稻麥輪作體系下抗除草劑稻麥種質資源的挖掘與利用

朱鵬， 許軻， 凌溪鐵， 王金彥， 楊郁文， 張保龍， 裘實*

（1.揚州大學，江蘇省作物遺傳生理重點實驗室，農業農村部長江流域稻作技術創新中心，糧食作物現代產業技術協同創新中心，江蘇 揚州 225009； 2.江蘇省農業科學院種質資源與生物技術研究所，南京 210014）

水稻和小麥是全球最重要的兩種糧食作物，在實現世界糧食安全方面發揮著重要作用。中國是全球稻麥種植和生產的大國之一，隨著我國人民生活的改善，優質商品水稻和小麥的需求量呈現逐年遞增的趨勢，但可用于稻麥種植的勞動力卻在逐年流失，成為我國農業發展的一大隱患。在我國稻麥輪作區，水稻傳統的種植方式有人工插秧、機械化移栽和直播3種，通過移栽來種植水稻繁瑣、耗時且成本很高，與移栽相比，直播的優點包括更快的生長速度、可避免移栽對植株的傷害、易于種植、更少的勞動力投入和水分需求以及品種早熟。城市化發展帶來的農村勞動力流失使直播這一種植方式受到越來越多農業生產者的青睞；此外，由于過去幾十年來直播技術的發展（如機械化播種機、機械除草機、改良除草劑），稻麥直播變得比移栽更受新型農業經營主體的青睞[1]。

當前，田間的草害問題越發嚴重，尤其在直播連作田雜草更是高發、頻發。鴨舌草、稗草、千金子等是水稻田中的主要雜草種類，看麥娘、日本看麥娘、豬殃殃等是小麥田中常見的雜草種類[2]。田間的雜草與水稻植株爭奪生長空間、水分、陽光和營養，增加病蟲害的發生，釋放有毒物質，抑制水稻的生長，對水稻的品質和產量都構成了極大的威脅。試驗證明沒有進行雜草管理的稻田一般減產5%～15%[3]，草害嚴重時減產可達15%～30%[4]。加之近幾年水稻機械直播技術快速發展，秸稈還田工作加速推進，一定程度上加劇了草害對水稻生長的影響。雜草侵害是直播稻主要的生物學限制，對直播稻生產力的限制可達75%～80%[5]，直播稻易受雜草侵害歸因于頑固的雜草植株群、干燥的種植條件、頻繁的耕作、交替的干濕期以及苗齡在30～35 d的水稻幼苗競爭力弱于同期的雜草植株群[6]。田間雜草管理的方法主要分為物理除草和化學除草，在發展中國家，手工或使用機械進行除草更為普遍，而在發達地區和技術先進的地區，化學除草（噴施除草劑）占主導地位[7-8]。我國城市化的快速發展伴隨著鄉村勞動力的大量流失，導致田間勞動生產率下降、勞動成本上升，傳統的人工除草方式已經無法適應我國農業的發展狀況，化學除草是目前最經濟有效的方法。合成除草劑的使用改變了傳統的雜草管理，對全球作物的產量與質量作出了巨大的貢獻，并產生了持續的創新。

然而抗性雜草的種類在逐年遞增，這對田間雜草管理是非常嚴峻的考驗。隨著除草劑相關品種的研發進入瓶頸期，抗除草劑作物種質資源的發展與創制成為炙手可熱的研究對象。將傳統優勢選擇性除草劑通過合理復配，與對應抗除草劑稻麥種質資源配合使用，將高效地治理稻麥輪作區的頑固草害問題，特別對長期存在的惡性雜草和紅稻具有不可替代的作用。抗除草劑作物如此受歡迎，歸因于其可以搭配廣譜的滅活型除草劑使用，使田間雜草管理更加低成本、簡潔、靈活[9]。此外，抗除草劑作物還可以與免耕系統相結合，再次降低了田間作物的損傷風險。近年來，國內外學者針對抗除草劑作物的研究開展了廣泛的工作，取得了一定的成果。本文對幾類主要除草劑以及其相應的抗除草劑稻麥種質資源的研究進展進行綜述，旨在為稻麥種藥一體化栽培在直播稻中的應用提供理論依據。

