紅油香椿生長期主要活性物質(zhì)及揮發(fā)性成分動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

史冠瑩，趙麗麗，王曉敏，張 樂，蔣鵬飛，王旭增，王趙改

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450000）

香椿（Toona sinensis(A.Juss.) Rome）屬于楝科香椿屬多年生植物，是我國特有的集食用、藥用、材用為一身的木本植物，在全國22個(gè)省區(qū)均有規(guī)模化種植[1-2]。香椿由于其風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)價(jià)值高而深受消費(fèi)者喜愛，是理想的綠色保健食品，具有很大的市場開發(fā)潛力[3-5]。香椿含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和多種植物次生代謝物質(zhì)，包括氨基酸、蛋白質(zhì)、可溶性糖、VC、多酚類、黃酮類、皂苷、萜類、生物堿、苯丙素類和含硫及含氮化合物等，這些化合物是香椿具有食用價(jià)值、醫(yī)療保健功能和抗菌殺蟲作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[6-8]。

產(chǎn)地氣候、生長環(huán)境、生長期等因素均會(huì)對香椿中的物質(zhì)組成及含量造成影響，進(jìn)而影響香椿品質(zhì)。目前研究主要集中在不同產(chǎn)地香椿營養(yǎng)成分及香氣成分的影響，而不同生長期對香椿活性物質(zhì)及揮發(fā)性成分的研究較少[9-11]。楊慧等[12]采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對紅油香椿嫩芽的不同生長期（嫩芽長度5～30 cm期間采摘）揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，共檢測到揮發(fā)性化合物35 種，隨著香椿嫩芽的不斷生長，羰基類、含硫類、醇類整體均呈先上升后下降的趨勢，烯類整體呈先下降后上升趨勢，烴類、其他類均逐漸下降。朱永清等[13]通過GC-MS技術(shù)分析測定了“巴山紅”香椿芽葉5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果顯示在不同發(fā)育時(shí)期揮發(fā)性組分的種類及相對含量具有明顯差異，對香椿芽葉呈味特性影響較大的物質(zhì)主要集中在醇類、酯類、醛類和萜烯類化合物。

GC-MS是目前分析揮發(fā)性化合物中最常用的技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于香椿揮發(fā)性成分研究[14-17]。氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技術(shù)是近年來新興的一種分析方法，該技術(shù)是利用GC的高分離能力與IMS的高分辨、高靈敏度等優(yōu)勢，彌補(bǔ)了GC-MS對痕量小分子物質(zhì)檢測靈敏度與重現(xiàn)性不足的問題，且樣品幾乎不需要任何前處理，目前也廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味分析、品質(zhì)鑒定等不同領(lǐng)域中[18-20]，但在香椿的揮發(fā)性物質(zhì)分析研究中鮮見報(bào)道。GC-MS和GC-IMS兩種技術(shù)結(jié)合可充分利用GC-IMS的快速靈敏性以及GC-MS的高效性，能更加全面科學(xué)地對不同生長期香椿的揮發(fā)性成分變化進(jìn)行分析研究。

聚類分析（cluster analysis，CA）法又稱群分析，是在沒有給定劃分類別的情況下，根據(jù)數(shù)據(jù)相似度進(jìn)行樣本分組的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠以分類圖的形式進(jìn)行直觀地系統(tǒng)分析[21]。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種多變量統(tǒng)計(jì)方法，其可降低由大量相關(guān)變量組成的數(shù)據(jù)集維數(shù)，并盡可能保留數(shù)據(jù)集中存在的變化[22]。

本研究以不同生長期的紅油香椿為原料，比較分析不同生長期香椿中主要活性物質(zhì)（總黃酮、總多糖、總皂苷、總生物堿）的含量變化，利用GC-MS和GC-IMS技術(shù)快速檢測不同生長期紅油香椿中揮發(fā)性化合物，并結(jié)合CA和PCA不同生長期紅油香椿揮發(fā)性化合物的變化，從而為綜合評價(jià)香椿的質(zhì)量品質(zhì)及香椿資源的綜合利用開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香椿葉采自河南新鄉(xiāng)原陽縣河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地。于2019年4—10月每月采樣，選取新鮮、無病蟲害的香椿葉，切碎后加液氮研磨，得到香椿濕樣，冷凍備用。

