不同海拔烘青綠茶的品質(zhì)成分分析

張 悅，朱 蔭,*，呂海鵬，黃 海，邵晨陽(yáng)，彭佳堃，林 智,*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系安慶綜合試驗(yàn)站，安慶市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，安徽 安慶 246000）

海拔高度是影響茶葉風(fēng)味品質(zhì)形成的重要因素之一，一般情況下，海拔每升高100 m，年平均氣溫會(huì)降低0.5 ℃，晝夜溫差也隨海拔升高而增加[1]，而茶樹的物質(zhì)代謝受氣溫的影響較大[2]，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)于不同海拔高度的茶葉品質(zhì)有所不同。Chen Guanheng等[3]通過(guò)對(duì)170～1 600 m海拔烏龍茶樣品研究發(fā)現(xiàn)，其滋味品質(zhì)與栽培海拔呈正相關(guān)，隨著海拔升高，烏龍茶中表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表沒(méi)食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）4 種成分的含量總體呈下降趨勢(shì)。黃紀(jì)剛等[4]對(duì)廬山不同海拔49 個(gè)茶園中一芽二葉茶鮮葉的主要生化成分進(jìn)行了測(cè)定分析。結(jié)果表明，隨海拔高度的增加，氨基酸呈線性關(guān)系顯著提高，茶多酚和酚氨比則呈指數(shù)關(guān)系顯著降低，咖啡堿及兒茶素總量變化不大。另有多項(xiàng)研究表明茶葉中氨基酸含量隨海拔高度升高而增加[5-8]。此外，海拔高度對(duì)茶葉香氣化合物的組成和含量也有一定影響。楊勇等[9]采用同時(shí)蒸餾萃取-氣相色譜-質(zhì)譜方法分析了湯記高山茶（綠茶）與平地茶的香氣成分，發(fā)現(xiàn)二者香氣組分差異不大，但是它們?cè)谙憔偷目偭考案飨銡獬煞值南鄬?duì)含量差異明顯，因此認(rèn)為含量較高的庚醛和雪松醇可能是形成高山茶香氣馥郁的主要原因。孫慕芳等[10]發(fā)現(xiàn)在信陽(yáng)毛尖中，高山茶（670 m）香氣物質(zhì)種類和含量都明顯高于低山茶（200 m），二者均以醇類化合物為主，但高山茶萜烯醇類化合物含量更高且種類更豐富，低山茶含有更高比例的丁香烯、β-丁香烯和α-蓽澄茄油烯等具有木香的芳香物質(zhì)。倪子鑫等[11]通過(guò)對(duì)不同海拔的“周寧高山云霧茶”分析可知，中高海拔（600～900 m）綠茶特征香氣物質(zhì)為茉莉酮和順式-α-法尼烯等，帶有花果香；低海拔（200～400 m）綠茶特征香氣物質(zhì)為苯乙醇、芳樟醇及其氧化物和反式-γ-丁香烯，帶有木質(zhì)花香。

雖然海拔高度對(duì)茶葉品質(zhì)的影響目前已有研究報(bào)道，然而隨著研究水平及分析手段的提升，茶葉品質(zhì)成分的傳統(tǒng)分析方法也暴露出了一定的不足。如在茶葉香氣成分分析上，傳統(tǒng)的一維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低、峰容量不足和檢測(cè)成分重疊等缺陷，容易導(dǎo)致重要的痕量成分定性不準(zhǔn)確甚至被忽視[12]。全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）技術(shù)可以有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)氣相色譜-質(zhì)譜的上述缺陷，使可分析的化合物數(shù)量顯著提升5 倍以上，從而實(shí)現(xiàn)茶葉香氣組分的精確定性定量分析[13-17]。本研究擬采用GC×GC-TOFMS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）和氨基酸自動(dòng)分析儀等手段對(duì)不同海拔烘青綠茶的香氣成分進(jìn)行精確定性和相對(duì)定量分析以及主要非揮發(fā)性成分的含量分析，同時(shí)結(jié)合多種數(shù)據(jù)分析方法，篩選出不同海拔烘青綠茶中的關(guān)鍵差異性化合物，最后查明這些化合物在不同海拔烘青綠茶中的分布規(guī)律及其與海拔的相關(guān)性，以期能比較系統(tǒng)和全面地了解海拔因素與茶葉品質(zhì)及茶葉品質(zhì)成分間的具體聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同海拔烘青綠茶樣品委托安慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選擇當(dāng)?shù)丶庸すに囅嗤⑵贩N及海拔信息齊全且品質(zhì)較好的2019年春茶樣品。加工工藝流程：鮮葉→攤放→殺青→整形→攤涼→初烘→攤涼→復(fù)烘→攤涼→包裝。低海拔（400～600 m）樣品5個(gè)，編號(hào)L1（烏牛早）、L2（群體種）、L3（舒茶早）、L4（石佛翠）、L5（群體種）；高海拔（650～1 102 m）樣品8個(gè)，編號(hào)H1（石佛翠）、H2（群體種）、H3（群體種）、H4（群體種）、H5（群體種）、H6（群體種）、H7（石佛翠）、H8（群體種）。以上茶樣均用研磨機(jī)磨粉過(guò)40 目篩后保存于4 ℃冰箱備用。