1 除草劑使用現狀

化學除草劑的使用已成為稻麥輪作區防除雜草最主要的手段，2010年就全球銷售額而言，水稻田除草劑占水稻田農藥的43.2%，為16.47億美元[10]。在我國，水稻田中化學除草劑的用量約占農藥產品總用量的15%，這一比例在發達國家中所占份額更高，而且我國對化學除草劑的需求量仍在逐年遞增[11]。根據功能分類，除草劑可以分為滅生型和選擇型兩大類，滅生型除草劑指對田間所有綠色植物都具有生物活性的除草劑，在一定用量下對田間的作物和雜草都會造成傷害，如草甘膦、草銨膦等；選擇型除草劑指具有較強針對性的除草劑，在一定用量下僅對田間某種或某類雜草造成傷害而不會傷害作物，如麥草畏、吡氟禾草靈等。隨著全球除草劑的廣泛使用，一系列與除草劑相關的問題也接踵而至，如環境污染、抗性雜草等問題對全球生態環境的建設產生了嚴重的影響。抗性雜草是全球農業發展的絆腳石，農戶在田間盲目地使用單一除草劑導致田間雜草產生了耐藥性，目前已有報道多種惡性雜草對不同種類的除草劑具有抗性，如黑麥草屬、莧屬和稗屬雜草等[12]。據我國有關部門報道，已經有37種雜草的59個生物型被檢測出對化學除草劑產生了一定的抗藥性，其所對應的化學除草劑共計10類31種[13]。

傳統創制抗除草劑作物的方法主要有3種，一是在種質資源庫中篩選并加以利用；二是通過誘變技術獲得突變群體，在一定的選擇壓下篩選天然突變體，以獲得抗性植株；三是通過轉基因方法創制對除草劑有抗性的新品種，將可以對除草劑產生抗性的抗性基因導入受體有2種最常用的方法，分別是農桿菌介導轉化法和基因槍介導轉化法[14]。過去的20年對作物進行基因改造的趨勢在不斷增加，作物中引入的主要轉基因性狀為抗除草劑、抗蟲、抗病毒和抗逆境，其中，抗除草劑作物占轉基因作物的近83%[15]。抗除草劑作物，尤其是轉基因抗除草劑作物在國際上被快速的采用，相關的農場管理實踐表明，它們已經成為管理雜草的重要工具。抗除草劑作物在一定程度上改變了雜草的管理方法，對全球農業的發展作出了卓越的貢獻。

2 除草劑主要類型及作用機制

2.1 草甘膦與草銨膦

草甘膦和草銨膦同屬于氨基酸類非選擇性除草劑，這2種除草劑皆為芽后除草劑。

2.1.1 草甘膦 草甘膦[glyphosate,化學名N-(膦酰基甲基)甘氨酸，化學式：C3H8NO5P]是廣譜有機磷除草劑之一,它是一種在農業中廣泛使用的除草劑，可防治多年生和1年生雜草。草甘膦是非選擇性和芽后除草劑的重要成分，用于保護作物免受禾本科植物、1年生闊葉雜草、木本植物等的侵害[16]。1974年，草甘膦除草劑的母體化合物由孟山都公司以商品名“Roundup”進行出售[17]。草甘膦屬于C-P鍵膦酸鹽類的有機磷除草劑，是磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate, PEP）的類似物，可抑制5-烯醇丙酮基莽草酸3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS），這是合成芳香族氨基酸的關鍵酶[18]（圖1）。因為這種機制只在植物、細菌、真菌和頂端復合體寄生蟲中發現，所以草甘膦對各種雜草具有高度活性，但是對哺乳類動物的影響不大[20]。草甘膦是廣譜、高效、低毒、廉價的內吸傳導型除草劑，其被植株的莖葉吸收后傳導到植株的地下部，對深根雜草的地下組織破壞力強，一般農業機械也很難達到其可達到的破壞深度。因為其在土壤中會迅速降解，故被認為是污染最小、安全性最強的商品化除草劑之一。雖然草甘膦除草劑的優點明顯，但其對于水稻的生理毒性致使其很少直接應用于水稻生產中，因此耐草甘膦水稻的發展將大大降低生產成本，促進水稻種植業的發展。

圖1 草甘膦與EPSPS底物結合位點結合、抑制其活性［19］Fig. 1 Glyphosate binding to EPSPS substrate binding sites and inhibiting its activity［19］

