Keap1-Nrf2 信號通路在機體氧化應激損傷防護中的研究進展

梁新妹 王云平 李 丹 王文婧 穆欣顏 韓清臣 李 博 張立雙

天津市濱海新區中醫醫院檢驗科，天津 300451

Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）-核轉錄因子E2 相關因子2（nuclear transcription factor E2-related factor 2，Nrf2）介導氧化還原反應體系，是機體內源性抗氧化信號通路重要的組成部分[1]。Keap1-Nrf2 信號通路的激活可調控機體內一些抗氧化酶和蛋白質的表達和轉錄，并參與炎癥、癌癥、腦缺血性疾病、糖尿病等發病過程。因此，該通路在多種氧化應激導致的疾病中扮演著重要角色[2]。本文從該通路的基本結構與氧化應激[Nrf2、Keap1、抗氧化反應元件（antioxidant responsive element，ARE）的結構及氧化應激反應的關系）]、調控機制（Nrf2 與Keap1 的解偶聯、Nrf2 磷酸化作用、Nrf2 的降解減弱機制、門閂和樞紐學說等機制）及與各種疾病的關系等方面展開綜述。

1 Kelch-Nrf2 通路與氧化應激反應

氧化應激是一種外界刺激導致的機體內氧化/抗氧化動態平衡失衡，進而導致機體的應激反應。正常狀態下，參與活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生的系統和清除系統處于動態平衡。外界環境的刺激或機體自身的穩態變化等原因，使機體內的ROS產生增多或機體對ROS 的清除能力下降，會出現氧化應激[3]。長期處于氧化應激這種異常狀態，會使機體處于易損狀態，致病因素對集體的毒性作用會明顯增強，可導致基因突變[3]。

ROS 是一類氧的單電子還原產物，包括超氧自由基和羥基自由基，以及非自由基分子如過氧化氫等。其中一部分物質如超氧化物或羥基自由基，極不穩定；而另一部分物質，如過氧化氫，則可自由擴散，壽命相對較長。目前認為ROS 主要由線粒體內的ETC 膜電子傳遞鏈和氧分子之間的非特異性反應所生成[4]。

在生物體，有大量含氧分子的氧化電位，ROS是其中的一種，其余還有包括單O2、超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基和活性氮、過氧亞硝基陰離子、二氧化氮和三氧化二氮。其都是強有力的氧化劑，可以由細胞（吞噬細胞或上皮細胞等）的正常代謝產生；也可以由外源因素誘導產生。在細胞中，ROS 積累和活性氮增加蛋白質的氧化修飾，對蛋白質的羰基含量和改性的殘基或硝基發生氧化均有影響，生成氫過氧化物脂質、脂質衍生物及嘌呤和嘧啶，誘導DNA 聚合與斷裂，通過對大分子物質的氧化攻擊，導致蛋白質、膜、核酸的功能障礙[5]。ROS 過度積累，并且濃度持續較高，極易與核酸、蛋白質、脂質等生物大分子物質產生氧化反應，細胞的結構和功能發生損害，引發疾病[6]。

2 Keap1-Nrf2-ARE 的結構

2.1 Keap1 的基本結構

Keap1 是一種69 kD 的蛋白，負調控Nrf2。Keap1包含627 個氨基酸殘基，共分為5 個區域。①NTR 區，N 端域。②BTB 區，負責同源二聚化Cul3 與Nrf2 泛素化過程，與介導Keap1-Nrf2 結合有關，其核心位點Ser-104 突變會影響Keap1 二聚化，干擾Nrf2 的結合[6]。③IVR 區，連接BTB 與DGR 的區域。該區富含半胱氨酸，Keap1 與ROS 及親電試劑的反應都發生在IVR區，兩個反應性半胱氨酸殘基Cys273 和Cys288 對調節E3 連接酶活性至關重要，因此與Nrf2 穩定性有關，是Nrf2 降解的關鍵。④C 末端DGR 區，Kelch 領域區擁有多個蛋白接觸位點，介導Keap1 與Nrf2 和細胞骨架等蛋白的關聯[6]。⑤CTR、DGR 和CTR 一起被稱為Keap1-DC，對Nrf2 的Neh2 結構域的結合至關重要[7]。

2.2 Nrf2 的基本結構

Nrf2 屬于轉錄因子家族中的一個小家族，存在于機體的各個組織器官中[7]。Nrf2 可誘導一組抗氧化和解毒酶基因，在保護機體免受各種環境刺激等方面起著關鍵作用。