EGC、兒茶素（catechin，C）、EGCG、EC和ECG標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；茶氨酸、γ-氨基丁酸、色氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品北京百靈威科技有限公司；2.5 μmol/mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸混合溶液 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；正構(gòu)烷烴C8～C40混合標(biāo)準(zhǔn)品 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜級(jí)） 德國(guó)默克公司；茚三酮和鉀鈉緩沖液 德國(guó)Sykam公司；冰乙酸、碳酸鈉、福林-酚、茚三酮等均為國(guó)產(chǎn)分析純；純凈水 杭州娃哈哈公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S-433(D)型全自動(dòng)氨基酸分析儀 德國(guó)Sykam公司；Acquity H-Class UPLC儀 美國(guó)沃特世儀器公司；Pegasus 4D GC×GC-TOFMS聯(lián)用儀 美國(guó)LECO公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；UV3600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；AB104-S電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；5430R高速離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭 美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 感官審評(píng)

委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心對(duì)全部樣品進(jìn)行感官審評(píng)，并分別對(duì)每個(gè)樣品的外形、湯色、香氣、滋味以及葉底的感官品質(zhì)進(jìn)行打分。

1.3.2 主要非揮發(fā)性化學(xué)成分含量及氨基酸組分分析

水浸出物含量：根據(jù)GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測(cè)定》方法；茶多酚總量：根據(jù)GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測(cè)方法》測(cè)定；游離氨基酸總量：根據(jù)GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量測(cè)定》方法；兒茶素組分和咖啡堿含量：采用UPLC法，參照Yang Chen等[18]的方法測(cè)定；氨基酸組成和含量：采用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

1.3.3 GC×GC-TOFMS分析條件

前處理方法：采用頂空-固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）對(duì)茶葉中香氣成分進(jìn)行萃取[12]。65 μm PDMS/DVB萃取頭，茶水比為1∶5（g/mL），提取溫度60 ℃，萃取時(shí)間60 min。

色譜柱：一維柱：DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）；二維柱：DB-17HT（1.9 m×100 μm，0.10 μm）；進(jìn)樣口及傳輸線溫度280 ℃和250 ℃；載氣為氦氣；不分流進(jìn)樣；調(diào)制解調(diào)時(shí)間間隔5.0 s；一維柱升溫程序：先由60 ℃保持3.0 min，以4.0 ℃/min升至280 ℃，保持2.5 min；二維柱升溫程序：先由65 ℃保持3.0 min，以4.0 ℃/min升至285 ℃，保持2.5 min；總分析時(shí)間為33.75 min。

MS條件：電離能量-70 eV；質(zhì)量掃描范圍33～600 u；離子源溫度220 ℃。

1.3.4 GC×GC-TOFMS數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理軟件采用ChromaTOF軟件系統(tǒng)，參數(shù)設(shè)置和化合物定性參考朱蔭等[12]的方法。數(shù)據(jù)預(yù)處理參數(shù)設(shè)置：一維峰寬24；二維峰寬0.2；最低RSN為20；數(shù)據(jù)處理起始時(shí)間3.0～33.75 min。化合物檢索譜庫(kù)選擇NIST2014譜庫(kù)；檢索參數(shù)：化合物名稱、CAS號(hào)、一維色譜保留時(shí)間、二維色譜保留時(shí)間、正相似度、反相似度、可能性、RSN、峰面積及特征離子質(zhì)量數(shù)等。