2.1.2 草銨膦 由于草甘膦抗性雜草數量和種類的增加，需要不同作用模式的除草劑來保護作物的產量。草銨膦（glufosinate）是一種從綠色產色鏈霉菌中分離出的非選擇性氨同化抑制劑，它可以對谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）產生抑制作用[21]。GS是用于將氨結合到谷氨酰胺中的必需酶，谷氨酸在GS的作用下添加氨而形成谷氨酰胺，因此草銨膦的抑制作用會導致氨的過量積累。光合作用的第二種抑制是氨基酸的消耗，這是GS抑制的下游效應，這種作用可能是草銨膦除草活性的主要原因；由于GS抑制導致的氨基酸消耗，導致光呼吸途徑中乙醇酸途徑（乙醇酸途徑介導乙醇酸的氧化以產生乙醛酸，最終產生氨基酸甘氨酸）的氨基（NH2）供體消耗，從而阻止了乙醛酸向甘氨酸的轉化。研究表明，乙醛酸通過阻止RuBP的激活來抑制光合作用，RuBP是參與光和二氧化碳固定的關鍵酶[22-23]。抑制光合作用會導致膜損傷、葉綠素漂白，最終導致組織壞死。

2.2 乙酰乳酸合成酶抑制類除草劑

乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）是合成纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等支鏈氨基酸的關鍵酶[24]，通過對ALS的酶活性進行抑制能夠對支鏈氨基酸的合成產生阻礙作用，蛋白質的合成也會因此受到影響，從而抑制植物的生長[25]，因此，ALS是重要的除草劑靶點。ALS抑制類的除草劑根據其分子結構可分為5個家族，包括磺酰脲類除草劑（sulfonylureas，SU）、咪唑啉酮類除草劑（imidazolinones，IMI）、嘧啶水楊酸類除草劑（pyrimidyl-benzoates, PB）、磺酰氨羧基三唑啉酮類除草劑（sulfonlyaminocarbonyl-triazolinones，SCT）和三唑并嘧啶磺酰胺類除草劑（triazolopyrimidine，TP）[26]。ALS抑制劑類除草劑是對底物進行阻斷作用，阻斷其進入酶的活性位點，從而影響二者之間的結合，進而對支鏈氨基酸的生物合成產生抑制作用，對生物體內的蛋白代謝活動產生破壞，最終達到滅殺雜草的目的[27]。乙酰乳酸合成酶主要存在于高等植物及真菌和細菌中，目前還未在動物體內發現ALS的存在，因此使用ALS抑制類除草劑可以在保證對植物有高度傷害的前提下降低對動物的毒性，減輕了對動物的傷害[28]。由于ALS抑制類除草劑的高強活性、殺草譜廣、選擇性強、使用方便等特點，使得ALS抑制類除草劑自問世來，銷量就穩居前列，成為僅次于草甘膦的除草劑系列，也是最受歡迎的選擇型除草劑系列，近幾年ALS抑制類除草劑的銷量依舊呈持續增長的態勢。

2.3 原卟啉原氧化酶抑制類除草劑

原卟啉原IX氧化酶（protoporphyrinogen oxidase, PPO）是有效的除草劑靶點之一，PPO催化原卟啉原IX氧化為原卟啉IX，原卟啉IX是四吡咯合成系統的最后一種常見中間體，普遍存在于所有血紅素和葉綠素合成生物中[29]。在用PPO除草劑處理后，易感植物由于PPO的抑制而積累原卟啉原IX。原卟啉原IX被轉運到細胞質，與非特異性質膜結合的過氧化物酶反應自發形成原卟啉IX。原卟啉IX在細胞質中積累，并在有光的情況下產生單線態氧，導致脂質過氧化，即它會導致細胞膜降解和細胞裂解，最終造成植株死亡[30]。現有的幾種PPO類抑制劑除草劑包括二苯醚、噻二唑、惡二唑、三唑啉酮等，均可抑制原卟啉原IX氧化酶。在1980—1990年間，PPO抑制類除草劑被廣泛使用。然而，在20世紀90年代中期引入抗草甘膦作物后，PPO抑制類除草劑的銷量開始下降；這種狀況一直持續到2006年，國內外出現了越來越多對草甘膦具有抗性作用的雜草；雜草對ALS類抑制劑、草甘膦的廣泛抗性使得國內外農業生產者恢復了PPO類抑制劑除草劑的大量使用[31-32]。

