長鏈非編碼RNA與RA相關性及中醫藥干預的研究進展

劉莉梅 杜小正 方曉麗* 劉強 李福欣 張小娜 劉翠 王海東 田雪梅

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730000

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是以滑膜細胞增生和血管翳形成為主要病理改變的自身免疫性疾病[1]，其發病機制尚不完全清楚。近年來被稱為遺傳噪音的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, LncRNA)被證實在RA等自身免疫系統疾病中存在差異性表達并參與疾病發生和發展，有望成為RA診斷的重要標志物和新的治療靶點[2-3]。中醫藥調控LncRNA治療RA逐步成為醫學領域的新熱點。現將LncRNA在RA發生發展中的作用及中醫藥干預的進展綜述如下。

1 LncRNA概述

LncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成的轉錄本長度超過200個核苷酸、且只有少數可翻譯成多肽的RNA調控分子[4]。目前，有關LncRNA的分類醫學界尚無確切標準，常見的分類方式是依據基因組位置的不同，將其分為反義型、內含子型、重疊轉錄型、長鏈基因間型、反義上游雙向啟動子型和eRNA 6類[5]。研究證實，LncRNA在多種重要的生物學過程中扮演著重要角色，具有信號分子、分子誘導、導向分子及分子支架等生物學功能[6]，在DNA調控、轉錄及轉錄后調控、翻譯調控、翻譯后修飾調控及表觀遺傳等層面發揮重要功能[7]。近年來，隨著分子生物學和基因組學的發展，LncRNA與RA的相關性不斷被揭示，有望成為RA診斷和預后的重要標志物及新的治療靶點。

2 LncRNA與RA發生的相關性

2.1 LncRNA調控免疫細胞的分化及功能

免疫細胞失衡是導致RA發生的重要原因[8]。研究[9]發現，LncRNA參與免疫調節過程，一定程度上調控著免疫細胞的穩態與功能，在固有免疫和適應性免疫中發揮重要作用，主要體現于以下3個方面。

2.1.1LncRNA調控樹突狀細胞(dentriticcell, DC)的分化及功能：DC-T細胞相互作用是自身免疫性疾病發生的基礎，早期RA患者滑膜組織中DC細胞向T細胞發生聚集，以激活幼稚T細胞分泌炎癥因子[10]。研究[11]發現，DC分化過程與DC中特異性高表達的Lnc-DC密切相關，其通過與細胞質中轉錄因子STAT3結合，阻止SHP-1與STAT3的結合和去磷酸化，促進STAT3在Y705位的磷酸化，進而調控DC的分化，促進DC細胞向T細胞的分化；若敲除Lnc-DC則無法有效地啟動CD4+T細胞在病原體刺激后分泌炎癥因子，減輕RA炎癥反應。

2.1.2LncRNA調控T細胞向調節性T細胞(regulatoryT cells, Treg)分化及Treg細胞功能：研究[12]證實，多數RA患者外周血中Th17細胞構成比增高且Treg細胞構成比下降，而Th17/Treg細胞的不平衡是RA發生的標志。LncRNA FLICR特異性表達于Treg細胞中，其可通過順式作用與CNS3-AR5結合增強FOXP3的表達，促進T細胞向Treg的分化及Treg細胞功能的發揮，從而影響RA的發生[13]。

2.1.3LncRNA調控T細胞向Th1細胞分化：RA患者體內Th2型細胞比例下降，Th1型細胞比例增高，Th1/Th2細胞失衡亦是介導RA的重要原因之一。Ranzani等[14]發現，LncRNA linc-MAF-4在Th1細胞中特異性表達，其通過抑制MAF表達促使T細胞向Th1細胞分化，而基因敲除Linc-MAF-4后，CD4+T細胞直接分化為Th2細胞系，從而影響Th1/Th2細胞的免疫平衡，導致RA的發生。

2.2 LncRNA調控DNA甲基化

研究[15]發現，表觀遺傳學參與了RA發病過程，其中DNA甲基化與RA的發生與發展密切相關，其主要集中于成纖維樣滑膜細胞、以T細胞及B細胞為代表的外周血單個核細胞中，通過調節基因的表觀沉默及部分類型的細胞行為在RA發生發展的各個階段發揮作用。已經證實LncRNA HOTTIP與SFRPI甲基化和Wnt信號有關，其通過聚集Dnmt3b和活化Wnt信號通路介導SFRPI甲基化發生而導致RA炎癥發生[16]。同理，LncRNA FER1L4亦通過靶向甲基化位點NLRC5參與RA發生[17]。因此，LncRNA可通過調節甲基化位點調控RA發生。

