肝纖維化指標與病毒載量、病理炎癥分級及纖維化分期的關系

申可，吳國標，吳彩虹，陳堅平，劉自光

南方醫科大學順德醫院（佛山市順德區第一人民醫院）病理科，廣東佛山 528300

隨著社會經濟的快速發展，人們的生活方式與飲食結構發生巨大變化，這使得各種肝臟疾病的發病率也越來越高，相關的肝臟疾病病理研究也在不斷深入[1]?，F階段的研究顯示，在肝纖維化的診斷上，發現透明質酸（HA）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、板層素（LN）以及Ⅲ型前膠原（PCⅢ）等纖維化指標與肝纖維化存在一定的相關性[2]。為探討各種肝纖維化指標同疾病炎癥程度、病毒含量以及病理纖維化之間的相關性，本次研究納入2015年1月—2021年7月南方醫科大學順德醫院收治的164例肝纖維化患者為研究對象，采集血液并離心分離血清，實施乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）DNA的定量測定，同時還對一部分的病例實施肝細胞活檢檢查，測定相關的肝纖維化指標，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的164例肝纖維化患者進行回顧性分析，其中男112例，女52例；年齡7～83歲，平均（51.12±2.45）歲；慢性肝炎輕度66例，慢性肝炎中度53例，慢性肝炎重度31例，肝硬化14例。遵循自愿原則，根據患者意愿并結合臨床指標排除存在肝組織穿刺活檢禁忌證患者，有84例患者進行肝組織穿刺活檢。針對HBV-DNA含量進行分組，細分為≤1 000、1 000～3 999、4 000～9 999、≥10 000；并根據炎癥活動度及纖維化程度將患者分成1～4級（G）和1～4期（S）。見表1。

表1 慢性肝炎分級、分期標準

1.2 納入與排除標準

納入標準：符合《肝病診療指南》[3]的相關診斷標準者；HBV感染者；病例資料齊全，具備正常溝通、交流能力患者；自愿參加研究并且簽署知情同意書的患者。排除標準：合并心、腎等器質性疾病者；合并惡性腫瘤疾病者；合并血液系統疾病及免疫疾病者；合并精神疾病及認知功能障礙者。

1.3 方法

按照無菌及標準原則，采集所有患者的靜脈血液標本，將采集的血液加入到肝素抗凝管中，以3 000 r/min的速度持續離心15 min分離血清。針對HBV-DNA的檢測，具體應用熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）法測定，具體操作如下：應用PCR熒光探針法檢測血清HBV DNA載量，儀器購自湖南圣湘生物科技有限公司，儀器型號為ABI7500。在各PCR反應管均加入5 μL的核酸釋放劑，同時加入5 μL待檢測的血清樣本，吸打3～5次后充分混勻，間隔時間＞10 min，在2 000 r/min的離心機中持續離心30 s，之后將反應管置于擴增儀中，設定的循環參數如下：50℃2 min，94℃ 5 min，94℃ 15 s，57℃退火、延伸及熒光采集循環45次，之后在25℃下冷卻10 s，借助擴增曲線獲得定量檢測結果。

肝組織活檢則是應用雙人操作經皮肝穿刺法獲取肝組織，經HE染色以及網狀纖維染色判定結果。采取化學發光法測定血清HA、Ⅳ-C、LN以及PCⅢ指標水平，檢測所用的試劑均購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。結果均由資深病理醫師根據雙盲隨機原則按GS分級分期標準進行判讀，統一進行閱片，在光學顯微鏡下對病理情況進行觀察。

1.4 觀察指標

比較不同HBV-DNA含量、不同病理炎癥分級、不同病理纖維化分期患者的血清肝纖維化指標[透明質酸（hyaluronic acid, HA）、Ⅳ型膠原（IV collagen, Ⅳ-C）、板層素（laminin, LN）以及Ⅲ型前膠原（procollagen Ⅲ, PCⅢ）]水平，并分析肝纖維化HBV-DNA含量、病理炎癥分級、肝纖維化分期與血清肝纖維化指標的相關性。