2.4 對羥苯基丙酮酸雙氧化酶抑制除草劑

對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（4-hroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD）除草劑是一種相對較新的除草劑，因其廣泛的雜草防治譜、低施用率、作物選擇性和低毒性而在全球范圍內得到廣泛應用[33]。HPPD是生育酚和質體醌（plastoquinone, PQ）生物合成的關鍵酶，HPPD在植物體內催化對羥苯基丙酮酸（4-hroxyphenylpyruvate, HPP）產生尿黑酸，尿黑酸是PQ與生育酚生物合成中的關鍵前體物質，HPPD抑制類除草劑的抑制機制是與HPP基質的競爭性作用，即使酶與抑制劑緊密結合，從而影響尿黑酸的產生；生育酚是一種抗氧化劑保護膜[34]，PQ不僅是光合作用中的電子轉運體，還是類胡蘿卜素生物合成中的輔助因子[35]。當HPPD被抑制時，生育酚和PQ水平下降，導致類胡蘿卜素耗盡，致使葉片漂白和植物死亡，HPPD抑制劑對植物的損傷程度取決于類胡蘿卜素的轉換量，因此較老組織的損傷速度比幼嫩組織慢。生育酚與類胡蘿卜素可以作為活性氧的清除劑在健康的植株中發揮作用，植物組織因此受到保護從而免受傷害[36]。許多HPPD抑制類的除草劑在全球范圍內被引入，不同種類的HPPD抑制劑類除草劑結構差異較大，但是對HPPD的活性都有專一的抑制性，三酮類（硝磺草酮，mesotrione；環磺酮，tembotrione）、異噁唑類（異噁唑草酮，isoxaflutole）和吡唑類（苯吡唑草酮，topramezone）等是目前市場上主要的對HPPD具有抑制作用的除草劑化合物[37]。

2.5 乙酰輔酶A羧化酶抑制除草劑

乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制除草劑于1978年隨著雙氯氟草胺的出現首次引入市場[38]。這類除草劑可選擇性地控制雙子葉作物雜草，也可以在一定限度內對單子葉作物產生活性影響，估計每年處理面積為1.2億hm2[39]，在對抗草甘膦雜草的管控中起到了至關重要的作用。ACCase是一種催化丙二酰輔酶A形成的重要酶，反應產物丙二酰輔酶A參與質體中脂肪酸的生物合成以及長鏈脂肪酸和次級代謝產物的延伸，這些代謝產物對能量儲存、細胞或細胞器的生物膜結構組成和激素調節至關重要[40]。針對ACCase的除草劑可以抑制禾草植物的葉綠體ACCase活性，導致脂肪酸產量下降，這類除草劑通常在出苗后用于控制稻麥田中的雜草[41]。ACCase由生物素-羧基載體蛋白（biotin carboxyl-carrier, BCC）、生物素羧化 酶（biotin carboxylase, BC）和 羧 基 轉 移 酶（carboxyltrans-ferase, CT，具有亞基α和β）3個功能域組成，BC和CT結構域承擔依賴于ATP、Mg2+和HCO3-的催化活性，這導致乙酰輔酶A羧化和丙二酰輔酶A的形成。下面是由BC和CT亞基催化的2個反應[42-43]。

已在植物中鑒定出2種不同類型的ACCase，即胞液型和質體型。質體型對ACC類抑制劑敏感，在草類中酶活性高達80%[44]。抑制ACC活性的除草劑是近年來除草劑品種發展過程中較為重要的除草劑，其種類主要包括芳氧苯氧丙酸類（aryloxyphenoxypropionate，AOPP）與環己烯酮類（cyclohexanedione， CHD）化合物，主要產品有禾草 靈 (diclofop)、精 惡 唑 禾 草 靈 (fenoxaprop-P-ethyl)、喹 禾 靈 (quizafop-ethyl)、噻 唑 禾 草 靈(fenthiaprop)、稀 禾 定 (sethoxydim)、烯 草 酮(clethodim)等，它們通過抑制質體型乙酰輔酶A羧化酶的活性使得脂類生物的合成受到阻礙，最終造成植物死亡。