人參皂苷、鹽酸小檗堿、蘆丁（均為優(yōu)級純）北京索萊寶生物科技有限公司；無水葡萄糖 天津市化學(xué)試劑六廠三分廠；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；高純氮?dú)猓兌取?9.999%）由Chemtron制氮機(jī)制備；15 mL頂空瓶 浙江哈邁科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；H1850R型高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀公司；SB-5200DTD型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；QL-901型旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GENESYS 10S型紫外-可見分光光度計(jì) 美國熱電公司；7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀、HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）固相微萃取頭美國Supelco公司；FlavourSpec GC-IMS聯(lián)用儀 德國G.A.S公司；MXT-5色譜柱（15 m×0.53 mm，0.53 μm）美國Restek公司。

1.3 方法

1.3.1 主要活性物質(zhì)測定

1.3.1.1 黃酮提取及含量測定

精確稱取冷凍香椿濕樣（5.00±0.003）g置于帶塞三角瓶中，加入20 倍體積的70%乙醇溶劑，基于前期多次預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定黃酮超聲輔助提取條件：超聲功率為180 W，溫度為50 ℃，提取時(shí)間為40 min，重復(fù)提取2 次，抽濾除去濾渣，得到待測提取液。

總黃酮含量的測定采用硝酸鋁顯色法[23]，略有改動(dòng)。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長510 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)y，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測黃酮提取液樣品按照上述方法測定吸光度，平行測定3 次。將測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品質(zhì)量濃度，換算出香椿樣品總黃酮含量。

1.3.1.2 多糖提取及含量測定

經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定多糖提取條件。精確稱取冷凍香椿濕樣（5.00±0.003）g，10 mL蒸餾水浸潤樣品，緩慢加入40 mL無水乙醇，同時(shí)使用渦旋振蕩器振搖，使混合均勻，超聲提取30 min，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液；不溶物用50 mL水轉(zhuǎn)移至三角瓶，超聲提取30 min，提取2 次，除去沉淀，轉(zhuǎn)移上清液至100 mL容量瓶中，定容到100 mL。此溶液為樣品測定液。

總多糖含量的測定采用苯酚-硫酸顯色法[24]。以無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長490 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)y，無水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測多糖提取液樣品按照上述方法測定吸光度，平行測定3 次。將測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品質(zhì)量濃度，換算出香椿樣品總多糖含量。

1.3.1.3 皂苷提取及含量測定

精確稱取冷凍香椿濕樣（5.00±0.003）g置于帶塞三角瓶中，加入20 倍體積的70%乙醇溶劑，基于前期多次預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定皂苷超聲輔助提取條件：超聲功率為180 W，溫度為50 ℃，提取時(shí)間為40 min，重復(fù)提取2 次，抽濾除去濾渣，得到待測提取液。

總皂苷含量的測定采用香草醛-冰乙酸比色法[25]，略有改動(dòng)。以人參皂苷為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長560 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)y，皂苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測皂苷提取液樣品按照上述方法測定吸光度，平行測定3 次。將測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品質(zhì)量濃度，換算出香椿樣品總皂苷含量。

1.3.1.4 生物堿提取及含量測定

精確稱取冷凍香椿濕樣（5.00±0.003）g置于帶塞三角瓶中，加入20 倍體積的70%乙醇溶劑，基于前期多次預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定生物堿超聲輔助提取條件：超聲功率180 W、溫度50 ℃、提取時(shí)間40 min，重復(fù)提取2 次，抽濾除去濾渣，得到待測提取液。

總生物堿含量的測定采用分光光度法[26]。以鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長345 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)y，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測提取液樣品按照上述方法測定吸光度，平行測定3 次。將測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品質(zhì)量濃度，換算出香椿樣品總生物堿含量。

1.3.2 揮發(fā)性成分分析

1.3.2.1 GC-MS測定

頂空固相微萃?。簻?zhǔn)確稱?。?.00±0.003）g冷凍香椿濕樣于15 mL固相微萃取頂空瓶里，密封后于40 ℃水浴中平衡15 min，將250 ℃老化過的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入到頂空瓶中，40 ℃水浴萃取30 min后取出萃取頭，再將萃取頭插入GC-MS聯(lián)用儀，250 ℃解吸5 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