3 LncRNA與RA發展的相關性

3.1 LncRNA促進氧化應激

氧化應激會導致一系列炎性細胞因子浸潤、蛋白酶分泌增加及大量氧化產物的產生。RA患者線粒體膜因氧化應激過程使線粒體的內容物大量進入胞質，參與自身抗體的產生，成為炎癥反應中的重要環節[18]。目前研究[19]已證實，Linc 00638在RA-FLS患者中表達下調，其與ROS、IL-6表達呈負相關，與SOD、IL-4表達呈正相關，可見RA-FLS中低表達的Linc 00638可促進RA氧化應激及炎癥反應。

3.2 LncRNA促進炎癥反應

病變部位持續炎癥反應是RA主要的發病機制，許多表達失調的LncRNAs參與了RA的炎癥反應[20]。研究[21]發現，RA患者血清中高表達的LncRNA THRIL可通過激活PI3K/AKT信號通路促進RA FLSs細胞中TNF-α、ESR應答，進而促進炎癥反應。巨噬細胞NF-κB通路的激活因子LncRNA-COX2在RA中高表達，其通過SWI/SNF介導的染色質重塑而形成lincRNA-COX2/SWI/SNF，調控巨噬細胞中晚期炎癥基因的轉錄，促進促炎因子分泌，以加速RA發展[22]。

3.3 LncRNA促進RA-FLS增殖-凋亡失衡

成纖維樣滑膜細胞(FLS)是RA發生的關鍵細胞，在免疫細胞或細胞因子刺激下，FLS活化，分泌炎性因子和基質金屬蛋白酶(MMPs)，導致RA炎癥反應及骨和軟骨的破壞[23]。因此，控制FLS局部增生并誘導其凋亡是改善RA預后的關鍵。研究[24]表明，RA-FLSs中高表達的LncRNA LOC100912373可與miR-17-5p競爭性結合，解除其對磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1(PDK1)的抑制，加速AKT的磷酸化，導致FLSs過度增殖。而RA滑膜組織及FLSs中低表達的LncRNA GAS5及MALAT1分別作用于caspase-3/-9及PI3K/AKT信號通路抑制FLSs凋亡[25-26]。RA-FLSs中高表達的LncRNA HOXB-AS3可通過海綿化miR-379-5p表達，促進RA患者滑膜成纖維細胞的增殖、遷移和侵襲[27-28]。可見，LncRNA可促進RA-FLSs增殖-凋亡失衡狀態，加速RA發展。

3.4 LncRNA促進骨破壞的形成

RA骨破壞多與破骨細胞和成骨細胞的相互作用密切相關，而LncRNA在骨的破壞和形成過程中扮演著重要角色[29]。研究[30]表明，LncRNA-NEAT1能夠抑制成骨細胞的形成，促進巨噬細胞系RAW264. 7向破骨細胞分化，促進骨質疏松，引起骨破壞。而LncRNA Jak3通過上調NFATc1的表達，促進Ctsk的表達水平，從而促進MSU誘導的破骨細胞分化，最終導致骨破壞[31]。此外，LncRNA AK077216可通過抑制破骨細胞前體細胞凋亡，促進T細胞核因子1的表達，以促進破骨細胞形成，加速骨吸收[32]。

4 LncRNA與RA治療的相關性

LncRNA不僅參與RA的發生和發展，還與RA的診斷和治療密切相關，通過調控異常表達的LncRNA減輕RA炎癥反應、改善氧化應激、抑制細胞異常增殖及促進細胞凋亡等。Qing等[33]通過上調RA-FLS中低表達的LncRNA OIP5-AS1，發現其可通過競爭性結合miR-448上調其靶基因PON1的表達及促進NF-κB通路失活從而減輕炎癥反應。同樣，上調RA-FLS患者Linc 00638的表達后，可顯著降低ROS、IL-6的表達，提升SOD、IL-4的表達，改善氧化應激及炎癥反應[19]。而經過槲皮素處理后RA-FLS中LncRNA MALAT1的表達上調，抑制PI3K/AKT途徑的活化誘導RA-FLS凋亡[26]。此外，在RA滑膜組織中通過吸附miR-328而低表達的LncRNA MEG3，在上調其表達后，降低了RA滑膜細胞炎性因子濃度，誘導滑膜細胞的凋亡并減少其增殖和侵襲[34]。