2.6 激素類除草劑

在大量、多種除草劑的使用中，激素類除草劑的作用不容忽視。激素類除草劑的結構與生長素吲哚乙酸（indolyl-3-acetic acid，IAA）相似，對植株體內的激素平衡具有一定的影響，根據生長素的雙重性，二者皆在低水平使用時對植株具有生長促進作用，高水平時殺死植株[45]。第二次世界大戰后，生長素除草劑2,4-D和MCPA進入全球市場，開啟了現代農業雜草控制的新時代，目前，這類除草劑常見的種類包括苯氧羧酸、苯甲酸、吡啶羧酸、芳香羧甲基衍生物和喹啉羧酸[46]。激素類除草劑問世后，對田間一年生與多年生闊葉類雜草的防治作出了很大貢獻。

3 轉基因抗除草劑稻麥種質資源創制

轉基因抗除草劑作物是利用基因工程技術從某種生物體中提取所需的抗除草劑基因，將其轉入目標農作物中，使其與目標農作物的基因進行重組，從而培育出對特定除草劑產生優良抗性的新種質。從1995—2014年，轉基因作物的種植使化學農藥的施用量降低了37%，作物產量提高了22%，使農民的利潤提高了68%[47]。轉基因抗除草劑作物在1996年首次實現了商業化，自此以后，抗除草劑性狀便一直是轉基因作物研究的主要性狀，2019年轉基因抗除草劑作物的全球種植面積約8 000萬hm2，占全球轉基因作物種植面積的88%左右[48]。中國在轉基因技術研發方面投入了大量資源，取得了一定進展，我國已獲得具有營養改善、抗旱、抗藥、耐鹽堿、營養高效利用等重要性狀的基因300多個，并且已篩選出46個具有自主知識產權和重要育種價值的功能基因[47]。在抗除草劑基因方面，我國共有48項專利，發掘的抗除草劑基因可以使作物分別對草甘膦、草銨膦、咪唑啉酮類和磺酰脲類除草劑產生不同程度的抗性，其中抗草甘膦的基因就達到40項[49]。由于轉基因技術快速發展，其優勢越來越明顯，主要體現在提高除草效果、降低除草成本；利于采用保護性耕作；有助于采用窄行間距種植。

3.1 抗草甘膦與草銨膦稻麥種質資源

草甘膦在植物體內會與EPSPS和三磷酸莾草酸（S3P）結合形成復合體，這將導致EPSPS的活性受到抑制，生物體正常的氨基酸代謝也因此受到阻礙，從而使植物死亡[50]。EPSPS是廣泛存在于植物、微生物中參與莽草酸代謝途徑的重要酶，是草甘膦的作用靶點，天然狀態下對草甘膦比較敏感，轉基因作物對草甘膦的解除機制是通過過量表達EPSP酶，EPSP酶與草甘膦競爭性結合，從而達到增強植株抗性的目的。農桿菌（Agrobacteriumsp.）中有一種CP4酶，是細菌中的EPSPS，其對草甘膦不敏感。CP4對PEP具有很高的親和力，轉基因作物通過異源表達CP4基因，使得莽草酸途徑可以在不經過作物自身的EPSPS體系的情況下正常進行。Chhapekar等[51]在這一理論基礎下，通過將密碼子優化的CP4 EPSPS轉入到水稻品種IR64中，得到了可以對10倍商業推薦使用劑量的草甘膦具有耐受作用的轉化植株。soil EPSPS是王云鵬等[52]在2014年成功克隆的1個新的抗草甘膦的EPSPS基因，利用農桿菌浸染的方法，使soil EPSPS在水稻中異源表達，獲得了1種全新的轉基因抗草甘膦植株，經過測試，這種抗性植株能夠對高達500 mmol·L-1的草甘膦產生耐受作用。2015年，浙江大學研究人員利用農桿菌介導法將密碼子優化的殺蟲基因HJC-1和細菌克隆而來的抗草甘膦EPSPS基因G6導入栽培水稻品種‘秀水110’中，成功培育出具有抗蟲、耐草甘膦雙重功效的轉基因水稻“G6H1”[53]。2018年，董玉鳳等[54]成功將表達G2-EPSPS蛋白的G2-aroA基因轉入水稻，獲得抗草甘膦轉基因水稻G2-6、G2-7，與非轉基因品種‘中花11’相比，其草甘膦抗性分別提高了104和123倍，并且該品種很大程度上降低了轉基因漂流的概率。