GC條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He；進(jìn)樣口溫度250 ℃，無分流比，柱流速1 mL/min。程序升溫：初溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至150 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至230 ℃，保持5 min結(jié)束。

MS條件：電子電離源；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；輔助加熱器250 ℃；質(zhì)量掃描范圍40～800 u。

1.3.2.2 GC-IMS測定

樣品測定：準(zhǔn)確稱取（0.20±0.003）g冷凍香椿濕樣，裝入20 mL專用頂空進(jìn)樣瓶中，40 ℃孵化10 min，通過頂空進(jìn)樣用GC-IMS進(jìn)行測定。

頂空進(jìn)樣條件：孵育溫度40 ℃；孵育時(shí)間10.0 min；孵育轉(zhuǎn)速250 r/min；頂空進(jìn)樣針溫度80 ℃；進(jìn)樣體積200 μL，不分流模式；載氣：高純氮?dú)猓兌取?9.999%）；清洗時(shí)間0.5 min。

GC條件：MXT-5色譜柱（15 m×0.53 mm，0.53 μm）；色譜柱溫度60 ℃；載氣：高純氮?dú)猓兌取?9.999%）；載氣流速程序：初始2.0 mL/min，保持2 min，在2～10 min線性增至5.0 mL/min，在10～20 min線性增至50.0 mL/min，在20～30 min線性增至100.0 mL/min。

IMS條件：放射源為β射線（氚，6.5 keV）；正離子模式；漂移管長度9.8 cm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣為高純氮?dú)猓兌取?9.999%）；漂移氣流速150 mL/min。

1.3.2.3 定性與定量分析

GC-MS測定數(shù)據(jù)應(yīng)用GC-MS儀器內(nèi)置的NIST08.LIB譜庫對GC-MS檢測到的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定。GC-IMS測定數(shù)據(jù)采用GC-IMS儀器自帶的GC×IMS Library Search定性分析軟件對GC-IMS檢測到的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定。

1.3.3 CA

將GC-MS鑒定出的7個(gè)生長期香椿樣品（S1～S7）中的12個(gè)共有物質(zhì)的相對含量作為變量，得到7×12階原始數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入SPSS 19.0軟件，采用組間連接法，以歐式距離平方為分類依據(jù)，相似度越大，2個(gè)樣品之間的距離越近。

1.3.4 指紋圖譜

為更直觀且定量地比較不同生長期香椿樣品中的揮發(fā)性化合物差異，采用GC-IMS設(shè)備內(nèi)置的LAV軟件的GalleryPlot插件，自動(dòng)生成香椿生長期的指紋圖譜。圖中每一行代表一個(gè)生長期香椿樣品中所含的揮發(fā)性化合物，每一列是不同生長期樣品之間同一種揮發(fā)性化合物的差異。顏色的深淺代表揮發(fā)性化合物的含量，顏色越深，含量越高。

1.3.5 PCA

通過GC-IMS設(shè)備內(nèi)置的LAV軟件的Dynamic PCA插件對不同生長期的香椿樣品進(jìn)行PCA，以GC-IMS鑒定出的不同生長期14個(gè)香椿樣品（每個(gè)生長期測定2 次）中的50 個(gè)揮發(fā)性成分對應(yīng)的峰高為變量形成14×50階原始數(shù)據(jù)，通過對數(shù)據(jù)特征的降維處理，進(jìn)行PCA。

1.3.6 二維圖譜定性分析

根據(jù)GC×IMS Library Search定性分析軟件內(nèi)置的IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫以及NIST2014保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫對不同生長期香椿樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行二維定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行CA；Gallery plot軟件繪制指紋圖譜；Dynamic PCA1.1.0軟件進(jìn)行PCA；DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，P＜0.05，差異顯著。分析軟件LAV2.2.1和GC×IMS Library Search1.0.3為德國G.A.S公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長期紅油香椿的活性物質(zhì)含量變化

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別以蘆丁、無水葡萄糖、人參皂苷及鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)品，采用分光光度法建立總黃酮、多糖、皂苷及生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程見表1。

表1 活性物質(zhì)回歸方程Table 1 Regression equations for quantification of active substances