化合物定性過(guò)程：1）譜庫(kù)檢索初步定性：從譜庫(kù)中選擇正、反相似度均不小于800，可能性不小于1 000的化合物，同時(shí)結(jié)合化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，通過(guò)人工譜圖解析排除雜質(zhì)、柱流失等干擾化合物。2）共有香氣化合物篩選：從初步定性化合物中選擇一維保留時(shí)間差不大于0.1 min，二維保留時(shí)間差不大于0.1 s的共有香氣化合物。3）保留指數(shù)（retention index，RI）驗(yàn)證：通過(guò)正構(gòu)烷烴計(jì)算化合物RI，與參考文獻(xiàn)中報(bào)道的RI進(jìn)行對(duì)比，舍去差值大于20的定性不準(zhǔn)確的化合物。RI按下式[19]計(jì)算：

式中：n為正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；tx為被測(cè)組分保留時(shí)間/min；t（n+1）和tn分別為碳數(shù)為n+1、n的正構(gòu)烷烴保留時(shí)間/min；t（n+1）＞tx＞tn。

香氣化合物含量計(jì)算：采用峰面積歸一法計(jì)算各化合物的相對(duì)含量[20-21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)初步處理，計(jì)算平均含量和標(biāo)準(zhǔn)差以及繪制折線圖等。采用SPSS Statistics 20.0（美國(guó)IBM公司）、SIMCA 14.1（瑞典Umetrics公司）及MultiExperiment Viewer 4.8.1（美國(guó)Oracle公司）進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)[22-23]和相關(guān)性分析[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔烘青綠茶感官審評(píng)結(jié)果

烘青綠茶一般根據(jù)原料嫩度分普通（大宗）烘青綠茶和特種（細(xì)嫩）烘青綠茶[25]，本研究選擇的樣品均為一芽一葉初展至一芽二葉采摘標(biāo)準(zhǔn)制成的特種（細(xì)嫩）烘青綠茶。不同海拔茶葉樣品的感官審評(píng)結(jié)果如表1所示，從外形、湯色、香氣、滋味和葉底這幾個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)看，其各項(xiàng)評(píng)分均在87～92.5 分之間，總分在88.1～91 分之間。可見(jiàn)該批次的茶葉樣品等級(jí)相當(dāng)，具有較好的品質(zhì)特征和代表性。

表1 不同海拔烘青綠茶感官審評(píng)結(jié)果Table 1 Sensory evaluation of baked green tea samples with different altitudes

2.2 不同海拔烘青綠茶主要非揮發(fā)性成分含量分析

茶樹物質(zhì)代謝受氣溫的影響，導(dǎo)致來(lái)自不同海拔高度茶葉中品質(zhì)成分的組成和含量不同。茶葉滋味決定于多種水溶性非揮發(fā)性成分的含量和組成比例。本研究對(duì)不同海拔烘青綠茶的主要非揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如表2所示。不同海拔烘青綠茶中的茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于11.80%～21.60%之間；咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于2.20%～4.30%之間；游離氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于2.64%～6.37%之間；水浸出物含量介于41.10%～49.40%之間；兒茶素總量范圍介于93.32～184.07 mg/g之間；5 種兒茶素單體在不同海拔烘青綠茶中的含量均表現(xiàn)出EGCG＞ECG＞C＞EC＞EGC的分布趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)分析表明，茶多酚、咖啡堿、水浸出物含量、兒茶素總量以及5 種兒茶素單體在不同海拔烘青綠茶中含量水平均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)性差異（P＞0.05）；而游離氨基酸總量在不同海拔烘青綠茶中的含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），在高海拔烘青綠茶中的含量顯著高于低海拔烘青綠茶。由于氨基酸是茶湯鮮爽滋味的重要貢獻(xiàn)物質(zhì)，因此該結(jié)果與滋味感官審評(píng)結(jié)果一致，高海拔烘青綠茶樣品中的滋味感官審評(píng)得分相對(duì)更高，大部分在90.00 分以上，表現(xiàn)出更好的鮮爽滋味。

表2 不同海拔烘青綠茶的主要非揮發(fā)性成分比較Table 2 Comparison of major non-volatile components in baked green tea samples with different altitudes