抗草銨膦作物的抗性源自2種使草銨膦失活的乙酰轉移酶同源酶基因中的1種，分別是綠色產色鏈霉菌（Streptomyces viridochromogenes）的膦絲菌素乙酰轉移酶基因（phosphinothricin acetyltransferase gene，PAT）、吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的雙丙氨磷抗性基因（bialaphos resistance gene,BAR)[55],它通過催化草銨膦氨基的乙酰化可以使草銨膦失活，應用轉基因技術表達該類基因，是獲得耐除草劑轉基因農作物的一種方法。目前，已成功將Bar基因導入到一系列作物中，如油菜、玉米、甜菜、大豆、亞麻、豌豆、水稻、小麥、煙草、番茄、黑麥、馬鈴薯、大麥及胡蘿卜等[56]。研究人員通過將Bar基因轉入‘秀水 04’‘D68’‘明恢 63’‘E32’‘R187’‘R893’等兩系或者三系恢復系水稻品種以及‘旱稻297’和‘旱稻502’中[57]，培育出多個具有應用價值的抗草銨膦轉基因水稻新材料。Wang等[58]通過農桿菌介導法將Bar基因轉入到北方粳型恢復系‘津稻162’和‘津稻18’中，并利用0.25%的草銨膦除草劑Basta對T0代轉基因植株分別進行涂布試驗，檢測出轉基因的‘津稻162’的抗性植株率為92%，‘津稻18’的抗性植株率為78%。Zhu等[44]利用基因槍法將Bar基因導入到水稻品種‘京引119’中，并開展了利用Bar基因提高和快速鑒定雜交稻純度的嘗試[59]，同時還成功將抗草甘膦基因cp4轉入水稻，配制出抗草甘膦和草銨膦的轉基因直播稻品系（組合）嘉禾98及雜交稻組合遼優1046等，為直播稻的化學除草技術做出了杰出貢獻[50]。秦冠男等[60]發現來自細菌Nocardiasp. AB2253 的蛋氨酸砜 N-乙酰基轉移酶基 因（methionine sulfone nacetyltransferase gene,Mat）編碼產物具有N-乙酰基轉移酶活性，能解除草銨膦的毒性，但這種基因在植物中表達效率較低，于是用水稻偏愛密碼子優化的Mat#基因轉化秈稻品系9K，除草劑抗性檢測結果顯示，該轉化體的芽期草銨膦耐受劑量至少為 600 mg·L-1、秧苗期草銨膦耐受劑量至少為 1 000 mg·L-1，對草銨膦的抗性水平不低于轉Bar的水稻‘9KA2’。

3.2 抗ALS類除草劑稻麥種質資源

Li等[61]從擬南芥抗磺酰脲類除草劑突變系GH50中分離出1種突變的乙酰乳酸合成酶基因csrl-1，這種突變體的乙酰乳酸合成酶基因與磺酰脲類除草劑親和力很低，已將其導入水稻中，此基因在在轉基因水稻細胞中受啟動基因CaMV35S控制，使轉基因水稻對氯磺隆的抗性提高了200倍。Kawai等[62]研究證明水稻來源的ALS中W548L/S627I位點突變的基因可以作為篩選標記基因，得到抗除草劑雙草醚（bispyribac-sodium，BS）的轉基因水稻。

3.3 抗PPO類除草劑稻麥種質資源

研究發現利用轉基因的方法在水稻中過量表達 人 類（Homo sapiens）、枯 草 桿 菌（Bacillus subtilis）、粘球菌（Myxococcus xanhus）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的protox基因，能夠獲得水稻新品系，這些新品系對PPO類抑制型除草劑能產生一定的耐藥性[40]。Lee等[63]發現，來自枯草桿菌的原卟啉原氧化酶對二苯醚除草劑具有耐性，于是將其導入水稻中，它在水稻植株細胞質或質體中的表達導致了轉基因水稻對乙氧氟草醚（oxyfluorfen）的高度抗性。Jung等[64]研究發現導入了在葉綠體與線粒體表達粘球菌的原卟啉原氧化酶的轉基因水稻品種M44對乙氧氟草醚的抗性提高200倍以上。