2.1.2 活性物質(zhì)含量變化

取2019年4—10月每月采收的紅油香椿葉共7 批，分析其含有的主要活性物質(zhì)，結(jié)果如表2所示，在7 批不同采收期的紅油香椿樣品中，通過分析不同時(shí)期采收香椿葉中的4 種活性成分含量，發(fā)現(xiàn)均有明確的累積規(guī)律，其中總黃酮、總多糖和總生物堿的含量在10月達(dá)到最高，而總皂苷的含量在9月最高。各生長期紅油香椿中4 種活性物質(zhì)的含量變化整體呈現(xiàn)上升趨勢，因此以活性物質(zhì)為目標(biāo)加工香椿類產(chǎn)品時(shí)，應(yīng)以9—10月采集其老葉為宜，并且此生長期香椿葉產(chǎn)量也較大。

表2 不同生長期香椿活性成分比較Table 2 Contents of active components in T. sinensis leaves at different growth stages mg/g

2.2 基于GC-MS分析生長期香椿的揮發(fā)性成分

2.2.1 生長期紅油香椿揮發(fā)性成分的變化規(guī)律

將閾值設(shè)為18，采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)，對不同生長期紅油香椿葉中的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測分析，同時(shí)與NIST08.LIB質(zhì)譜庫相匹配，得出各揮發(fā)性化合物的名稱及相對含量如表3所示，匹配度80%以上，不同生長期的紅油香椿葉樣品中共檢出109種揮發(fā)性化合物成分，其C鏈均在C6～C20之間，其中4月檢出53種，5月檢出32 種，6月檢出48 種，7月檢出45 種，8月檢出63種，9月檢出61 種，10月檢出42 種。

表3 生長期香椿揮發(fā)性成分及其相對含量Table 3 Volatile compounds and their relative contents in T. sinensis leaves during its growth period

續(xù)表3

續(xù)表3

如表3所示，不同月份的紅油香椿葉中揮發(fā)性化合物種類涉及萜烯類、醛類、含硫類、酯類、醇類、酮類、烴類及其他類（雜環(huán)類等）共8 類化合物。整個(gè)生長期中相對含量較高的為萜烯類、醛類和含硫類化合物，這3 類化合物在不同生長期樣品中的相對含量之和在82.73%～94.87%之間，構(gòu)成了香椿的主要香氣物質(zhì)。其中萜烯類化合物總含量在生長期整體呈現(xiàn)先上升再下降變化趨勢，且在7月達(dá)到峰值；醛類化合物總含量在生長期整體呈現(xiàn)上升變化趨勢，且在10月增至最大值；而含硫類化合物總含量在生長期整體呈現(xiàn)先下降再上升變化趨勢，在5月達(dá)到峰值，而在8月最低，與萜烯類化合物變化趨勢相反（圖1）。

圖1 生長期香椿主要香氣成分含量變化Fig. 1 Changes in contents of aroma components in T. sinensis leaves during its growth period

紅油香椿不同生長期中鑒定出共有化合物為12 種，其中萜烯類5 種（古巴烯、石竹烯、Z,Z,Z-1,5,9,9-四甲基-1,4,7-環(huán)十一碳三烯、π-愈創(chuàng)木烯、β-蛇床烯）；醛類2 種（己醛、2-己烯醛）；含硫類化合物3種（2,4-二甲基噻吩、二烯丙基二硫化物、2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩）；酮類1 種（甲基庚烯酮）和其他1 種（異香橙烯環(huán)氧化物）。12 種共有化合物在不同生長期樣品中的相對含量之和占比在56.06%～90.75%之間，尤其是5月香椿葉中12 種共有化合物的相對含量之和占比高達(dá)90.75%，由此可見香椿葉中的香氣成分隨生長期變化有所差異，但主要香氣構(gòu)成上呈現(xiàn)一定的穩(wěn)定性。進(jìn)一步分析共有化合物的動(dòng)態(tài)變化趨勢，發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)2-己烯醛相對含量隨生長期呈升高趨勢，在10月達(dá)到峰值24.05%，與醛類物質(zhì)總的變化趨勢一致。萜烯類物質(zhì)石竹烯相對含量整體呈先升后降的變化趨勢，在7月達(dá)到峰值50.23%，與萜烯類物質(zhì)總的變化趨勢一致。含硫類物質(zhì)2,4-二甲基噻吩相對含量整體呈先升后降的變化趨勢，在5月達(dá)到峰值24.13%，2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩相對含量隨生長期呈下降趨勢，在4月相對含量最高達(dá)31.72%。在12個(gè)共有物質(zhì)中，石竹烯具有明顯的辛香、木香[27]，2-己烯醛具有典型的青草香氣[28]，二烯丙基二硫化物具有強(qiáng)烈的烤洋蔥味[29]，2-巰基-3,4-二甲基-2,3-二氫噻吩具有明顯的煮熟洋蔥味、類似香椿味[30]，這些共有化合物對香椿的特征風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，且總相對含量在5月香椿中達(dá)到最大值81.35%，這為香椿風(fēng)味在食品中應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