2.3 不同海拔烘青綠茶的氨基酸組成及含量差異分析

茶葉中游離氨基酸的組成、含量和配比對(duì)茶葉滋味品質(zhì)的構(gòu)成具有重要作用[26]。由于游離氨基酸總量水平在不同海拔烘青綠茶中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2），因此進(jìn)一步分析不同海拔烘青綠茶中的氨基酸組成和含量。由表3可知，不同海拔烘青綠茶中共檢測(cè)到22 種氨基酸，且氨基酸的組成比例具有較高的相似性。其中茶氨酸的含量明顯高于其他氨基酸，其平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在1.03%～1.67%之間。茶氨酸的味覺(jué)閾值相對(duì)較低（0.06%），其在茶湯中的主要呈味特點(diǎn)是鮮爽帶甜[25]，它能在一定程度上增強(qiáng)茶湯的甜味、緩解苦澀味，因此它對(duì)綠茶良好滋味的形成具有非常重要的作用[1]。天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺也是茶葉中含量較高的幾種氨基酸，它們?cè)诓煌０魏媲嗑G茶中平均含量基本介于0.19%～0.37%之間。其次是賴氨酸、精氨酸和色氨酸，其平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在0.09%～0.22%之間。其余氨基酸在不同海拔烘青綠茶中的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本在0.09%以下。此外，部分氨基酸在不同海拔的烘青綠茶中體現(xiàn)出顯著差異性，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，茶氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、絲氨酸和精氨酸在高海拔烘青綠茶中的含量均顯著高于低海拔烘青綠茶（P＜0.05）。而其他氨基酸含量在不同海拔烘青綠茶中不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。茶氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸及絲氨酸主要表現(xiàn)為鮮爽甘甜的滋味特征[25,27]，可能是導(dǎo)致高海拔烘青綠茶鮮甜味更突出的重要原因。

表3 不同海拔烘青綠茶的氨基酸組成分析Table 3 Contents of free amino acids in baked green tea samples with different altitudes%

2.4 不同海拔烘青綠茶香氣成分分析

2.4.1 不同海拔烘青綠茶GC×GC-TOFMS鑒定與分析采用GC×GC-TOFMS技術(shù)對(duì)不同海拔烘青綠茶中的香氣成分進(jìn)行鑒定和分析。如圖1所示，經(jīng)NIST2014譜庫(kù)自動(dòng)檢索，初步匹配出不同海拔烘青綠茶香氣成分中的上千個(gè)色譜峰。然后根據(jù)1.3.4節(jié)數(shù)據(jù)處理方法，通過(guò)篩選正、反相似度（≥800）和可能性（≥1 000），再結(jié)合保留時(shí)間、特征離子質(zhì)量數(shù)以及手動(dòng)比對(duì)分析，從不同海拔烘青綠茶樣品中共初步鑒定出600余種共有香氣成分；繼而通過(guò)對(duì)比RI文獻(xiàn)值和計(jì)算值，保留二者差值在20以內(nèi)的化合物，刪除RI差值大于20的化合物[13]。RI差值較大化合物一般屬于定性錯(cuò)誤，所以通過(guò)RI的對(duì)比篩選，可以排除定性有誤的化合物，從而實(shí)現(xiàn)不同海拔烘青綠茶香氣成分的精確定性分析。

圖1 烘青綠茶香氣成分的3D色譜圖（A）和總離子流圖（B）Fig. 1 3D chromatogram (A) and total ion current chromatogram (B) of aroma components in baked green tea

通過(guò)上述一系列篩選，最終在不同海拔烘青綠茶中鑒定出298 種香氣成分。這些香氣成分按照化合物類別可分為16 類，分別為醛類、醇類、烯烴類、烷烴類、酮類、芳香烴類、有機(jī)酸類、酯類、內(nèi)酯類、酚類、炔類、胺類、醚類、氧雜環(huán)化合物、含氮化合物及含硫化合物。各類別化合物的相對(duì)含量及化合物數(shù)目分布如圖2所示。在高海拔烘青綠茶中以醛類化合物相對(duì)含量最高，占所有香氣成分的28.55%，烷烴類化合物相對(duì)含量排名第2，占所有香氣成分的18.20%；而在低海拔烘青綠茶中烷烴類化合物的相對(duì)含量最高（24.07%），醛類化合物相對(duì)含量居第2位，占所有香氣成分的23.09%；醇類、烯烴類、酮類、芳香烴類及氧雜環(huán)化合物在高、低海拔烘青綠茶中的分布趨勢(shì)保持一致，其相對(duì)含量依次遞減，介于3.96%～16.03%之間；上述7 類化合物相對(duì)含量總和占所有香氣成分的90%以上，而含氮化合物、酯類、有機(jī)酸類等9 類化合物的相對(duì)含量總和不足所有香氣成分的10%。按照各類化合物檢出數(shù)量看，烯烴類化合物（52 種）最多，其次是酮類化合物（47 種）；醛類和烷烴類化合物作為相對(duì)含量最高的2類化合物，其化合物也較多，分別為34 種和35 種化合物；檢出超過(guò)10 種的化合物還有醇類、芳香烴類、氧雜環(huán)化合物、含氮化合物和酯類，其余類別化合物在10 種以下。