3.4 抗HPPD類除草劑稻麥種質資源

據報道，目前已經有多個能夠對HPPD抑制類除草劑產生抗性的HPPD基因被克隆表達，例如從Coptis japonica克隆了CjHPPD基因，在植株中過量表達CjHPPD基因可以使植株對吡唑特和雙環磺草酮產生耐受性[65]；從土壤宏基因組克隆表達了能夠使植株抗磺草酮的mHPPD基因[66]；黃彥等[67]克隆了菌株Pseudomonassp. AM-H4的HPPD基因，檢測發現將此基因在植株體內過量表達可以使植株對HPPD抑制類除草劑產生抗性。目前，對于抗HPPD抑制類除草劑作物的研究仍在繼續，但還沒有相關轉基因稻麥種質資源商業化應用的報道。

3.5 抗ACC類除草劑稻麥種質資源

山西農業大學的高愛保等[68]通過對小麥的近緣品種谷子對ACC類抑制劑除草劑的抗性研究發現，小麥ACC酶1779I-1779Leu會導致其對APP類和CHD類除草劑產生抗性，加速了對抗ACC類除草劑稻麥種質資源商品化研究的進展。

3.6 抗激素類除草劑稻麥種質資源

麥草畏是目前市場上激素類除草劑中較受歡迎的一種，屬苯甲酸類，前人從土壤細菌Pseudonanas maltophilia(菌系DI-6)中分離出能降解麥草畏的酶DMO，DMO在雙子葉植物中的表達可以使植株抵抗致死量麥草畏所帶來的影響，目前利用轉基因技術將該基因在大豆、煙草、番茄中進行了過量表達，突變株皆對麥草畏產生了一定的耐受性，但是有關其在稻麥種質資源中的作用還在研究中[69]。

4 非轉基因抗除草劑稻麥種質資源創制

隨著轉基因技術的發展，非轉基因這一定義也開始被提出，非轉基因技術指含有少于0.9%的轉基因原理的育種技術，其在抗除草劑稻麥種質資源的創制過程中起到了先導作用。隨著生物技術與基因工程的發展，非轉基因技術也不只是單純的傳統育種，傳統育種與生物技術的結合使得抗除草劑作物種質資源的開發迅速發展[70]。目前選育抗除草劑作物的非轉基因方法多種多樣，主要有傳統雜交育種、種子誘變、花粉選擇、細胞（原生質體）融合和細胞組織培養，利用這些方法選育出了眾多抗除草劑作物并得到推廣應用，其中也不乏優質的稻麥種質資源。現如今，基因編輯技術CRISP/Cas9也是一大熱門非轉基因育種技術，其不僅易操作、效率高，還可以定向改造抗除草劑基因，為農作物的種質資源創制提供了一條全新的道路。

4.1 抗草甘膦稻麥種質資源

草甘膦作為國內銷量最高的除草劑，對其具有抗性的種質資源是一大研究熱門。魏松紅等[71]應用紫外線和疊氯化鈉對小麥種子進行誘變，成功獲得抗草甘膦的小麥植株。童漢華等[50]對‘中花11’‘京引119’等粳稻品種種子進行γ射線輻射誘變處理，通過對誘變體在秧苗期分別施以不同水平草甘膦，逐步聚合對草甘膦的抗性，從‘中花11’的輻射后代中成功選育出1份耐草甘膦突變體材料，該突變體材料能耐20 mL·L-1的草甘膦。Li等[72]使用CRISPR/Cas9介導的非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）通路對水稻EPSPS基因的Thr102Ile和Pro106Ser堿基進行定點置換，并用含有Thr102Ile和Pro106Ser的相同DNA片段對水稻EPSPS基因片段進行定點置換突變，成功獲得了抗草甘膦的水稻材料，并且替換位點和插入突變位點穩定地遺傳給下一代。

