Ku蛋白質在急、慢性骨髓系白血病的表達及其意義

王蘇亮，包曉琳，魏金龍，曲穎，曲延章

齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院血液風濕內科四病區，黑龍江齊齊哈爾 161000

急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia,AML)、急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)和慢性骨髓系白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)屬于惡性腫瘤，目前的救治措施除了骨髓移植外，各種放化療治療方案并不具有十分有效的效果[1-2]。治療血液惡性腫瘤最常見且最困難的問題就是治療失敗，原因有很多，但最主要的是治療方法與藥物無法有殺死將癌細胞。許多研究都希望能解決或改善這種情形，以提高白血病的治愈率[3-4]。Ku蛋白質能夠保護DNA雙鏈，調控細胞周期。Ku蛋白缺乏會產生多種腫瘤；Ku蛋白活性改變，能夠增強腫瘤放化療敏感性。但急慢性白血病的Ku蛋白表達以及與抗白血病治療之間的關系尚鮮見報道[5-7]。本研究選取2020年3月—2021年3月齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院門診及住院治療的35例急性白血患者，對照組選取12名健康人，CML患者6例。分析35例急性白血病患者的臨床資料，探討Ku蛋白在AML、ALL與CML患者中的表達，并揭示Ku蛋白與白血病治療效果之間的關系，將對急慢性白血病的診斷及治療提供有利的實際應用價值。采用有針對性的個性化治療方案，提高患者的生存質量。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集35例急性白血病患者周邊血液與骨髓穿刺液，其中AML19例，成人17例，兒童2例；16例ALL，成人10例，兒童6例。另外，篩選BCR-ABL(+)CML患者6例。對照組為12名正常人的周邊血或骨髓穿刺液。所有參與項目的受試者采血和骨髓穿刺液都通過醫學倫理委員會的審議并獲得患者的知情同意。

1.2 細胞系收集

K562、HL-60、NB4人類急、慢性骨髓系白血病細胞購買自美國ATCC公司，本實驗室具有保存的細胞株。

1.3 方法

（1）將獲取的急慢性白血病患者外周血、骨髓穿刺液樣本，分別在入院時，利用實時定量PCR、流式細胞術鑒定Ku蛋白的基因表達；通過ELISA方法和Western blotting方法檢測急慢性白血病中Ku蛋白的表達定位以及表達含量情況。

（2）利用P65質粒，向K562、HL-60、NB4細胞內轉染Ku基因，利用流式細胞術、Western blotting、ELISA進行檢測轉染的Ku蛋白表達情況[8]。MTT實驗檢測轉染前后3種細胞的增殖變化情況；Western blotting、ELISA等實驗觀察轉染Ku基因前后的3種白血病細胞的凋亡、自噬等變化；細胞遷移實驗檢測急慢性白血病細胞的遷移變化。

（3）實時定量PCR的關鍵參數如下。

①Ku蛋白引物序列。正義：5’TGT CAG GGT GGG AGT CAT ATT AC；反義 ： 5’ TCG TTT TGC ACC TGG ATT ATC C。

②反應條件。10×緩沖液3.0 μl，1.5 mM氯化鎂1.8 μl，0.25 mM dNTP 濃度 3.0 μl，0.2 μM 正義引物0.3 μl，0.2 μM反義引物0.3 μl，5 U/mL AmpliTag Gold 0.3 μl，dd H2O19.3 μl，cDNA2.0 μl。

③PCR條件。96℃，9 min（96℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min）×40 cycles；72℃,10 s；保持4℃。

（4）Western blotting：急性白血病患者周邊血液與骨髓穿刺液、6×105K562、HL-60、NB4人類急、慢性骨髓系白血病細胞，根據實驗設計原理和方法，添加不同環境和不同藥物或不容干擾條件，再將細胞培養12 h。培養足夠合格的細胞中加入100 μl蛋白裂解液，完成細胞總蛋白的提取。每孔電泳槽中加入蛋白量約60 μg，250 mA電量轉膜2 h。PVDF膜置入TBS-T緩沖液中完成漂洗后，再封閉液中放入脫脂奶粉，室溫下振蕩1 h。PVDF膜放入1∶200稀釋的小鼠抗人Caspase 8、Ku、LC3蛋白抗體中，4℃過夜后，TBS-T液洗膜3次，添加1∶2 000稀釋羊抗小鼠IgG的HRP標記，ECL試劑混均后，完成實驗操作，觀察成像結果。

（5）Annexin V-FITC 細胞凋亡實驗：細胞凋亡試劑盒本實驗采用 Annexin V-FITC試劑盒完成檢測。將K562、HL-60、NB4人類急、慢性骨髓系白血病細胞5×105個，分別按要求種于6孔細胞培養板中，37℃，5%CO2培養12 h，根據本實驗設計好的分組情況，繼續培養6 h后，收集各個組的培養細胞，以0.01 mmol/L PBS緩沖液沖洗細胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化細胞2 min，消化細胞和細胞上清液放入4℃箱內，l 200 rpm，離心5 min后，再將上層的上清液去掉后，以100 μl PBS緩沖液充分混懸，然后加入 5 μl Annexin Ⅴ-FITC 與 2 μl碘丙啶（propidium iodine, PI），室溫避光靜置15 min后，加入400 μl PBS緩沖液后，即檢測細胞凋亡率（%）以FACSAria Ⅱ流式細胞分選儀完成。