1.5 統計方法

采用SPSS 21.0統計學軟件處理數據，符合正態分布的計量資料以（）表示；相關性分析采用Pearson分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同HBV-DNA含量患者的血清肝纖維化指標水平比較

不同HBV-DNA含量患者血清肝纖維化指標水平對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同HBV-DNA含量患者的血清肝纖維化指標水平比較 [(),μg/L]

表2 不同HBV-DNA含量患者的血清肝纖維化指標水平比較 [(),μg/L]

病毒含量HBV-DNA（+）（n=164）≤1 000（n=47）1 000～3 999（n=52）4 000～9 999（n=30）≥10 000（n=35）HA 161.99±266.23 189.07±281.96 139.51±270.07 153.87±231.77 168.56±276.61Ⅳ-C 114.52±155.43 123.53±185.93 96.61±94.20 114.05±133.31 129.61±200.61 LN 80.63±79.94 65.25±60.10 73.70±69.73 103.03±108.98 90.07±84.09 PCⅢ15.16±10.23 16.73±10.93 14.30±8.58 13.03±8.79 16.26±12.40

2.2 不同病理炎癥分級患者的血清肝纖維化指標水平比較

不同肝纖維化病理炎癥分級患者的HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平對比，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同病理炎癥分級患者的血清肝纖維化指標水平比較 [(),μg/L]

表3 不同病理炎癥分級患者的血清肝纖維化指標水平比較 [(),μg/L]

注：與G1期比較，aP＜0.05；與G2期比較，bP＜0.05；與G3期比較，cP＜0.05；與G4期比較，dP＜0.05

分級G1（n=8）G2（n=32）G3（n=32）G4（n=12）PCⅢ16.97±13.97 13.69±8.68 12.91±5.64（18.53±9.05）c HA 62.16±30.88 52.66±18.72（87.10±54.74）b（321.55±223.09）abcⅣ-C 38.31±16.90 44.63±22.54（70.23±36.61）ab（258.15±152.25）abc LN 29.77±16.27 36.93±22.72（46.26±16.96）a（133.67±55.07）abc

2.3 不同病理纖維化分期患者的血清肝纖維化指標水平比較

不同病理纖維化分期患者的HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平對比，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 不同病理纖維化分期患者的血清肝纖維化指標水平比較 [(),μg/L]

表4 不同病理纖維化分期患者的血清肝纖維化指標水平比較 [(),μg/L]

注：與S1期比較，dP＜0.05；與S2期比較，eP＜0.05；與S3期比較，fP＜0.05；與S4期比較，dP＜0.05

分期S1（n=15）S2（n=38）S3（n=16）S4（n=15）PCⅢ14.31±10.42 13.64±8.46 13.74±6.06 17.82±8.59 HA 58.38±27.56 61.00±31.47（96.45±66.18）de（289.23±220.80）defⅣ-C 49.29±29.22 50.77±29.83（69.70±34.17）d（233.49±154.13）def LN 36.89±26.06 42.17±20.04 39.88±14.66（120.03±62.10）def

2.4 肝纖維化HBV-DNA含量、病理炎癥分級、肝纖維化分期與血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ的Pearson相關性分析

患者病理炎癥分級、肝纖維化分期與血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ呈正相關關系（P＜0.05）；而HBVDNA含量與肝纖維化指標無顯著相關性（P＞0.05）。見表5。

表5 肝纖維化HBV-DNA含量、病理炎癥分級、肝纖維化分期與血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ的Pearson相關性分析

3 討論

HBV感染疾病的自然進程主要分成免疫耐受期、免疫清除期、非活動復制期以及再活動期，在受到HBV感染后，可引起機體免疫功能的降低，并且還會出現免疫調節功能紊亂等情況，這樣使得疾病發生發展[4-6]。處在免疫耐受期時，HBV DNA復制活躍，并且在谷丙轉氨酶（alanine transaminase,ALT）水平上表現正?；蛘呤禽p度升高的態勢，肝組織出現輕微的病理變化以及未見炎癥樣壞死情況[7]。處在免疫清除期時，則可見ALT水平顯著升高，HBV DNA載量降低，肝組織可見炎癥病變。因此對于不同的HBV DNA含量患者，在肝組織上表現出不同炎癥改變情況。

