血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 的表達(dá)水平與急性髓系白血病臨床特征和預(yù)后的關(guān)系

何 旭 胡銀山 徐孫秋 楊 昆 馬春蓉

川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 四川省南充市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，四川南充 637000

急性白血病是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）是成人急性白血病常見(jiàn)類型之一，占比達(dá)20%～30%，盡管近年來(lái)AML 診治取得一定進(jìn)展，但長(zhǎng)期生存率僅為20%～40%[1]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究證實(shí)，生物體內(nèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）等參與AML 發(fā)生發(fā)展[2-3]。lncRNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）是新近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，研究報(bào)道，lncRNA-MALAT-1在頜下腺腫瘤、皮膚癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展有關(guān)[4-5]。miR-143 是一種高度保守的miRNA，miR-143在甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，也與腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展有關(guān)[6-7]。本研究就通過(guò)檢測(cè)AML患者血清中l(wèi)ncRNA-MALAT-1、miR-143 的表達(dá)，分析二者與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月至2019 年4 月四川省南充市中心醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）收治的87 例AML 患者為AML 組，其中男47 例，女40 例；年齡18～84 歲，平均（57.14±8.33）歲；血紅蛋白：51 例≥80 g/L，36 例＜80 g/L；白細(xì)胞計(jì)數(shù)：42 例≥30×109/L，45 例＜30×109/L；血小板計(jì)數(shù)：35 例≥50×109/L，52 例＜50×109/L；骨髓原始細(xì)胞比率：51 例≥70%，36 例＜70%；髓外病變14 例；FAB 分型：M1型8 例，M2型39 例，M4型8 例，M5型27 例，M6型5 例；預(yù)后危險(xiǎn)分層[8]：高危10 例、中危45 例，低危32 例。另選取32 名同期于我院體檢的健康者為對(duì)照組，其中男17 名，女15 名；年齡18～81 歲，平均（56.57±7.19）歲。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20170214）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為AML，符合《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒細(xì)胞白血病）中國(guó)診療指南（2011 年版）》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初次確診；③臨床資料齊全；④患者及家屬知情并簽署同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并骨髓增生異常綜合征；②合并其他部位惡性腫瘤；③年齡＜18 歲；④全身性感染性疾病；⑤不能接受隨訪；⑥合并自身免疫性疾病；⑦急性早幼粒細(xì)胞白血病；⑧入院前接受過(guò)抗腫瘤治療。

1.2 研究方法

收集AML 組入院時(shí)和對(duì)照組體檢時(shí)靜脈血3 ml，1 500 g 離心15 min 后分離血清，Trizol 法提取血清總RNA，TB Green Premix Ex TaqTM試劑盒（武漢科昊佳生物科技有限公司，編號(hào)：RR420A-1）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix 試劑盒（北京百邁客生物科技有限公司，編號(hào)：RK02001）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)合成由廣州銳博生物技術(shù)有限公司完成：lncRNA-MALAT-1，正向引物5’-GCCTGGAAGCTGAAAAACGG-3’，反向引物5’-TGGAAAACGCCTCAATCCCA-3’；內(nèi)參GADPH 正向引物5’-CTGACTTCAACAGCGACACC-3’，反向引物5’-GTGGTCCAGGGGTCTTACTC-3’。miR-143 正向引物5’-AGTGCGTGTCGTGGTGT-3’，反向引物5’-GCCTGAGATGAAGCACGTG-3’；內(nèi)參U6 正向引物5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，反向引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。PCR 反應(yīng)體系共10 μl：cDNA 1 μl，正反向引物各0.5 μl，SYBR Green Master Mix 3 μl，ddH2O 5 μl；反應(yīng)條件：95℃90 s，95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s，循環(huán)40 次后進(jìn)行熔融曲線分析，2-ΔΔCt法計(jì)算血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪

AML 患者入院后參考《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒細(xì)胞白血病）中國(guó)診療指南（2011 年版）》[9]接受化療。患者出院后通過(guò)門診或電話隨訪3 年。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 28.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)或F 檢驗(yàn)，事后多重比較SNK-q 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；Pearson 相關(guān)系數(shù)分析AML組血清lncRNA-MALAT-1與miR-143表達(dá)的相關(guān)性；Kaplan-Meier 法繪制AML 患者生存曲線，組間生存率Log-rank χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML 組與對(duì)照組血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達(dá)比較

AML 組血清lncRNA-MALAT-1 為（2.12±0.56），高于對(duì)照組的（1.10±0.24），miR-143 為（1.01±0.22），低于對(duì)照組的（1.59±0.36），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.715、8.610，P＜0.001）。

2.2 AML 組血清lncRNA-MALAT-1 與miR-143 表達(dá)的相關(guān)性

AML 組血清lncRNA-MAL AT-1 與miR-143 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.709，P＜0.001）。

2.3 AML 患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

不同白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比率、預(yù)后危險(xiǎn)分層AML 患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)、髓外病變、FAB 分型AML患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 AML 患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達(dá)與臨床特征的關(guān)系（）

表1 AML 患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達(dá)與臨床特征的關(guān)系（）

注 與低危比較，aP＜0.05；與中危比較，bP＜0.05。AMI：急性髓系白血病；lncRNA-MALAT-1：長(zhǎng)鏈非編碼RNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1；miRNA：微RNA

2.4 血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達(dá)與AML患者預(yù)后的關(guān)系