圖2 不同海拔烘青綠茶中各類香氣化合物的相對(duì)含量及數(shù)目Fig. 2 Relative content and number of aroma components in each class in baked green tea samples with different altitudes

2.4.2 不同海拔烘青綠茶香氣成分含量差異比較及關(guān)鍵差異性香氣成分的鑒定

2.4.2.1 不同海拔烘青綠茶香氣成分含量差異比較

從不同海拔烘青綠茶中鑒定出的298 種香氣化合物及其相對(duì)含量如表4所示。醛類化合物中，戊醛和己醛的相對(duì)含量居前兩位，在高海拔烘青綠茶中，戊醛平均相對(duì)含量最高（10.26%），己醛相對(duì)含量次之（7.41%）；而在低海拔烘青綠茶中，己醛相對(duì)含量最高（6.56%），戊醛相對(duì)含量次之（5.90%）。不論在高海拔還是低海拔烘青綠茶中，均以庚醛（高海拔3.71%，低海拔2.90%）含量排名第3；平均相對(duì)含量大于1%的醛類化合物還有辛醛、壬醛和苯甲醛等（1.22%～2.21%）。在烷烴類化合物中，2,3-二甲基癸烷（高海拔5.29%，低海拔6.16%）和2,4-二甲基癸烷（高海拔5.28%，低海拔7.28%）平均相對(duì)含量居前兩位；2,5,6-辛烷（高海拔1.89%，低海拔2.35%）含量排第3；平均相對(duì)含量較高的化合物還有辛烷、4-甲基辛烷、3-乙基-3-甲基庚烷、2,2,6-三甲基辛烷和3-甲基十一烷（0.46%～1.20%）等。

表4 不同海拔烘青綠茶中的香氣化合物相對(duì)含量Table 4 Relative contents of aroma components in baked green tea samples with different altitudes

醇類化合物中，正戊醇相對(duì)含量最高（高海拔6.11%，低海拔4.78%）；順-3-己烯醇（高海拔3.79%，低海拔3.26%）、芳樟醇（高海拔3.06%，低海拔3.10%）、1-戊烯-3-醇（高海拔2.27%，低海拔1.81%）相對(duì)含量次之。烯烴類化合物中，β-月桂烯相對(duì)含量最高（高海拔2.07%，低海拔2.10%）；順式-2,3-二甲基庚烯（高海拔1.59%，低海拔1.92%）、檸檬烯（高海拔1.26%，低海拔1.87%）次之。酮類化合物中，相對(duì)含量最高為4-甲基-3-戊烯-2-酮（高海拔3.79%，低海拔4.24%），其次為2-庚酮（高海拔1.13%，低海拔1.22%），其余化合物相對(duì)含量均在0.55%以下。在芳香烴類化合物中，鄰異丙基甲苯（高海拔1.55%，低海拔1.76%）相對(duì)含量最高，甲苯和間二甲苯相對(duì)含量也較高，在0.89%～1.30%之間；其余化合物相對(duì)含量都在0.36%以下。氧雜環(huán)化合物中，2-戊基呋喃（高海拔2.34%，低海拔2.31%）相對(duì)含量最高，2-乙基呋喃（高海拔0.68%，低海拔0.79%）相對(duì)含量次之。在有機(jī)酸類、酯類、內(nèi)酯類、酚類、炔類、胺類、醚類、含氮化合物及含硫化合物類香氣化合物中，相對(duì)含量最高的為N-乙基吡咯（高海拔1.75%，低海拔1.66%），而異戊腈在高海拔烘青綠茶中相對(duì)含量較高（1.04%），低海拔烘青綠茶中相對(duì)含量較低（0.32%）；其余化合物相對(duì)含量基本在0.59%以下。

