道表皮的重要指標，通常認為自凝聚性和疏水性高的菌株對細胞的黏附性也高。趙雪婷等[35]對3 株人源干酪乳桿菌進行益生特性研究，結果表明3 株干酪乳桿菌自凝聚率均為70%以上，疏水性均為86%以上。趙圣明等[7]從發酵酸菜中篩選出植物乳桿菌A44，其對氯仿和二甲苯的疏水性均大于80%。本研究篩選出的鼠李糖乳桿菌RG的自凝聚性和對乙酸乙酯的疏水性均較高，分別為65.70%和64.66%，表明其具有較好的黏附性。

腸道微生物群的生理平衡非常重要，因為許多疾病與腸道微生物群的失調有關。已有報道表明乳酸菌可通過其抗氧化活性調節腸道內微生物群的穩態[4]。本研究中KF2-5的羥自由基清除活性最高（60.39%），RG的DPPH自由基清除活性最高（72.93%），且2 株菌的還原能力也較強，RG的還原能力最強，達到115.48%，KF2-5的還原能力為77.98%。Yu等[34]從泡菜中篩選到魏斯氏菌D30具有較強的抗氧化能力，為29.53%～67.81%。后續可對益生菌調節氧化應激，改善腸道抗氧化防御系統方面[36]作進一步研究。

在健康的腸道微生物群中，有益微生物產生的抗菌化合物可以防止病原體過度生長[3,37]。本研究中KF2-5和RG對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌抑制效果最好。高云云等[38]從新疆傳統乳品中篩選出植物乳桿菌1-3和1-6對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，其抑菌圈直徑與本研究接近。抑菌作用一方面是因為產生有機酸而達到抑菌效果，另一方面可能和其產生的其他非酸性化合物有關。

抗生素敏感性和溶血活性是體外測定益生菌安全性的指標，不同菌株對抗生素的耐藥性不同。目前的研究發現，大部分乳酸菌都沒有溶血活性。本研究中KF2-5和RG對紅霉素、卡那霉素、氯霉素和四環素均敏感，對頭孢噻肟和萬古霉素耐藥。Nami等[24]從酸奶中篩選出的植物乳桿菌YS5對紅霉素、卡那霉素和四環素等敏感，對萬古霉素和環丙沙星耐藥，與本實驗結果相似。有研究稱一些乳酸菌有溶血活性，Argyri等[39]從發酵橄欖中篩選出71 株乳酸菌進行溶血實驗，發現有4 株菌有溶血活性。本實驗中篩選出的2 株乳酸菌均無溶血活性，說明可以用于后續發酵。

目前，益生菌的概念已被廣泛熟知和認可，然而對于益生菌的功能機理、遺傳轉化及代謝調控[40]仍需不斷深入研究。

4 結 論

本研究對分離自雪蓮菌的乳酸菌進行益生特性研究，篩選出2 株潛在益生特性較好的乳酸菌，分別為副干酪乳桿菌KF2-5和鼠李糖乳桿菌RG。菌株RG的自凝聚性、疏水性、抗氧化能力和抑菌性能均較好，菌株KF2-5的疏水性、抗氧化能力和抑菌性能較好。2 株菌對紅霉素、卡那霉素、氯霉素和四環素敏感，對頭孢噻肟和萬古霉素耐藥，并且均無溶血活性。

近年來，在國家“健康中國”戰略驅動下，人們對營養健康的需求進一步提升，對益生菌調節健康的需求日益增多，益生菌產業增長較快，本研究從雪蓮菌中分離的乳酸菌中篩選出2 株潛在益生特性較好的乳酸菌，后期可將這2 株乳酸菌進行動物實驗研究其具體的益生性能，并應用于發酵制品或其他益生產品中。