心臟死亡大鼠雙腎移植模型的建立

鄧妙文 金鐘大

目前治療終末期腎臟病的最佳方案是行腎移植手術，供腎的短缺是制約其發展的一個重要因素，而心臟死亡器官捐獻是擴展供腎來源的重要途徑。為研究心臟死亡后移植腎的功能恢復情況，建立心臟死亡后腎移植動物模型具有現實意義。臨床腎移植左、右腎都可以作為供腎，筆者在前期研究基礎上采用內撐法間斷吻合腎靜脈及用改進的套袖法吻合腎動脈，現進一步探索心臟死亡后大鼠雙側供腎移植方法。

材料與方法

1.實驗動物：供、受體大鼠均為北京維通利華實驗動物技術有限公司提供的雄性近交系Wistar大鼠，體質量約為200～250g，大鼠的飼養及腎移植手術均于廣州中醫藥大學實驗動物中心進行,動物實驗方案經廣州中醫藥大學動物倫理委員會批準(倫理審批號：TCM1087512)。大鼠術前禁食8～10h，可自由飲水。

2.實驗設計與分組：將120只雄性近交系Wistar大鼠隨機分為4組，每組30只(供體10只，受體20只)，實驗組分為0min組、20min組和40min組，分別于供鼠心跳停止后0、20和40min獲取其雙腎作為供腎，腎移植時用內撐法間斷吻合腎靜脈，腎動脈的吻合采用改進原位套袖吻合法，對照組為供鼠心跳停止后0min后取雙側供腎，采用傳統的端對端間斷縫合技術進行吻合[1，2]。0min組的左側供腎為1組，右側供腎為2組。行左側原位腎移植完畢后，即刻切除受體右腎。觀察各組受體大鼠術后移植腎的功能恢復情況和生存率。

3.實驗步驟：(1)供腎的切取：手術在10倍顯微鏡下進行。供體大鼠腹腔麻醉固定，取腹部正中切口入腹腔并用拉鉤盡可能大的暴露視野，游離靠近腹主動脈和下腔靜脈的雙側腎動、靜脈，將左腎動、靜脈根部上下兩側的腹主動脈和下腔靜脈各分離10mm，以便從腹主動脈進行穿刺灌洗。左右輸尿管中上段周圍的脂肪組織和結締組織進行銳性分離，并于離腎門10mm平腎下極處剪斷雙側輸尿管。完全游離雙側腎動、靜脈及輸尿管后分離左右腎，并進行肝素化。剪開膈肌，用血管鉗夾閉心臟基底部致心臟停止搏動，并阻斷胸主動脈，確定心臟停止搏動后按照各組熱缺血時間進行計時。各組熱缺血時間達到后，分別用血管夾阻斷腎動、靜脈水平上、下的腹主動脈和下腔靜脈，剪斷靠近下腔靜脈處的左腎靜脈根部，在腹主動脈阻斷部分的遠端用肝素生理鹽水對雙腎進行低壓勻速灌洗直至雙腎變成黃白色。在雙腎周圍放置冰塊，在低溫下灌洗5min后，靠近腹主動脈處剪斷左右腎動脈根部，右腎靜脈上部的下腔靜脈結扎剪斷，其下部的下腔靜脈在長約2mm處剪斷以備與受體腎靜脈吻合。在4℃ 0.9%氯化鈉溶液中保存取出的雙側供腎。(2)受體腎移植：左側供腎與右側供腎的移植由雙人同時進行。受鼠麻醉固定后打開腹腔，以上述方法分離受者的左腎動、靜脈，在靠近腹主動脈處阻斷腎動脈血流，為便于腎動、靜脈的吻合需保留較長的腎動、靜脈。適當游離輸尿管周圍的組織后剪斷輸尿管，并在腎包膜下切除左腎。供腎用紗布包繞，將冰屑置于供腎周圍保持低溫。供體左腎行左側原位腎移植，右腎翻轉后移植到受體左側，實驗組腎靜脈采用內撐間斷吻合法，腎動脈的血管重建采用改進原位套袖法，對照組用傳統的端對端間斷縫合法[1，2]。血管重建完畢后，去掉包繞著供腎的紗塊，在供腎腎門處阻斷血流。依次開放腎靜脈及腎動脈的血管夾，供腎血流開放后即見腎臟充血，移植腎顏色逐漸變為均勻粉紅色，腎靜脈充盈，腎動脈搏動明顯。從陰莖靜脈靜脈注射3ml 0.9%氯化鈉注射液，可見輸尿管口流出清亮尿液。輸尿管的吻合采用端端吻合法，用10.0縫線間斷縫合6針，并固定移植腎的上下極。切除受體右腎并關腹。在受者恢復清醒后放入籠內正常飼養。

4.觀察指標：術中記錄各組腎動、靜脈的吻合時間，記錄移植腎的冷缺血時間(從灌注到血流開放的時間)。觀察各組受鼠腎移植術后的飲食、活動及并發癥情況，并記錄死亡時間。術后第3、5和7天從尾靜脈采集血樣，評估血清肌酐水平和血尿素氮水平。實驗結束后，對所有動物實施頸椎脫臼安樂死。

結 果

實施移植手術120例(供體40只，受體80只)。術后各組大鼠手術時間及存活率如表1所示，0min組、20min組和40min組之間的腎動、靜脈吻合時間及冷缺血時間比較，差異無統計學意義，而對照組較0min組長。40min組的大鼠均于14天后死亡，其存活率與0min組及20min組之間比較，差異有統計學意義(P<0.05)；0min組與對照組大鼠存活率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組手術時間、術后并發癥及存活率