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

2.4.2.2 不同海拔烘青綠茶中關(guān)鍵差異性香氣成分鑒定

偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）是基于偏最小二乘法回歸的一種判別方式，PLS-DA變量重要性因子（variable important for the projection，VIP）值可以量化PLS-DA的每個(gè)變量對(duì)分組的貢獻(xiàn)，VIP值大于1的化合物，可作為2 組變量互相區(qū)分的關(guān)鍵化合物[26]。采用SIMCA 14.1軟件對(duì)不同海拔烘青綠茶中鑒定出的298 種香氣化合物進(jìn)行分析，基于香氣成分的相對(duì)含量建立PLS-DA模型（擬合參數(shù)為通過(guò)該模型成功區(qū)分高海拔和低海拔2 組樣品，并從298 種香氣成分中鑒定出影響烘青綠茶香氣的83種關(guān)鍵香氣成分（VIP＞1）。PLS-DA得分圖如圖3A所示。由圖3B PLS-DA驗(yàn)證模型可見(jiàn)，Q2回歸直線與Y軸的截距均小于0，表明該P(yáng)LS-DA模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象，模型較為可靠（R2=0.693，Q2=-0.32）。

圖3 不同海拔烘青綠茶香氣成分PLS-DA得分圖（A）及其驗(yàn)證模型（B）Fig. 3 Score plot (A) and validation (B) of PLS-DA model of aroma components in baked green tea samples with different altitudes

采用SPSS Statistics 20.0對(duì)這83種關(guān)鍵香氣成分進(jìn)行Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)，最終篩選出26 種香氣化合物在高海拔和低海拔2 組樣品之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。這些關(guān)鍵差異香氣成分分別為異戊腈、α-水芹烯、吲哚、3-戊烯-2-酮、2-甲基戊醛、乙酰丙酮、4-甲基辛烷、3-乙基庚烷、順式-2-庚烯醛、1-辛烯-3-酮、(反,反)-2,4-庚二烯醛、3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮、1-苯基-1-丙炔、4-丙基甲苯、1,2,3,4-四甲基苯、4-甲基茚滿、辛酸、萘、異戊酸己酯、1-甲基萘、α-柏木萜烯、β-柏木烯、亞聯(lián)苯、α-法尼烯、花側(cè)柏烯和橙花叔醇。

由于茶葉香氣化合物種類繁多、成分復(fù)雜，本研究通過(guò)降維手段將目標(biāo)聚焦到上述26 種關(guān)鍵差異性香氣成分上。由于揮發(fā)性化合物的氣味特征及嗅聞閾值差別較大，因此各化合物對(duì)茶葉香氣形成的貢獻(xiàn)情況也差別較大。有研究表明，橙花叔醇、吲哚、萘、(反,反)-2,4-庚二烯醛、1-辛烯-3-酮和辛酸等是某些綠茶、紅茶或?yàn)觚埐柚械年P(guān)鍵呈香成分[30]，它們對(duì)茶葉香氣品質(zhì)的形成有重要作用。例如，吲哚（花香）等是西湖龍井和金萱烏龍茶中的特征香氣成分[31-32]；橙花叔醇（花香）是西湖龍井和鐵觀音中的關(guān)鍵活性香氣成分[31,33]；(反,反)-2,4-庚二烯醛（甜香）是甜香型“安吉紅茶”和花香、甜香型紅茶中的呈香活性成分之一[34-35]。而4-甲基辛烷、3-乙基庚烷等烷烴類成分并無(wú)明顯的氣味特征，對(duì)茶葉香氣品質(zhì)形成并未起到直接的促進(jìn)作用[12]。

2.5 關(guān)鍵差異品質(zhì)成分在不同海拔烘青綠茶中的分布特征分析

綜上統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果可知，游離氨基酸總量、茶氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸等氨基酸類化學(xué)成分以及異戊腈、α-水芹烯、吲哚、3-戊烯-2-酮、2-甲基戊醛、乙酰丙酮、4-甲基辛烷、3-乙基庚烷、順式-2-庚烯醛、1-辛烯-3-酮、(反,反)-2,4-庚二烯醛、3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮、1-苯基-1-丙炔、4-丙基甲苯、1,2,3,4-四甲基苯、4-甲基茚滿、辛酸、萘、異戊酸己酯、1-甲基萘、α-柏木萜烯、β-柏木烯、亞聯(lián)苯、α-法尼烯、花側(cè)柏烯和橙花叔醇等香氣化合物在不同海拔烘青綠茶中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。為了直觀地展示這些差異化合物在不同海拔烘青綠茶中的分布規(guī)律，采用層序聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）對(duì)這些關(guān)鍵差異化合物進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4，其中紅色表示化合物在茶樣中含量高于平均值，紅色越深表示含量越高；綠色代表化合物在茶樣中含量低于平均值，綠色越深表示含量越低。