4.2 抗ALS類除草劑稻麥種質資源

到目前為止，使用非轉基因方法培育出的抗除草劑種質資源最成功的即為抗ALS類除草劑作物種質資源。2007年Endo等[73]發現，利用基因靶向編輯技術將ALS基因序列中的第548位氨基酸處的色氨酸（TGG）轉變為亮氨酸（TTG），以及將第627位氨基酸處的絲氨酸（AGT）轉變為異亮氨酸（ATT），可以有效提高植株對雙草醚的抗性。2012年，深圳市興旺生物種業有限公司使用EMS誘變技術對‘黃華占’和‘黃絲占’2個品種進行誘變，利用0.345%的咪唑啉酮類除草劑滅草煙對其3～4葉期的幼苗進行噴施，隨后進行篩選，最終存活的植株即為具有抗性的植株，對具有抗性的‘黃華占’和‘黃絲占’品種進行測序的結果表明，‘黃絲占’的突變植株是由于ALS基因發生了Ala96Val或Trp548Cys或Ser627Asn突變，‘黃華占’的突變株是由于ALS基因發生了Ala96Thr或Trp548Met突變，導致原本對咪唑啉酮類除草劑不具抗性的植株產生了抗性[74]。夏蘭琴等[75]在2015年對‘日本晴’品種使用CRISPR/Cas9技術定點修飾了ALS第548、627位的氨基酸（TGG-TTG、AGT-ATT），實現了利用基因工程方法對水稻ALS基因的定點突變，成功獲得了抗嘧啶羧酸類除草劑雙草醚的水稻植株。張保龍等[76]在2021年利用EMS技術對‘秈稻93-11’品種種子進行了誘變，隨后使用咪唑啉酮類除草劑甲基咪草煙（又名百壟通）對3～4葉期的M2植株進行噴施，最終篩選出對百壟通具有抗性的水稻突變植株；對抗性突變株進行測序發現，突變抗體的ALS基因序列中第627位絲氨酸不僅突變為天冬氨酸，還會突變為亮氨酸，2種突變都會使‘秈稻93-11’產生對除草據百壟通的抗性。2018年，江蘇省農業科學院糧食作物研究所歷經多年，在7 403份水稻品種資源材料里篩選出具有抗咪草煙特性的‘金梗 818’[77]。

4.3 抗ACC類除草劑稻麥種質資源

隨著對ACC抑制類除草劑研究的不斷深入，已經培育出多種抗ACC抑制類除草劑作物種質資源，通過非轉基因技術組織培養篩選獲得具稀禾定（sethoxydim）抗性的墨西哥甜玉米B50S品系，還有通過傳統育種培育出抗ACC類除草劑的高粱，二者皆已實現商業化[78]。Liu等[79]基于ACCase CT結構域序列設計sgRNA，構建了3個突變文庫eABE、eBE3和eCDA，在eABE和eBE3文庫中發現了對高效蓋草能具有抗性的Ile1879Val、Trp2125Ser和Cys2186Arg突變體。Li等[80]結合胞嘧啶編輯器A3A-PBE和腺嘌呤堿基編輯器PABE-7構建了1個STEMEs系統（飽和靶向內源性誘變編輯器），使用STEMEs編輯水稻ACCase基因，獲得了具有Ser1866Phe、Ala1884Pro、Pro1927 Phe和Trp2125Cys替換的突變體，其中，Pro1927 Phe和Trp2125Cys突變體對除草劑蓋草能的抗性足夠高，可用于田間雜草防治。維多利亞農業服務有限公司使用疊氮化鈉和甲基亞硝基脲對水稻種子進行誘變，獲得了對精喹禾靈具有抗性的突變體，該突變體在ACCase的羧基轉移酶編碼區有1個G到A的突變，導致Gly2096Ser突變和對ACC類抑制劑除草劑的抗性[81]。第1個獲批的水稻PVL01來自BASF 1-5，BASF 1-5是抗ACC類抑制劑除草劑的水稻品系，在ACCase蛋白中發生了Ile1781Leu突變[82]。這對田間除草系統是一項非常好的補充，種植者可以交替使用ALS類抑制劑除草劑和ACC類抑制劑除草劑來控制田間雜草。

5 結語

水稻和小麥是我國最重要的糧食作物，稻麥輪作是我國南方傳統耕作方式，探索在推動直播連作背景下加快稻麥抗除草劑種質資源的挖掘與利用，構建稻麥抗除草劑材料種藥一體化生產模式具有重大的現實意義。無論是利用轉基因技術還是非轉基因技術培育出的抗性作物，都是抗除草劑作物種質資源研究和應用領域的重大突破，在擴大除草劑的使用范圍、延長使用時間、降低除草成本、減少耕作、降低能耗等方面發揮了重要作用。隨著抗除草劑作物的廣泛種植，在很大程度上改變了雜草防治的方式，但是隨著除草劑的反復使用，雜草對除草劑的抗性也在逐漸增強，這就需要盡快開發新作用機制除草劑及其抗性作物技術，為加快建設綠色有機稻麥產業提供堅實的技術支撐。