87 例AML 患者隨訪4～36 個(gè)月，中位隨訪26 個(gè)月，失訪6 例，死亡39 例，3 年總生存率為55.17%（48/87）。根據(jù)血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達(dá)均值分為lncRNA-MALAT-1 高表達(dá)組（≥2.12，45 例）、miR-143高表達(dá)組（≥1.01，43 例）和lncRNA-MALAT-1 低表達(dá)組（＜2.12，42 例）、miR-143 低表達(dá)組（＜1.01，44 例）。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，lncRNA-MALAT-1 高表達(dá)組3 年總生存率為40.00%（18/45），低于lncRNA-MALAT-1 低表達(dá)組的71.43%（30/42）；miR-143 高表達(dá)組3 年總生存率為67.44%（29/43），高于miR-143 低表達(dá)組的43.18%（19/44），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank χ2＝10.295、7.338，P＝0.001、0.007）。見(jiàn)圖1。

圖1 不同血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表達(dá)AML 患者Kaplan-Meier 生存曲線

3 討論

AML 是起源于造血干細(xì)胞的惡性腫瘤，由造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中特定細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳、點(diǎn)突變、遺傳突變等變化轉(zhuǎn)變形成[10-11]。目前國(guó)際上對(duì)AML 已有較統(tǒng)一的系統(tǒng)治療方案，完全緩解率可達(dá)70%～90%，但仍有20%的患者難以達(dá)到完全緩解，且大多AML 患者完全緩解后可再次復(fù)發(fā)，發(fā)展為復(fù)發(fā)性難治性AML[12-13]。因此還需進(jìn)一步深入探索AML 相關(guān)調(diào)控機(jī)制。

LncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本＞200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，能直接參與基因調(diào)控，也能通過(guò)海綿miRNA 間接調(diào)節(jié)miRNA 相關(guān)靶基因表達(dá)[14]。lncRNA-MALAT-1定位于人染色體11q13.1，最初于非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)，因此多數(shù)學(xué)者致力于研究其在不同腫瘤中的作用[15]。Ferri 等[16]研究報(bào)道，lncRNA-MALAT-1 能海綿miR-423-5p 促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。阿小英等[17]研究報(bào)道，lncRNA-MALAT-1 能海綿miR-124-3p上調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，AML 組血清lncRNAMALAT-1 高表達(dá)，且不同白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比率、預(yù)后危險(xiǎn)分層的AML 患者血清miR-143 表達(dá)存在差異，提示lncRNA-MALAT-1 高表達(dá)參與了AML 進(jìn)展。lncRNA-MALAT-1 在AML 中高表達(dá)可能與轉(zhuǎn)錄過(guò)程中Sp1 通過(guò)結(jié)合啟動(dòng)子激活和促進(jìn)lncRNA-MALAT-1轉(zhuǎn)錄有關(guān)[18]。隨著lncRNA-MALAT-1表達(dá)上調(diào)，能通過(guò)上調(diào)C-X-C 基序趨化因子受體4表達(dá)促進(jìn)AML 細(xì)胞增殖、遷移和抑制凋亡[19]。同時(shí)lncRNA-MALAT-1 表達(dá)上調(diào)也能通過(guò)與上皮轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 相互作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[15]。

miR-143 定位于人染色體5q32，在心臟、骨骼、血管等多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)，最初研究局限于其在心腦血管和炎癥中的作用，近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-143還參與腫瘤相關(guān)過(guò)程[20-21]。Xu 等[22]研究報(bào)道，miR-143能靶向缺氧誘導(dǎo)因子-1α 相關(guān)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1通路，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移。Han 等[23]研究報(bào)道，miR-143 能靶向DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3α 降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，AML 組血清miR-143 低表達(dá)，且不同白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比率、預(yù)后危險(xiǎn)分層的AML 患者血清miR-143 表達(dá)存在差異，提示miR-143 低表達(dá)參與了AML 進(jìn)展。miR-143 在AML 中低表達(dá)可能與miR-143 啟動(dòng)子甲基化有關(guān)[24]。同時(shí)miR-143 低表達(dá)能通過(guò)上調(diào)己糖激酶2 促進(jìn)AML 細(xì)胞糖酵解，通過(guò)增強(qiáng)AML 細(xì)胞能量代謝促進(jìn)其遷移和侵襲[25]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AML 患者血清lncRNA-MALAT-1 與miR-143 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明二者可能共同參與AML 進(jìn)展。黃勁龍等[26]通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)lncRNA-MALAT-1 能抑制miR-143 表達(dá)，與AML 細(xì)胞增殖和凋亡抑制相關(guān)。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，與lncRNA-MALAT-1 高表達(dá)和miR-143 低表達(dá)相比，lncRNA-MALAT-1 低表達(dá)與miR-143 高表達(dá)的AML 患者3 年總生存率升高，提 示lncRNA-MALAT-1、miR-143 與AML 患者預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，AML 患者血清lncRNA-MALAT-1 高表達(dá)和miR-143 低表達(dá)，與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比率、預(yù)后危險(xiǎn)分層和預(yù)后有關(guān)。但本研究結(jié)果還需更多樣本量和更長(zhǎng)的隨訪時(shí)間進(jìn)一步證實(shí)，并進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA-MALAT-1、miR-143 參與AML 進(jìn)展的機(jī)制。