Nrf2 分為7 個Nrf2-ECH 同源結構域（Nrf2-ECH homology domains，Neh），這些區域在不同物種間高度保守。Neh1 區包含介導DNA 結合和二聚體形成的CNC 和bZIP 構域，有利于Nrf2 與DNA 的結合，調控目標基因和下游酶的表達。Neh2 區包含兩個綁定基序DLG 和ETGE，能夠與Keap1 的DGR 區結合，使Nrf2 被錨定于細胞質中，從而抑制其活性[8]。Neh3，Neh4 和Neh5 是反式激活區域，Neh3 區是Nrf2 基因轉錄必不可少的功能區域[9]。Neh4 和Neh5 是存在于Neh1 和Neh2 之間的兩個激活區，可協同促進Nrf2 轉錄，結合RAC3/AIB1/SRC-3，增加Nrf2-ARE 基因表達[10]。Nrf2 進入細胞核與ARE 結合后，需要在Neh4、Neh5 與共激活因子cAMP 反應元件結合蛋白相互作用下，啟動轉錄。Neh6 區是Nrf2 降解調控區域，該區域與Nrf2 的負性調節有關[11]。Nrf2 的缺失或激活障礙，會增加細胞對外界刺激的敏感性，與多種疾病密切相關[10]。

2.3 ARE 的基本結構

ARE 是一種重要的抗氧化應激損傷順式反應元件[12]，位于某些細胞保護基因的上游啟動子區域，編碼許多解毒酶和細胞保護蛋白基因，又稱親電反應元件。ARE 具有典型的活性功能，其核心序列為5’-（G/A）TGA（G/C）nnnGC（G/A）-3’（n 為任意核苷酸）。氧化應激時，Nrf2 與Maf 形成異二聚體，識別并結合到ARE上，從而激活Nrf2-ARE 信號通路[13]。

3 Keap1-Nrf2-ARE 信號通路的調控機制

Keap1 是氧化還原損傷的傳感器，富含半胱氨酸硫醇；而Nrf2 是調節細胞保護基因。Keap1-Nrf2 系統廣泛參與細胞的增殖和分化，在細胞保護等方面起到至關重要的作用[12-13]。

3.1 Nrf2 與Keap1 解偶聯

生理狀態下，Keap1 與Nrf2 相結合，在細胞質內形成Keap1-Nrf2 異二聚體。應激狀態下，其是Keap1的IVR 結構與親電試劑或ROS 起反應的傳感蛋白，同時也是細胞內氧化還原的感應器。ROS 親電子物質通過影響細胞內的氧化還原狀態導致Keap1 的IVR結構域中的半胱氨酸殘基（Cys273、Cys288）被修飾，從而使Keap1 構象改變[14]，失去對Nrf2 負性調節功能，Nrf2 與Keap1 發生解偶聯后，Nrf2 不再被泛素蛋白酶體降解[15]，激活的Nrf2 調控下游靶基因轉錄[16]。

3.2 Nrf2 磷酸化作用

Nrf2 的磷酸化使Nrf2 的degron 結構區域的構象發生改變，阻礙了E3 泛素化連接酶識別degron 結構，激活Nrf2 固有的轉錄活性[17]。研究發現，PKC 可引起Nrf2 的Ser-40 位點磷酸化[18]，同時該種磷酸化修飾還能夠進一步降低Nrf2 與Keap1 的親和力[19]。

3.3 Keap1 介導的泛素化與蛋白酶對Nrf2 的降解減弱機制

研究證實，Keap1 能促進Nrf2 泛素化，而Nrf2 穩定性和活性受蛋白酶調節[20]。Nrf2 通過Neh2 區中的兩個基序：高親和力ETGE 和低親和力DLG 基序與Keap1 直接相互作用。在非脅迫條件下，ETGE 和DLG 基序之間的7 個泛素化靶點賴氨酸殘基被含有Keap1 的E3 泛素連接酶泛素化，隨后通過蛋白酶體途徑降解。Nrf2 的降解減弱還受到亞細胞定位、轉錄后修飾等調控[21-22]。

3.4 門閂和樞紐學說

Keap1 二聚體的兩個DGR 區分別與Nrf2 的DLG、ETGE 兩個基序通過疏水作用和氫鍵相結合，介導降解Nrf2 的泛素化。ROS 刺激后，會從DGR 區解離低親和力的DLG 區，泛素化降解Nrf2。Keap1 的位點處于飽和狀態，在ARE 介導下，促進下游靶基因的表達[15]。

4 Keap1-Nrf2 信號通路與疾病的關系

Nrf2 活性及其調節機制對維持健康至關重要，Keap1-Nrf2 參與了多種疾病的發生和發展[3,23-24]，該通路已成為預防和治療氧化應激相關疾病的一個重要靶點。

4.1 Keap1-Nrf2 信號通路與炎癥的關系

當內源性應激防御機制失衡時，Keap1-Nef2 的信號通路可保護細胞面對氧化損傷。Nrf2 基因經腺病毒傳遞至大鼠心室心肌細胞后，Nrf2 在胞質和核內均有高水平的表達。Nrf2 的過表達增加了幾種依賴于ARE 的抗氧化和細胞保護酶的表達[25]。在炎癥損傷早期，Nrf2-ARE 可能抑制促炎介質的表達[23,26]。芍藥湯通過對Keap1-Nrf2 通路的調控作用，減弱了腸炎癌變小鼠模型[27]。同時，土茯苓對肝纖維化動物的炎癥消減作用也與Keap1-Nrf2 通路相關[28]。因此，通過激活Nrf2-ARE 系統對機體保護炎癥組織損傷起到至關重要的作用[26]。