由圖4可以看出，這32 種差異性成分的含量分布具有較強(qiáng)的規(guī)律性，其中游離氨基酸總量、茶氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸等氨基酸類化合物以及異戊腈在高海拔烘青綠茶中（H1～H8）含量顯著高于低海拔烘青綠茶（L1～L5）。已有多項(xiàng)研究表明氨基酸在較高海拔樣品中含量更高[4-8]，本研究結(jié)果也進(jìn)一步印證了這一結(jié)論。一般認(rèn)為高海拔茶園具有相對(duì)低溫、高濕和多云霧的氣候特征，相對(duì)低溫導(dǎo)致茶葉生長(zhǎng)緩慢，有利于氨基酸等含氮化合物的合成和積累[1]。異戊腈屬于含氮香氣化合物，因此推斷它的積累在一定程度上也受到海拔因素的影響。此外，α-水芹烯、吲哚等25 種香氣化合物在低海拔烘青綠茶中（L1～L5）含量總體較高，但不同香氣化合物在各樣品中的含量表現(xiàn)又不盡相同，比如，4-丙基甲苯、α-水芹烯、3-戊烯-2-酮、橙花叔醇和吲哚這5 種香氣化合物在低海拔樣品中含量均普遍較高；β-柏木烯、1,2,3,4-四甲基苯、4-甲基茚滿、α-柏木萜烯、α-法尼烯、花側(cè)柏烯、乙酰丙酮、異戊酸己酯和2-甲基戊醛在L3和L4樣品中的含量顯著高于其他低海拔樣本；此外，1-甲基萘、萘、亞聯(lián)苯、1-苯基-1-丙炔在L2及L5樣本中含量顯著較高，4-甲基辛烷、3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮、3-乙基庚烷、(反,反)-2,4-庚二烯醛、順式-2-庚烯醛、1-辛烯-3-酮和辛酸在L1和L5樣本中含量顯著較高。同時(shí)這些化合物在高海拔烘青綠茶中含量普遍較低，特別體現(xiàn)在700～800 m較高海拔樣品（H3、H4）中；結(jié)合所有關(guān)鍵差異性品質(zhì)成分分布可以看出，650 m海拔高度的烘青綠茶H2樣品中以上化合物含量都普遍較高，結(jié)合感官審評(píng)結(jié)果，所制備的綠茶也具有較高的審評(píng)得分，說(shuō)明該海拔高度比較適合制備烘青綠茶。唐顥等[36]的研究表明，300～400 m海拔高度鳳凰單叢茶鮮葉中吲哚和反-橙花叔醇等香氣化合物相對(duì)含量較高，這與本研究結(jié)果基本一致，但其他香氣成分與本研究存在一定差異。“周寧高山云霧茶”中高海拔（600～900 m）綠茶以順式-α-法尼烯等為特征香氣物質(zhì)[11]，與本研究結(jié)論也有所不同。究其原因主要是研究對(duì)象不同，同時(shí)不同的香氣富集方法、儀器靈敏度等都會(huì)直接影響茶葉香氣的定性和定量結(jié)果。因此導(dǎo)致不同研究之間較難得到完全一致的結(jié)論。

圖4 不同海拔烘青綠茶中差異成分熱圖Fig. 4 Heatmap of differential components in baked green tea samples with different altitudes

2.6 相關(guān)性分析

采用SPSS Statistics 20.0分析在不同海拔烘青綠茶中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的化合物含量與海拔高度、滋味及香氣審評(píng)得分之間的相關(guān)性。如表5所示，茶氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及游離氨基酸總量與滋味感官得分呈顯著正相關(guān)，尤其茶氨酸的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.823，說(shuō)明以上化合物對(duì)烘青綠茶茶湯滋味的形成有十分重要的貢獻(xiàn)。在香氣方面，由于各樣品間的香氣審評(píng)得分差異較小，因此香氣得分與這些化合物之間并不存在顯著相關(guān)（P＞0.05），今后將擴(kuò)大樣本量，系統(tǒng)研究香氣化合物與香氣品質(zhì)間的具體關(guān)聯(lián)性。