現階段，研究結果顯示，慢性肝炎患者進展到肝硬化需要經歷肝纖維化這一過程[8]。針對肝纖維化可通過相關肝纖維化指標HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ的測定輔助早期診斷[9]。慢性乙肝是HBV感染性疾病，對此類患者，血清HBV-DNA是一種可以輔助反映乙肝病毒感染最為直接以及可靠的指標，主要是HBV在患者體內復制活躍，會激活自身免疫應答，而免疫應答會間接引起肝細胞功能的損傷，對此進行此類指標的測定具有積極意義。

本研究結果顯示肝纖維化患者血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ同HBV-DNA的含量無明顯相關性（P＞0.05），這一結果提示，肝硬化的發生發展過程，侵入機體的乙肝病毒數量以及復制能力同病變無明顯關聯。而對84例患者進行肝組織病理活檢，判定患者病理炎癥分級及纖維化分期，應用到GS分級評價方式，GS分級是根據病理活檢的組織切片進行診斷分級分期的，G是炎癥程度分級，S為纖維化程度分期。本研究結果顯示，根據不同肝纖維化病理炎癥分級，不同病理纖維化分期患者的HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平對比，差異有統計學意義（P＜0.05），提示肝纖維化指標可以用于評價慢性乙肝炎癥程度及病理纖維化情況。本次研究結果顯示，肝 硬 化 者 HA 為（289.23±220.80）μg/L、IV-C 為（233.49±154.13）μg/L、LN 為（120.03±62.10）μg/L、PCⅢ為（17.82±8.59）μg/L，與其他分期肝纖維化指標水平對比，差異有統計學意義（P＜0.05）；張晶[10]的研究顯示，肝硬化者HA為（148.45±61.21）ng/mL、PCⅢ為（141.26±47.02）μg/L，LM、HA、PCⅢ指標隨著患者肝纖維化程度加重和炎癥活動度加重而呈現升高趨勢，這一結果與本研究結果類似。對于慢性乙肝患者，在臨床診斷上，可以加強對相關生化指標的測定。在具體測定上，HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ可以反映出肝纖維化的情況，其中HA屬于一種酸性黏多糖，1934年首次從牛眼玻璃體中分離出這一物質，該物質有獨特分子結構以及理化特性，這樣使得其具有多種生理功能，比如潤滑關節及調節血管壁的通透性，使水電解質擴散及運轉，促進創傷的愈合[11-12]。Ⅳ-C屬于基底網狀結構重要組成成分，在細胞內合成能直接以前膠原的形式參與細胞外間質組成，在肝臟纖維化的時候早期可見其增生，轉換快，之后以持續沉積的層粘連蛋白構成完整基底膜。LN是構成細胞間質的非膠原糖，在肝內主要是由內皮細胞以及貯脂細胞合成，可同膠原一同構成基底膜成分，主要作用是同多種基底膜成分進行結合，調節細胞的生長以及細胞的分化[13-15]。PCⅢ主要是可反映出肝內Ⅲ型膠原的合成，PCⅢ水平的持續升高可表現出病情的持續性變化，而PCⅢ下降甚至正?？深A示病情的緩解，如此也表明PCⅢ用于評估纖維化有重要意義，且能輔助醫師判定疾病嚴重程度，指導對疾病的合理治療，最大限度的保證患者生命健康[16]。本次研究也進行相關性分析，顯示病毒載量同肝纖維化指標無顯著相關性（P＞0.05），而疾病病理炎癥分級及纖維化分期與肝纖維化指標呈正相關（P＜0.05），表明測定肝纖維化指標可評估疾病病理分期及分級情況，從而為疾病的治療提供一定參考借鑒。

綜上所述，針對慢性乙肝及肝硬化，在病變的發展期間，通過測定肝纖維化HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ相關指標，可以預測疾病病理炎癥分級及纖維化分期情況，輔助對疾病的有效治療。