5 中醫藥調節RA-LncRNA的作用及其機制

5.1 中藥單體

5.1.1雷公藤內酯(triptolide)：雷公藤內酯是雷公藤的主要活性成分，具有抗炎及免疫抑制作用，對于RA具有顯著的治療作用，可抑制RA-FLS細胞增殖、遷移、侵襲以及炎癥反應。Piao等[35-36]通過構建CIA大鼠模型及分離培養RA-FLS細胞，發現LncRNA RP11-83J16.1通過調節RA-FLS細胞中URI1、FRAT1和β-catenin的表達導致RA-FLS增殖、遷移、侵襲及炎癥，經雷公藤內酯處理后，LncRNA RP11-83J16.1的表達降低，RA-FLS細胞增殖、遷移、侵襲及TNF-α、IL-1β、IL-6、URI1、MMP-3等的表達被抑制。上述結果提示，雷公藤內酯可通過抑制LncRNA RP11-83J16.1的表達，減輕RA-FLS的增殖、侵襲和炎癥反應。

5.1.2(5R)-5-羥基雷公藤內酯醇((5R)-5-hydroxytriptolide, LLDT-8)：LLDT-8是一種新型的雷公藤內酯衍生物。Zhou等[37]發現，LLDT-8可上調RA-FLS細胞中LncRNA WAKMAR2的表達，而WAKMAR2可通過海綿化miR-4478，使miR-4478靶基因E2F1上調，激活下游p53信號通路，進而降低細胞增殖相關基因PCNA和CyclinD1及細胞因子MMP-3、IL-1和IL-6的表達，提示LLDT-8可通過調控WAKMAR2/miR-4478/E2F1/p53軸抑制RA-FLS的增殖和侵襲及細胞因子的產生。

5.1.3紫草素(Shikonin)：紫草素是從紫草中分離出的化學成分，可減輕RA炎癥反應及軟骨破壞等。Yang等[38]發現，紫草素可顯著增強LncRNA-NR024188和SOCS3的表達，抑制IL-6、IL-8和MMPs的表達及RA-FLS細胞的增殖，并顯示出劑量依賴性；而NR024118被干擾后，SOCS3表達降低，IL-6、IL-8和MMPs表達升高。可見紫草素通過上調lncRNA-NR024118抑制RA-FLS細胞的炎癥反應及組織破壞。

5.1.4丹參酮IIA(TanshinoneIIA, TanIIA)：丹參酮IIA是從丹參BUNGE根中提取的一種植物化學物質，具有抗炎、促凋亡和抗腫瘤的作用。Li等[25]發現，RA-FLS細胞中LncRNA GAS5明顯下調，GAS5下調抑制了caspase-3和caspase-9的表達，并激活PI3K/AKT通路，提示低表達的LncRNA GAS5具有抗RA-FLS細胞凋亡的作用。而用TanIIA處理后，發現GAS5、caspase-3、caspase-9、Bax表達上調，Bcl-2表達下調，PI3K/AKT信號通路抑制，促進了RA-FLS細胞凋亡，而敲除GAS5后抑制了TanIIA在RA-FLS中的促凋亡作用，可見丹參酮IIA促進RA-FLS細胞的凋亡作用取決于其可上調LncRNA GAS5的表達。

5.1.5槲皮素(Quercetin)：槲皮素是類黃酮家族的一員，已被證實對RA有顯著療效。Pan等[26]發現，RA-FLS細胞中LncRNA MALAT1及促凋亡因子caspase-3和caspase-9表達下調，PI3K/AKT信號通路被激活，表明RA-FLS凋亡抑制，而用槲皮素處理RA-FLS后，發現MALAT1的表達顯著上調，RA-FLS凋亡被促進，而對槲皮素處理的RA-FLS中MALAT1敲除后，RA-FLS凋亡被抑制。提示槲皮素通過上調LncRNA MALAT1促進RAFLS細胞的凋亡。