4.2 Keap1-Nrf2 信號通路與腫瘤的關系

Nrf2 在細胞質中與Keap1 結合，處于穩定狀態，當受到氧化應激或親電試劑刺激時，Nrf2 與Keap1 解偶聯，與ARE 結合并激活下游抗氧化基因轉錄和表達，提高細胞氧化應激及修復功能[29]。通過促進Nrf2 核異位，誘導相關保護蛋白抵抗正常細胞發生惡變的能力[30]。Nrf2 可通過激活抗氧化應激通路保護細胞免受DNA 破壞性侵害，從而抑制腫瘤的發生。一旦通過獲得一個或幾個致癌突變來轉化細胞，則會促進腫瘤的形成。Keap1、Nrf2 和CUL3 基因的突變可破壞Nrf2和Keap1 之間的相互作用，導致腫瘤細胞中Nrf2 信號的本構性激活，具有高水平Nrf2 活性的腫瘤細胞會通過新陳代謝重新編程來促進癌細胞的侵襲性增殖[31]，以及對抗癌治療的抵抗[32-33]。

4.3 Keap1-Nrf2 信號通路與腦缺血的關系

腦是代謝率最高的器官，腦內正常存在抗氧化酶可清除ROS[34]。在腦缺血過程中，腦內生成乳酸，可大量生成ROS，原因如下：①游離Fe2+濃度升高；②O2·-轉化生成過氧化氫的速率提高。再灌注時，線粒體膜電位超極化可增加電子漏發生率，促使ROS 增長[35-37]。另外，再灌注時次黃嘌呤轉變為黃嘌呤，釋放大量電子，生成大量ROS。在CIRI 過程中，由于消耗抗氧化物，腦內清除ROS 的能力下降，引起氧化應激[38]?；罨疜eap1-Nrf2 通路可以清除ROS，保護神經元。

4.4 Keap1-Nrf2 信號通路與糖尿病的關系

糖尿病是一種常見的代謝性疾病。氧化應激的增加可能激活多種應激激酶，如c-Jun 氨基末端激酶通過胰島素受體底物1 的絲氨酸磷酸化，破壞胰島素信號級聯，導致胰島素抵抗。Nrf2 介導的內源性抗氧劑的表達已被認為是機體防御高血糖誘導的糖尿病氧化損傷的重要適應性防御機制[39-40]。

一方面，高糖可誘導線粒體內的電子傳遞呼吸鏈產生大量的超氧化物，造成機體和細胞氧化應激；另一方面，氧化應激損傷可通過活化其敏感性信號通路引起胰島素抵抗[41]。牛磺酸能夠通過誘導Nrf2 核異位，使ROS 生成減少，從而減輕氧化應激誘導的胰島素抵抗[42]。Keap1-Nrf2-ARE 信號通路通過促進Nrf2核異位并與ARE 結合，改善氧化應激誘導的細胞胰島素抵抗。

Nrf2 可保護胰島β 細胞免受各種類型的損傷，包括與氧化劑、有毒化學物質和炎癥相關的損傷。Nrf2信號的激活通過促進AMPK 磷酸化、耗氧量和葡萄糖攝取、抑制糖異生和體重增加來抑制胰島素抵抗的發生。Keap1、Nrf2 因子及Keap1-Nrf2 信號通路在糖尿病的發生、發展過程中可對抗氧化應激，從而保護胰島β 細胞[43]。

5 結語

綜上所述，氧化應激不僅可以引起細胞結構損傷，同時與臨床上許多疾病有一定的相關性。Keap1-Nrf2信號通路能夠激活細胞對各種氧化應激的適應性反應，使細胞通過誘導多種編碼調節下游抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶的表達來抵御有害刺激，平衡細胞內氧化還原狀態，降低氧化應激損傷。多種疾病的發生均與氧化應激損傷有關，Keap1-Nrf2 信號通路在許多疾病中的調控十分精細、復雜。臨床上，替拉格司他通過靶向該通路已經成為治療非小細胞肺癌的新靶向藥；抑制劑Sapanisertib 已獲得FDA 的批注，開展臨床研究。同時也應當注意到，針對該通路的研究主要是基于細胞層面和動物模型層面上，臨床上針對該通路靶點的藥物多數還在臨床試驗委托合同研究驗證階段，走向臨床還需要一段距離。但是我們相信，在不斷發展的生物醫學技術面前，以Keap1-Nrf2 信號通路作為靶點的新一代生物醫藥會為人類的健康帶來福音。