表5 相關(guān)性分析結(jié)果Table 5 Correlation analysis between altitude and taste and aroma components

值得注意的是，雖然香氣化合物與感官品質(zhì)間未呈現(xiàn)顯著相關(guān)，但部分化合物與烘青綠茶的海拔高度間呈現(xiàn)出一定的關(guān)聯(lián)性，且均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，包括順式-2-庚烯醛、3-戊烯-2-酮、4-甲基辛烷、3-乙基庚烷、1-辛烯-3-酮、α-水芹烯、(反,反)-2,4-庚二烯醛、3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮及4-甲基茚滿等，其中順式-2-庚烯醛與海拔高度的負(fù)相關(guān)達(dá)-0.693。綠茶香氣形成機(jī)制非常復(fù)雜，它是鮮葉中糖、氨基酸、脂肪酸、糖苷等內(nèi)含物在茶樹生長(zhǎng)和茶葉加工過(guò)程中進(jìn)行生物合成、酶促反應(yīng)和劇烈的熱物理化學(xué)作用的結(jié)果[1]，主要源于糖苷前體水解、脂肪酸和類胡蘿卜素氧化或高溫下氨基酸的美拉德反應(yīng)，因此茶葉香氣成分含量與這些前體物質(zhì)有直接關(guān)系。茶葉香氣中大量存在醇類、醛類及內(nèi)酯類化合物等通常是由飽和或不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化而來(lái)[37]。比如本研究中與海拔高度呈顯著負(fù)相關(guān)的順式-2-庚烯醛就是以不飽和脂肪酸為前體。前人研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)性系茶鮮葉中不飽和脂肪酸含量與海拔在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其總量隨海拔升高有所降低[38]。此外，在浙江紅花油茶和牡丹種子的研究中也發(fā)現(xiàn)類似規(guī)律[39-40]。由此可以初步推斷，脂肪酸和不飽和脂肪酸的積累與海拔有一定關(guān)系，較低的海拔條件更有利于脂肪酸和不飽和脂肪酸的生成，而豐富的不飽和脂肪酸可以為順式-2-庚烯醛以及(反,反)-2,4-庚二烯醛等脂肪族醛類化合物的生成提供更充足的物質(zhì)儲(chǔ)備，從而進(jìn)一步佐證了順式-2-庚烯醛等化合物與海拔呈負(fù)相關(guān)。因此推斷，上述香氣成分與海拔呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的部分原因可能是其前體物質(zhì)的形成和積累受海拔因素的影響。

3 結(jié) 論

為了查明海拔與茶葉中主要品質(zhì)化學(xué)成分的關(guān)系，本研究對(duì)產(chǎn)自400～1 102 m海拔高度的13個(gè)代表性烘青綠茶的品質(zhì)成分進(jìn)行全面分析。研究表明，游離氨基酸總量、茶氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、絲氨酸和精氨酸在不同海拔烘青綠茶中的含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。采用GC×GC-TOFMS技術(shù)鑒定出不同海拔烘青綠茶中共有298 種香氣成分，并查明異戊腈、α-水芹烯、吲哚等26 種香氣化合物是高、低海拔烘青綠茶中的關(guān)鍵差異性香氣成分。通過(guò)對(duì)關(guān)鍵差異化合物聚類分析可知，在高海拔烘青綠茶中，游離氨基酸總量、茶氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸和異戊腈含量普遍較高；α-水芹烯、吲哚等25 種香氣化合物在低海拔烘青綠茶中含量較高。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，茶氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及游離氨基酸總量與滋味感官得分呈顯著正相關(guān)。順式-2-庚烯醛等9種香氣化合物與海拔高度呈顯著負(fù)相關(guān)，初步推斷，可能是由于前體物質(zhì)的形成和積累受到海拔因素的影響。以上研究結(jié)果有助于提高人們對(duì)不同海拔烘青綠茶品質(zhì)成分分布的科學(xué)認(rèn)知，其結(jié)果深化了茶葉化學(xué)理論知識(shí)體系，并為后續(xù)開(kāi)展茶葉滋味和香氣品質(zhì)形成機(jī)理研究以及茶葉品質(zhì)提高與定向調(diào)控技術(shù)研究提供了理論基礎(chǔ)。