5.1.6黃芪甲苷(Astragaloside, AST)：黃芪甲苷是從黃芪中提取的有效成分，主要活性成分為AST-IV，具有抗氧化、抗炎和免疫調節作用，可有效改善RA癥狀。Jiang等[39]發現，AST在RA的發展過程中對差異表達的LncRNA有調控作用，LncRNA(MRAK012530、MRAK132628、MRAK003448和XR_006457)可作為AST的潛在治療靶點。之后該團隊從佐劑性RA模型大鼠中分離出FLSs，發現通過海綿化miR-17-5p而高表達LncRNA LOC100912373可上調PDK1的表達，以增強RA-FLS細胞的增殖；而經AST處理后，發現AST下調LncRNA LOC100912373，miR-17-5p上調，PDK1信號通路抑制，RA-FLS細胞增殖減輕。提示AST通過調節LncRNA LOC100912373和miR-17-5p/PDK1軸抑制了RAFLSs細胞的增殖[40]。

5.2 中藥復方

5.2.1烏頭湯(Wutoudecoction, WTD)：WTD能有效延緩RA的發展，抑制RA模型大鼠疾病的嚴重程度，而被廣泛用于RA治療。Wu等[41]通過構建佐劑性RA大鼠模型，并體外培養及運用IL-1β、WTD聯合IL-1β處理軟骨細胞，發現WTD未處理的IL-1β誘導的軟骨細胞中SHC1的mRNA和蛋白水平均有升高，Ras信號通路被激活，提示IL-1β誘導的RA大鼠關節炎癥反應及軟骨被破壞。而WTD處理后改善了其炎癥及軟骨破壞程度。其機制主要是WTD誘導了Ahr從細胞質轉位到細胞核，與LncRNA LOC101928120的啟動子區域結合，促進了LOC101928120的表達，而LOC101928120將HDAC1招募到SHC1基因啟動子上，從而抑制SHC1的表達以減少IL-1β的分泌，減輕RA炎癥。可見，WDT可通過調節Ahr/LOC101928120/SHC1通路減輕RA炎癥及軟骨損傷程度。

5.2.2化瘀強腎通痹方(HuayuQiangshen Tongbi formula, HQT)：HQT被認為是一種安全、有效的臨床治療RA的中藥復方。Wang等[42]發現，RA患者血清及CIA小鼠模型中LncRNA uc.477表達上調，miR-19b表達下調。LncRNA uc.477直接與pri-miR-19序列結合，導致Drosha或Pasha誘導的pri-miR-19剪切被干擾，以致成熟miR-19b的產生減少，使miR-19b與其靶基因TNFRSF12A結合所抑制的TLR2的表達增加，從而導致炎癥反應。而用HQT處理體外HFLS-RA及CIA小鼠模型后，發現LncRNA uc.477和miR-19b的表達正常化。體內外實驗均表明，HQT可抑制LncRNA uc.477的表達，促進成熟的miR-19b的生成以減輕RA炎癥。

6 小結與展望

LncRNA在RA中的作用是RA機制研究的新領域，其通過調控免疫細胞分化、炎癥反應、氧化應激及骨破壞形成等參與了RA的發生和發展，調節其差異表達可有效改善RA病情。中醫藥具有多向、多靶點的調控作用，可有效減輕RA炎癥反應、抑制RA-FLS的增殖及促進其凋亡等。但到目前為止的研究仍存在以下不足：①LncRNA種類繁多，尚有許多LncRNA與RA的相關性作用機制未被揭示；②LncRNA與RA關系研究文獻報道有限，且LncRNA參與調控RA發生和發展的作用機制也不盡相同，尚需大量基礎研究明確其相關性及作用機制；③中藥干預RA中LncRNA的表達具有廣闊的研究前景但仍處于探索階段，雖然有研究認為中藥通過調控LncRNA對RA有治療作用，但尚未開發出安全、有效的藥物來干預RA進展中的LncRNA表達情況，其次針灸對RA療效明確，但通過調控LncRNA治療RA尚未見相關報道。因此，希望在未來的臨床及實驗研究中，依據中醫藥理論不斷深入探索中醫藥干預LncRNA的差異性表達在RA中的作用機制，以期為中醫藥防治RA提供新的思路與方法。