2.2.2 生長期紅油香椿共有揮發(fā)性成分CA

如圖2所示，7個(gè)月份紅油香椿樣品可聚為2 類，7、8、9、10月樣品聚為第1類，4、5、6月樣品聚為第2類。當(dāng)類間距為11時(shí)，根據(jù)第1類樣品的差異又可將其分為2 類，7、8月樣品聚為1 類，9、10月樣品聚為1 類；當(dāng)類間距為6時(shí)，根據(jù)第2類樣品的差異可將其分為2 類，4、5月樣品聚為1 類，6月樣品單獨(dú)聚為1 類。以上結(jié)果表明，不同生長期香椿共有揮發(fā)性成分的含量存在差異，CA可以將不同月的香椿樣品區(qū)別開，聚為1 類的樣品之間的相似度較高。

圖2 香椿樣品揮發(fā)性成分的CA樹狀圖Fig. 2 Cluster analysis dendrogram of volatile components in T. sinensis leaves at different growth stages

2.3 基于GC-IMS分析生長期紅油香椿的揮發(fā)性成分

2.3.1 生長期紅油香椿中揮發(fā)性成分變化規(guī)律

不同生長期的紅油香椿樣品中的揮發(fā)性成分通過GC-IMS很好地分離，大部分信號(hào)出現(xiàn)在漂移時(shí)間為1.0～1.7 ms和保留時(shí)間為100～1 000 s的區(qū)域，在不同生長期紅油香椿樣品中共計(jì)鑒定出49種揮發(fā)性化合物（表4），部分化合物濃度高會(huì)產(chǎn)生二聚體，它們保留時(shí)間與單體相近，但遷移時(shí)間不同可區(qū)別開。49種揮發(fā)性化合物的碳鏈在C4～C10之間，主要包括醇類16 種、醛類14 種、萜烯類4 種、酯類4 種、酮類4 種、酸類2 種、含硫類2 種以及雜環(huán)化合物3種。

表4 GC-IMS鑒定生長期香椿揮發(fā)性成分Table 4 Identification of volatile compounds in T. sinensis leaves during its growth period by GC-IMS

續(xù)表4

由圖3可以看出，隨著生長期變化，紅油香椿中一部分揮發(fā)性物質(zhì)含量降低，甚至消失，而另一部分揮發(fā)性物質(zhì)從無到有，含量增加，表明揮發(fā)性組分隨生長期發(fā)生顯著變化。A區(qū)域?yàn)?個(gè)生長期的共有揮發(fā)性化合物，主要為醇類和醛類化合物，包括2,3-丁二醇、反式-2-戊烯醇（單體）、2-己醇、5-甲基-2-呋喃甲醇、2-甲基戊醇、3-甲基戊醇、5-甲基糠醛（單體）、苯甲醛（單體）、反式-2-己烯醛（單體和二聚體）等。B區(qū)域中的物質(zhì)有戊醛、2-乙基呋喃、2-乙?；秽?-乙基-6-甲基吡嗪、2,4,5-三甲基噻唑、苯乙醇、丁酸、檸檬烯等，這些物質(zhì)主要存在于4月和5月樣品中，尤其是雜環(huán)類化合物只在4月和5月樣品中檢測到。C區(qū)域物質(zhì)在6、7月和8月樣品中含量較高，尤其是5-甲基糠醛（二聚體）、苯乙醛、2-甲基丁醛（二聚體）和3-甲基丁醇（單體）等幾種物質(zhì)最為明顯。D區(qū)域中揮發(fā)性物質(zhì)主要存在于8、9月和10月樣品中，包括正丁醇、順式-3-己烯醇、苯甲醛（二聚體）、正戊醇（單體）、二乙基二硫、丙酸乙酯（二聚體）、反式-2-戊烯醇（二聚體）、正戊醇（二聚體）等。