（6）MTT細胞增殖實驗：在96孔細胞培養板中培養1×104cells/well細胞。按照實驗分組情況，分別添加100 ng/mL米托司汀、2 μmol/L SB203580，在缺氧環境下培養12 h后，加入10 mL, 5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h，使用Emax 50酶標儀，震蕩15 s，在490 nm波長檢測細胞增殖的吸光度值（OD值）。

2 結果

將收治的35例急性白血病患者，實驗分組比較結果。進行Western blotting分析Ku70，Ku80的表達，分析了AML和ALL的關聯性。正常對照組其中2名的Ku70與Ku80蛋白質表現，量均低至無法偵測；但卻表現出另一約86 kDa大小的蛋白質，見圖1。在AML與ALL檢查，Ku70與Ku80蛋白質表現量上升情形，亦表現出另一約69 kDa大小的蛋白質，見圖2、圖3。Ku70與Ku80在所有急性白血病患者，AML、ALL患者的表現情形及相關性，差異有統計學意義（P=0.001、0.036、0.046），見圖 4、圖5、圖6。

圖1 Western blotting檢測正常對照組的Ku70和Ku 80

圖2 Western blotting檢測AML組的Ku70和Ku 80

圖3 Western blotting檢測ALL組的Ku70和Ku 80

圖4 急性白血病中Ku蛋白的相對表達

圖5 AML白血病中Ku蛋白的相對表達

圖6 ALL白血病中Ku蛋白的相對表達

3 討論

白血病為惡性腫瘤中的一種，而腫瘤是密切相關的一系列基因突變引起的健康機體內細胞不能正常代謝，細胞的分化、生長和凋亡出現紊亂現象而導致的疾病。多基因紊亂性疾病是由于一系列的基因改變導致不能控制細胞生長、細胞分化、細胞凋亡的多基因紊亂性疾病。DNA修復機制和端粒結構維持機體基因組的穩定在抑制腫瘤的發生和發展方面起重要作用，在染色體結構中Ku蛋白扮演至關重要的作用，同樣Ku蛋白也維持端粒結構的穩定性，因此，以往學者認為Ku蛋白可能是一個腫瘤的抑癌基因[9-10]。此外，由于Ku蛋白在DNA修復中起到核心作用，腫瘤細胞自身也具備修復、分化、增生能力，對治療產生拮抗作用，增加治療難點。腫瘤的發生和進展與DNA修復和端粒結構的穩定性方面存在密切關系，在維持染色體結構穩定中Ku蛋白起到關鍵性作用，故此研究者認為Ku蛋白可能為腫瘤抑制蛋白[11-12]。Ku蛋白質為多功能蛋白質，亦是多種基因家族的重要成員，近來有關于Ku蛋白質與DNA形成的復合物與細胞株、癌癥相關性的報導，但是Ku蛋白與染色體、DNA等細胞結構的關系與急慢性白血病發病機制的關系還不清楚，通過調控Ku蛋白活性而控制急慢性白血病診斷和治療，需進一步研究探索[13-14]。

研究顯示這種多發性骨髓瘤中Ku蛋白降低了與DNA末端的結合能力，不能結合和激活DNA，該項目結果還發現Ku蛋白自身活性降低，對放射線、博來霉素、絲裂霉素的敏感性較正常Ku86的多發性骨髓瘤或正常骨髓細胞高[15]。大量研究專家和學者發現通過各種方法抑制Ku80蛋白和Ku70蛋白來增加腫瘤細胞敏感性，使腫瘤細胞放化療的特異性和靶向基因治療的效果得到提高[16]。Ku蛋白即為DNA修復蛋白，在修復DNA過程中發揮不可或缺的重要作用[17]，Ku蛋白活性減弱和缺失不足都與腫瘤進展關系十分密切；另外，腫瘤對放化療反應機制中腫瘤細胞Ku蛋白活性的改變具有重要意義[18]。本研究通過Western blotting分析Ku70，Ku80的表達，分析了AML和ALL的關聯性。Ku70與Ku80在所有急性白血病患者，AML、ALL患者的表現情形及相關性，差異有統計學意義（P=0.001、0.036、0.046）。陳沛帥等[19]Western Blot印跡法檢測Ku70、Ku80蛋白的表達，Ku70與Ku80在所有急性白血病患者，AML、ALL患者的表現情形及相關性，差異有統計學意義（P=0.002、0.001、0.001）。本研究結果與陳沛帥的研究結論具有一致性，以此證實為延緩慢性白血病的發生、維護染色體結構完整性、防治染色體損傷而提供科學依據，為防治阻止DNA突變提供切實可行的分子診斷手段；同時對擴展急慢性白血病的放化療治療方案，制訂個體化治療措施具有重要意義。最近幾年，隨著對白血病患病中Ku蛋白各種功能及其腫瘤作用機制的不斷研究，有理由相信高效地抑制白血病細胞中Ku蛋白的活性，可為個體化抗白血病治療的新靶點提供可靠證據。