各組術后肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)檢測結果如表2所示，所有組在腎移植后3、5和7天血肌酐和血尿素氮水平均升高，與0min組及20min組比較，40min組明顯升高。0min組與對照組的血肌酐和血尿素氮水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組血肌酐及血尿素氮的檢測結果

0min組中的左側供腎為1組，右側供腎為2組，雙側供腎為同時取腎，雙人同時進行腎移植。1組和2組大鼠的存活率及腎移植術后的血肌酐、血尿素氮水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，詳見表3、表4。

表3 1組與2組手術時間、術后并發癥及存活率

表4 1組與2組血肌酐及血尿素氮的檢測結果

討 論

目前治療終末期腎臟病的最佳方案是行腎移植手術，可有效提高患者的生活質量，延長患者的生存時間。現在等待腎源的患者逐漸增多，為縮小腎移植目前供需關系之間的差距，逐漸開發利用許多邊緣供腎如心死亡或腦死亡的供腎。與活體或腦死亡供腎比較，移植腎無功能和移植腎功能延遲的情況因心死亡供腎遭受更嚴重的熱缺血損傷而更廣泛存在。心死亡所致的無氧葡萄糖代謝增加導致了乳酸形成，細胞內溶酶體酶的腔內釋放顯著增加，這是術后移植腎無功能或延遲恢復腎功能的主要原因，這也恰恰縮短了移植腎的存活時間[3]。腎臟病理的改變也隨著缺血時間的增加而增加[4]，其中一個重要的病理改變與腎小管的損傷有關，熱缺血時間的長短與腎小管損傷的預后呈正相關[5]。熱缺血損傷的時間短，則腎小管呈現輕度水腫，僅有少量炎性細胞浸潤，存活的腎小管上皮細胞通過細胞周期可以恢復細胞功能；而當熱缺血時間延長時，腎小管上皮細胞的損傷、壞死超過了修復上限，則出現間質纖維增生[6，7]。另一原因可能與腎小管上皮細胞發生細胞凋亡有關, 腎小管上皮凋亡細胞的數量隨著缺血時間的延長而增加[8]。一般來講，當供腎熱缺血時間超過40min時，受鼠的移植腎纖維化程度高，受鼠的存活率低[9]。本研究發現移植腎熱缺血時間為40min時受體大鼠均于14天內死亡，40min組術后肌酐和尿素氮水平較0min組及20min組明顯升高，這表明供腎熱缺血時間大于40min的供腎不宜使用。

為研究心死亡供腎的安全熱缺血時限，建立穩定的、成功率高的大鼠腎移植模型十分必要。既往有許多文獻運用了不同的方法建立心臟死亡大鼠模型，如安樂死、用過量的異氟烷或者打開胸腔通過心臟外部壓迫(填塞)誘導心臟驟停等[10～12]。筆者團隊游離左、右腎后，直接剪開膈肌打開胸腔，用血管鉗夾閉心臟基底部致使心臟停搏，此法方便快捷，且更容易控制熱缺血時間，保證雙側供腎同時缺血。

在以往的大鼠腎移植模型中用左側或右側單側供腎研究較多，近年來雙側供腎移植因節省供體而多采用。Yin等[13]采用雙腎供體，供體下腔靜脈和腹主動脈與受體下腔靜脈和腹主動脈分別行端側吻合。馮寧翰等[14]的供體腎動脈與受體腹主動脈行端側吻合，供體腎靜脈與受體腎靜脈行端端吻合，尿道重建采用膀胱補片法。然而以上技術均不同程度阻斷腹主動脈和下腔靜脈血流，受體缺血再灌注后血流動力學變化較大，易形成血栓。供體膀胱瓣與受體膀胱吻合，腹部切口較大，影響術后恢復。

本研究中實驗組大鼠腎動脈的吻合采用筆者前期研究的改進套袖法，將受者的腎動脈套入經顯微鑷少許擴張后的供腎動脈腔內，用顯微鑷幫助第1針穿過外膜進入動脈內腔，然后從動脈末端取出針，較之更方便，易于操作[1]。雖然筆者的技術可能對供體動脈內膜造成損傷，但受損內膜與受體動脈的外膜接觸，對腎血流量影響不大。實驗組腎靜脈采用以前使用的內撐法間斷吻合，該方法具有兩端對合好，針距易于控制，吻合整齊、內膜外翻，符合血流動力學的要求等優點，血管吻合后不易發生血栓形成及漏血和狹窄[2]。對照組腎動脈、腎靜脈均采用傳統的端端吻合法，與對照組比較，實驗組的腎動、靜脈吻合時間及冷缺血時間明顯縮短。且本研究取雙側供腎后雙人同時進行腎移植，0min組中的左側供腎(1組)及右側供腎(2組)術后肌酐、尿素氮及存活率差異均無統計學意義，這表明此種方法兩個移植腎術后腎功能無明顯區別，可節省供體。

本研究的創新點在于描述了一種心臟死亡后大鼠雙側供腎移植的模型，采用心臟死亡后的大鼠雙腎作為供腎，分別進行左側原位腎移植，采用改進的套袖法進行腎動脈吻合，內撐法間斷吻合腎靜脈, 手術時間短，可有效減少供腎的冷缺血時間，成功率高，無需其他特殊器械，且可以減少在建立心死亡大鼠腎移植模型中的供體消耗，有利于心臟死亡供體腎移植實驗研究，為研究供腎熱缺血安全時限提供實驗基礎。