圖3 生長期香椿中揮發(fā)性化合物的指紋圖譜Fig. 3 Fingerprints of volatile compounds in T. sinensis leaves during its growth period

2.3.2 生長期紅油香椿揮發(fā)性成分PCA

如圖4所示，前3個(gè)PC的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為84%（PC1、PC2和PC3分別為48%、25%和為11%），表明前3個(gè)PC包含了不同生長期香椿樣品揮發(fā)性成分的絕大部分信息，可以用于不同生長期的紅油香椿揮發(fā)性成分分析。由圖4可以直觀地看出，不同樣品間的差異，同一生長期樣品相對距離較近或重疊，表明香椿樣品檢測重復(fù)性好，不同生長期樣品有明顯的間距，表明不同生長期香椿間的差異性明顯。其中在PC1方向上，7個(gè)生長期樣品明顯分為3個(gè)部分，分別為4、5月樣品，6、7月樣品，以及8、9、10月樣品，6、7月樣品與其他生長期樣品在PC2方向上也表現(xiàn)出明顯的差異性。在PC3方向上，7個(gè)生長期樣品分為3個(gè)部分，分別為4、6月和其他月。由此可見，PCA可以很好地將不同生長期的紅油香椿進(jìn)行區(qū)分，生長期可分為3個(gè)階段，4—5、6—7月和8—10月。

圖4 不同生長期香椿樣品的PCA圖Fig. 4 PCA plots of T. sinensis leaves at different growth periods

3 結(jié)論與討論

本研究對不同生長期紅油香椿的主要活性成分及揮發(fā)性成分進(jìn)行分析測定，結(jié)果表明，主要活性物質(zhì)隨生長期呈現(xiàn)出明顯的累積規(guī)律，其中總黃酮、總多糖和總生物堿含量均在10月達(dá)到最高，總皂苷含量在9月達(dá)到最高。采用GC-MS和GC-IMS技術(shù)對揮發(fā)性成分變化進(jìn)行分析，由于檢測靈敏度、進(jìn)樣口溫度等差異，GC-MS和GC-IMS技術(shù)在不同生長期的紅油香椿中分別鑒定出109種和49種揮發(fā)性成分，其中共同檢測出的揮發(fā)性成分只有5 種，包括蒎烯、反式-2-己烯醛、苯甲醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、乙酸乙酯。2 種技術(shù)鑒別出的揮發(fā)性成分呈現(xiàn)出明顯的差異性，GC-MS技術(shù)檢測出的為分子質(zhì)量在C6～C20之間的揮發(fā)性成分，這類物質(zhì)多為大分子且含量較高的揮發(fā)性成分；而GC-IMS技術(shù)檢測出的為分子質(zhì)量在C4～C10之間的揮發(fā)性成分，這類物質(zhì)多為小分子、在常溫下易揮發(fā)且含量低的揮發(fā)性成分。與傳統(tǒng)的GC-MS方法相比，GC-IMS方法樣品處理及分析溫度較低，更能真實(shí)反映樣品原始的狀態(tài)。目前關(guān)于香椿揮發(fā)性成分的研究，大部分均采用GC-MS進(jìn)行檢測分析，對于分子質(zhì)量小且含量極低的酮類、酸類、呋喃類等化合物很難被檢測到，而本研究中采用GC-IMS能夠很好地彌補(bǔ)GC-MS檢測中存在的缺陷，此2 種技術(shù)相結(jié)合擴(kuò)大了香椿樣品中揮發(fā)性成分的檢測范圍，并且更加全面地反映香椿樣品中揮發(fā)性成分隨著生長期的變化情況，在今后的檢測分析中具有較大的應(yīng)用前景。綜合分析認(rèn)為隨生長期變化，紅油香椿中的主要活性物質(zhì)及揮發(fā)性成分發(fā)生較大變化，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品加工特性及用途選擇采樣時(shí)間進(jìn)行開發(fā)利用。